Титульный лист и исполнители
РЕФЕРАТ
Отчет 88 с., 13 табл., 52 рис., 18 источн., 3 прил.
ЛЕЙКОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА, УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОТИВОЛЕЙКОЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ, СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА, РИД (РЕАКЦИЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ), ПЦР (ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ).
В отчете представлены результаты исследований, выполненных в рамках технического задания НИР МСХ РФ «Разработка ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота с целью усовершенствования системы оздоровления».
Объект исследования – крупный рогатый скот молочного направления, инфицированные и больные лейкозом крупного рогатого скота животные молочного стада.
Цель работы — разработка ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота с целью усовершенствования системы оздоровления.
Методы исследований – эпизоотологический, серологический (реакция иммунодиффузии), гематологический и молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция) методы исследований.
Методология проведения работы — методика усовершенствованной постановки РИД: отличается от стандартной методики тем, что серологические исследования проводятся не каждые 6 месяцев, а через каждые 2-3 месяца. На этапе пробоподготовки испытуемые сыворотки подвергаются дополнительному центрифугированию, с целью концентрирования противолейкозных антител в испытуемом материале. Реакция иммунодиффузии проходит в условиях термостата с визуализацией полученных результатов через 24-48 часов.
Использование разработанной методики ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота, заключающейся в уменьшении кратности проведения серологических исследований и усовершенствования реакции иммунодиффузии, что позволяет повысить выявляемость в РИД инфицированных животных и усовершенствовать систему противоэпизоотических мероприятий.
Применение предлагаемого способа ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет выявлять инфицированных лейкозом животных на более ранних стадиях развития лейкозного процесса, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, что позволяет сократить время их нахождения в стаде. Это способствует ускорению проведения оздоровительных противолейкозных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.
Результаты НИР могут быть использованы для борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в стационарно неблагополучных по этой инфекции МТФ, а также в системе общих противоэпизоотических мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота, которые позволят в более короткие сроки оздоровить хозяйство.
В будущем результаты данных НИР могут быть положены в систему противолейкозных мероприятий с целью усовершенствования борьбы с лейкозом крупного рогатого скота.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
В настоящем отчете о НИР применяют следующие определения, обозначения и сокращения:
Лейкозы – системные поражения кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированные формы.
Реакция иммунодиффузии (РИД) – серологический метод исследования животных на наличие лейкоза крупного рогатого скота. Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител а антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота.
ВЛКРС – вирус лейкоза крупного рогатого скота
КРС – крупный рогатый скот
МТФ – молочно-товарные фермы
НИР — научно-исследовательская работа
РИД – реакция иммунодиффузии
ПЦР – полимеразная цепная реакция
BLV -Bovine leukemia virus- вирус лейкоза крупного рогатого скота
EBL -Enzootic bovine leukosis – энзоотический лейкоз крупного
рогатого скота.
ВВЕДЕНИЕ
Вирусные инфекционные заболевания животных продолжают занимать доминирующее положение в системы противоэпизоотических мероприятий, проводимых на животноводческих сельскохозяйственных предприятиях Белгородской области. Одним из самых актуальных заболеваний при этом является лейкоз крупного рогатого скота (EBL) как в Белгородской области, так и в большинстве стан мире, вызывая высокий уровень инфицированности поголовья скота и связанные с этим экономические затраты на проведение противоэпизоотических мероприятий. Довольно позднее выявление инфицированности животных, несмотря на использование современных диагностических тестов, способствует широкому распространению лейкоза крупного рогатого скота [1, 2].
Современные требования к оздоровлению от лейкоза крупного рогатого скота требуют раннего выявления инфицированных вирусом животных, находящихся в начальных стадиях развития инкубационного периода. Пути решения этой проблемы требуют разработки новых возможностей в диагностике и профилактике вирусных инфекционных заболеваний животных в системе противоэпизоотических мероприятий.
Эффективность выявления заболевших животных на более ранних этапах развития инкубационного периода при медленно протекающих инфекциях является залогом формирования устойчивого благополучия по лейкозу крупного рогатого скота.
Исполнитель НИР: Белгородский государственный аграрный университет им. В. Я. Горина.
Срок выполнения работы НИР: начало — январь 2020г.; окончание – декабрь 2020г.
Цель и задачи проводимых исследований — разработка ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота с целью усовершенствования системы оздоровления.
Для достижения указанных целей предполагается решить следующие задачи:
1. Провести эпизоотологические мониторинговые исследования на предмет инфицирования вирусом лейкоза крупного рогатого скота в молочно-товарных хозяйствах Белгородской области.
Ответственные: Коваленко А.М., Оскольская В.Ю.
2. Изучить уровень заболеваемости лейкозом крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах Белгородской области.
Ответственные: Капустин Р.Ф., Ткачев А.В.
3. Изучить возможность ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении оздоровительных мероприятий. Ответственные: Явников Н.В., Беляева С.Н.
4. Отработать поэтапное выявления больных лейкозом животных с применением более раннего выявления инфицированных особей для усовершенствования системы оздоровления в отдельно взятом хозяйстве ООО «Победа».
Ответственные: Коваленко А.М., Мерзленко Р.А.
Объект и предмет исследования
Объект исследования – крупный рогатый скот молочного направления, инфицированные и больные лейкозом крупного рогатого скота животные молочного стада.
Предмет исследования – эпизоотический скрининг по лейкозу крупного рогатого скота и создание методики ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Вирусные инфекционные заболевания животных наносят значительный экономический ущерб скотоводству, а лейкоз крупного рогатого скота, являясь наиболее актуальным заболеванием, вызывает в большинстве стран мира высокий уровень инфицированности поголовья. Довольно позднее выявление инфицированности животных, несмотря на использование современных диагностических тестов, способствует широкому распространению лейкоза крупного рогатого скота [1, 2].
Лейкоз крупного рогатого скота (EBL), вызываемый В-лимфотропным вирусом лейкоза (ВЛКРС), относящийся к РНК-содержащим вирусам семейства Retroviridae, рода Deltaretrovirus, является медленно протекающим хроническим инфекционным заболеванием опухолевой природы [3, 4, 5].
Эффективное выявление инфицированных животных на более ранних этапах развития инкубационного периода при медленно протекающих инфекциях является залогом формирования устойчивого благополучия по лейкозу крупного рогатого скота. Лейкоз до настоящего времени является одним из наиболее экономически значимых заболеваний, наносящих значительный ущерб развитию молочного и мясного скотоводства [6, 7, 10].
Для улучшения эпизоотической ситуации по лейкозу КРС в неблагополучных хозяйствах стран ЕС, США и Японии разработаны национальные программы по оздоровлению от этой инфекции с использованием передовых технологий [11, 12, 13].
Ведущие лейкозоологи указывают на процесс распространения и стационарного неблагополучия по лейкозу крупного рогатого скота, на постоянное выявление антропогенных факторов, одним из которых является техногенное загрязнение, напрямую влияющее на состояние иммунной системы животных [14, 15].
Существенно ускорился процесс эффективного оздоровления
поголовья крупного рогатого скота от лейкоза благодаря использованию разработанных серологических диагностических тест-систем [16]. Базовыми серологическими тестами для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота является реакция иммунной диффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА), где используется в качестве испытуемого клинического материала — сыворотки крови и молоко, с последующим применением гематологического теста [17].
В Европейских государствах с 1988 года прописано применение РИД и ИФА для выявления инфицированных лейкозом крупного рогатого скота. Кроме того, в последние годы все шире используется метод молекулярно-генетического анализа (ПЦР) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Высокая специфичность такого метода достигается благодаря детекции фрагмента провирусной ДНК вируса лейкоза. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов. Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаружить единичные фрагменты вирусных нуклеиновых кислот [18].
В настоящее время изучено влияние колострального иммунитета на серологические диагностические исследования молодняка крупного рогатого скота, которое обуславливает появление ложноположительных результатов. Учитывая этот феномен, с 15-дневного возраста телят исследуют с использованием метода ПЦР-диагностики.
Сложная эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Российской Федерации, в том числе и в молочно-товарных предприятиях Белгородской, Тюменской, Челябинской, Курганской областей и Республики Башкортостан послужила началом исследований по раннему выявлению инфицированных животных в неблагополучных хозяйствах с целью повышения успешности проводимых оздоровительных противолейкозных мероприятий.
2 РЕЗУЛЬТАТЫ НИР
2.1 Материал и методика исследований
Методика исследований
Работа выполнялась на базе ФГБОУ ВО «Белгородский государственный аграрный университет имени В.Я. Горина» (испытательная лаборатория, лаборатория по изучению инфекционных и инвазионных болезней и апробации ветеринарных препаратов); Шебекинской межрайонной ветеринарной лаборатории; с использованием данных Белгородского управления ветеринарии по эпизоотическому состоянию в неблагополучных по лейкозу молочно-товарных хозяйствах Белгородской области – ООО «ММФ Нежеголь» и АО «Орлик» с. Воскресеновка Чернянского района; ЗАО «Восход» и ООО «Победа» Шебекинского района.
Методы исследований – эпизоотологический, серологический (реакция иммунодиффузии) гематологический и молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция) методы исследований.
Методология проведения работы – Методика усовершенствованной постановки РИД: отличается от стандартной методики тем, что на этапе пробоподготовки испытуемые сыворотки подвергаются дополнительному центрифугированию, с целью концентрирования противолейкозных антител в испытуемом материале. Реакция иммунодиффузии проходит в условиях термостата при температуре 37ºС, а визуализацию полученных результатов проводят через 24-48 часов.
Материал для исследований
Материалом для исследований были эпизоотологические данные по распространенности лейкоза крупного рогатого скота, а также сыворотки крови и стабилизированная кровь от крупного рогатого скота в молочно-товарных хозяйствах благополучных и неблагополучных хозяйствах по лейкозу крупного рогатого скота. Отбор проб крови проводился одноразовыми инструментами в стерильные пробирки из подхвостовой вены для получения сыворотки крови для исследований в реакции иммунодиффузии, а также стабилизированной крови для исследований гематологическим методом и полимеразной цепной реакции.
Исследования проводили согласно методикам:
1. Методика эпизоотологического обследования поголовья крупного рогатого скота (Приказ Минсельхозпрода РФ от 11.05.1999 N 359 «Об утверждении правил по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота» (Зарегистрировано в Минюсте РФ 04.06.1999 N 1799).
2. Методика проведения гематологических, серологических исследований и молекулярно-биологические методов. (Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утверждённые руководителем Департамента Ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В. Кравчук 23.08.2000 г. N 13-7-2/2130).
3. Визуализацию гематологических показателей на предметном стекле после окраске по Лейшману осуществляли на микроскопе Labor microscopes, 60×/0,75 со встроенной камерой. Подсчет лейкоцитов в камере Горяева согласно методике Кондрахина И.П. (Приложение А, рис. 23- 24).
4. Гематологические исследования крови животных проводили на автоматическом гематологическом анализаторе URIT-3020 (Китай) согласно инструкции по работе с данным прибором (Приложение А, рис. 25-26).
2.2 Проведение эпизоотологических мониторинговых исследований на предмет инфицирования вирусом лейкоза крупного рогатого скота в молочно-товарных хозяйствах Белгородской области.
Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота на протяжении последних нескольких лет остается неизменной в РФ. Так, наиболее инфицированным BLV поголовье крупного рогатого скота находится в Центральном федеральном округе и составляет более 41%. (рис.1).
Рисунок 1 – Изучение эпизоотической ситуации
по лейкозу крупного рогатого скота в РФ
Проведенные ретроспективные и проспективные мониторинговые эпизоотологические исследования по изучению эпизоотической ситуации по BLV инфекции в молочно-товарных хозяйствах Белгородской области показали, что до начала проведения плана оздоровления по лейкозу крупного рогатого скота ситуация оставалась напряженной.
Необходимо отметить, что в большинстве хозяйств, относящимся к большим холдингам уровень инфицированности лейкозом крупного рогатого скота значительно ниже по сравнению с молочно-товарными хозяйствами, содержащими аборигенный скот длительное количество лактаций. Это связано в первую очередь с тем, что в молочно-товарных холдингах животные эксплуатируются незначительное количество лактаций, в среднем от 2 до 4.
На начало текущего года в молочно-товарных хозяйствах Белгородской области стационарно неблагополучными по лейкозу крупного рогатого скота являлись в основном хозяйства Шебекинского и Чернянских районов области, в которых насчитывалось значительное количество РИД (+) животных – до 85%.
Использовали эпизоотологический метод исследования с применением усовершенствованной методики раннего выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных и результаты ретроспективных и проспективных эпизоотологических и серологических исследований. В основу методики раннего выявления лейкозных животных в неблагополучных хозяйствах заложено сокращение периодичности проведения исследования в два раза и увеличение концентрации антител к ВЛ КРС в исследуемых образцах сывороток крови.
На начало текущего года в Белгородской области стационарно неблагополучными по лейкозу крупного рогатого скота было всего лишь четыре хозяйства с уровнем инфицированности от 31,7% до 84,1%, а на конец текущего года эти показатели снизились соответственно до 11,5 % и 80,2% соответственно (рис. 2 и табл. 10).
Рисунок 2 – Динамика уровня инфицированности ВЛКРС поголовья крупного рогатого скота в стационарно неблагополучных по лейкозу хозяйствах (ООО «ММФ Нежеголь», АО «Орлик», ЗАО «Восход» и ООО «Победа» Белгородской области.
Неблагополучными по лейкозу крупного рогатого скота на начало 2020 года являлись на территории Белгородской области: ООО «ММФ Нежеголь» и АО «Орлик» с. Воскресеновка Чернянского района; ЗАО «Восход» и ООО «Победа» Шебекинского района, а в конце отчетного периода 2020 года удалось, используя методику ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота и усовершенствующую систему оздоровления, полностью оздоровить поголовье животных АО «Орлик».
2.3 Изучение уровня заболеваемости лейкозом крупного рогатого скота в модельных неблагополучных хозяйствах Белгородской области
По состоянию на начало текущего года в неблагополучных по лейкозу хозяйствах (ООО «ММФ Нежеголь», АО «Орлик», ЗАО «Восход» и ООО «Победа») содержалось следующее поголовье крупного рогатого скота 1105, 3526, 663, 1311 голов соответственно.
За первое полугодие 2020 г. при проведении исследований в реакции иммунодиффузии с использованием методики ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота было выявлено в ООО «ММФ Нежеголь» 748 голов, что составило 67,69% от общего поголовья стада. При исследовании сывороток от 748 голов, ранее дающих положительную реакцию в РИД, у 59 особей крупного рогатого скота при исследовании периферической крови выявлена гематологическая стадия развития лейкозного процесса, что составило 8% (таблица 1).
Таблица 1 – Результаты серологических и гематологических исследований по лейкозу КРС в неблагополучных хозяйствах
на территории Белгородской области (январь 2020 г.)
| № п/п | Наименование хозяйства | Всего поголовья, голов | Уровень инфицированности животных, % | Выявлено РИД (+) животных, голов | Выявлено гембольных животных,
голов |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1 | ООО «ММФ Нежеголь» | 1105 | 67,7 | 748 | 59 |
| 2 | АО «Орлик» | 3526 | 31,7 | 1118 | 75 |
| 3 | ЗАО «Восход» | 663 | 56,4 | 374 | 46 |
| 4 | ООО «Победа» | 1311 | 84,1 | 1103 | 39 |
В ЗАО «Восход» было выявлено 374 головы, реагирующих в РИД положительно, что составило 56,4% от общего количества поголовья крупного рогатого скота в хозяйстве. При исследовании 374 РИД положительно реагирующих животных – у 46 голов выявлена гематологическая стадия развития лейкозного процесса, что составило 12,3%.
В целом по Белгородской области по состоянию на январь 2020 года, учитывая неблагополучие по лейкозной инфекции крупного рогатого скота среди четырех вышеприведенных хозяйств с численностью поголовья 6605 голов, было выявлено реагирующих в реакции иммунодиффузии 3343 головы, что составляло 50,6%. При этом гематологически больных особей было выявлено 219 голов (6,55%) (рис. 3).
Рисунок 3 – Результаты использования методики ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при оздоровлении неблагополучных по лейкозу хозяйств Белгородской области.
Поскольку животноводческое хозяйство ООО «Победа» Шебекинского района является неблагополучным по лейкозу крупного рогатого скота на протяжении многих лет и уровень зараженности поголовья BLV инфекцией значительно превышает 30% инфицированность стада, то было принято решение использовать данное хозяйство как модельное. Согласно усовершенствованной методике раннего выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных отбор проб крови для проведения серологических исследований проводить не один раз в шесть месяцев, а одни раз в 2-3 месяца.
В ООО «Победа» при проведении серологических исследований выявлено 1103 головы РИД положительных особей от 1311 общего количества поголовья крупного рогатого скота в стаде. Таким образом, инфицированность ВЛКРС в хозяйстве составила 84,1%. Проведенными гематологическими исследованиями среди 1103 РИД положительно реагирующих выявлено 39 голов находящихся в гематологической стадии развития инфекционного процесса, что составляет 3,5%.
На конец исследуемого периода использование разработанной методики ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота с целью усовершенствования системы оздоровления позволило повысить выявляемость в реакции иммунодиффузии инфицированное поголовье с 1668 до 1741 голов, что составило на 6,35% больше в сравнении с началом периода исследований. Что касается выделения гематологически больных лейкозом крупного рогатого скота животных, то на конец года их количество было всего 22 головы, что в процентном отношении составило 1,26%. Это в 5,2 раза меньше по сравнению с началом года.
Таким образом, разработанная методика ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволила ускорить процесс оздоровления неблагополучных хозяйств на территории Белгородской области за счет увеличения кратности проводимых исследований с 6-ти месяцев до 2—3-х месяцев в течение года, увеличение чувствительности реакции иммунодиффузии и полного выполнения плана профилактических оздоровительных (противолейкозных) мероприятий, разработанных в Белгородской области, что сопровождалось интенсивным уменьшением выявляемости гематологически больных животных в 5,2 раза и увеличение количества инфицированных особей на 6,35%.
2.4 Изучение возможности ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении оздоровительных мероприятий
При очередном исследовании поголовья крупного рогатого скота неблагополучного хозяйства ООО «ММФ Нежеголь» в июне 2020 года было выявлено 405 голов, дающих положительный ответ в реакции иммунодиффузии, что составило 39% от 1054 голов крупного рогатого скота, находящихся в этом хозяйстве. При этом с помощью гематологического теста выявлено 34 головы, что составило 8,4% от общего количество РИД-положительных животных (таблица 2).
Это свидетельствует об ухудшении эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота, так как количество гематологически больных животных в процентном отношении увеличилось с 8 до 8,4%. Было принято решение для ускорения оздоровления неблагополучных хозяйств уменьшить периодичность исследований с 6 до 3 месяцев, так как полугодовой период исследований может способствовать перезаражению животных инфицированными особями, находящимися на ранних стадиях развития лейкозного процесса, у которых ранее не выявляли антитела к ВЛКРС в реакции иммунодиффузии, поскольку имелся низкий противовирусный антительный индекс.
Таблица 2 – Результаты серологических и гематологических исследований по лейкозу КРС в неблагополучных хозяйствах на территории Белгородской области (первое полугодие 2020 г.)
| № п/п | Наименование хозяйства | Всего поголовья, голов | Уровень инфицированности животных, % | Выявлено РИД (+)
животных, голов |
Выявлено гембольных животных,
голов/% |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1 | ООО «ММФ Нежеголь» | 1054 | 39 | 405 | 34/8,4 |
| 2 | АО «Орлик» | 418 | 0 | 0 | 0 |
| 3 | ЗАО «Восход» | 1775 | 37,8 | 672 | 8/1,19 |
| 4 | ООО «Победа» | 1192 | 33,5 | 399 | 14/3,51 |
В АО «Орлик» до июня месяца было проведено три исследования и все положительно реагирующее в РИД животных перемещены в отделенные помещения для РИД (+) положительных животных, а гематологически больные особи были удалены из стада и сданы на санитарный убой на мясокомбинат.
Такую же эффективность по оздоровлению от лейкоза неблагополучных хозяйств – использование увеличения кратности проведения серологической диагностики в два раза с применением усовершенствованной РИД – установили в ЗАО «Восход». При проведении исследований в июне 2020 года — среди 1775 голов крупного рогатого скота было выявлено 672 головы, реагирующих позитивно в реакции иммунодиффузии, что составило 37,8%. Ранее серопозитивность в этом хозяйстве составляла 56,4%.
В ООО «Победа» за первое полугодие 2020 года при общем количестве поголовья 1192 головы было выявлено РИД (+) положительных особей 399 голов, что составляло 33,5%. Также было выявлено 14 голов крупного рогатого скота, находящихся в гематологической стадии развития лейкозного процесса. Эти показатели свидетельствовали об улучшение эпизоотологической ситуации в хозяйстве в результате применения методики ранней диагностики, способствующей ускорению выявляемости инфицированных животных по сравнению с началом текущего года. При этом уровень инфицированности снизился более чем в два раза с 84,1% до 33,47%. Выявляемость РИД (+) положительных животных сократилась с 1103 до 399 голов и количество гембольных животных с 39 до 14 голов, т.е. поголовье РИД (+) и гембольных животных снизилось в 2,8 раза.
В последующих исследованиях при сокращении интервала между исследованиями до двух месяцев и применении усовершенствованной постановки реакции иммунодиффузии было всего исследовано 363 головы крупного рогатого скота, из которых оказались 34 головы инфицированы вирусом лейкоза (РИД+), что составило 9,37%. При этом необходимо отметить, что с использованием усовершенствованной методики проведения РИД удалось дополнительно выявить 5 инфиированных вирусом лейкоза животных, что на 14,71 % больше по сравнению со стандартной методикой (таблица 3).
Таблица 3 – Динамика выявляемости инфицированных и больных
лейкозом крупного рогатого скота животных
за первое исследование второго полугодия 2020 года в ООО «Победа»
| №
п/п |
Общее количество
исследуе- мых животных (n) |
Количество животных,
РИД+ (стандарт) |
Количество животных,
РИД+ (усоверш.) |
Увеличение выявляемости инфицированных животных ВЛКРС | Общее
количество животных, гематологически происледованных |
Количество гематологически больных животных | ||||
| гол. | % | гол. | гол. | гол. | % | гол. | гол. | % | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 1 | 363 | 34 | 9,37 | 39 | 10,74 | 5 | 14,71 | 23– (до 18 мес.) | 11 | 47,82 |
| 29 – (коровы) | 17 | 58,62 | ||||||||
| Всего 52 | 28 | 53,85 | ||||||||
Следует отметить, что при первом исследовании второго полугодия выявлено 52 РИД (+) животных, среди которых было 29 коров и 23 телки до 18 месяцев, а также обнаружены гематологически больные животные, 28 особей, что составило 53,85%. Что касается коров, то гематологически больных особей выявлено 17 голов (58,62%) коров и 11 голов телок (47,82%) (таблица 3-4, рис. 3).
Таблица 4 – Динамика выделяемости гематологически больных животных по количеству лейкоцитов среди больного лейкозом крупного рогатого скота поголовья ООО «Победа» (первое исследование второго полугодия, 2020 год)
| №
п/п |
Общее количество гематологически больных животных (n) | Количество лейкоцитов в тыс/мкл | ||||||||
| 12,0±03* | От 12 до 20 | Свыше 20 | Свыше 30 | |||||||
| гол. | % | гол. | % | гол. | % | гол. | % | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5- | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 1 | Коровы | |||||||||
| 17 | 2 | 11,76 | 6 | 35,29 | 5 | 29,41 | 4 | 23,53 | ||
| 2 | Телки (12-18 мес.) | |||||||||
| 11 | 3 | 27,27 | 7 | 63,64 | 1 | 9,09 | — | — | ||
| Всего | 28 | 5 | 17,86 | 13 | 46,43 | 6 | 21,43 | 4 | 14,28 | |
*Показатели количества лейкоцитов близки к 12,0±03 тыс/мкл
Гематологические исследования материала от 5 особей показало, что в крови обнаружено около 12,0±03 тыс/мкл лейкоцитов, среди них: у 3 телок (27,27%) и у 2 коров (11,76%) (таблица 4, рис. 4-5).
Рисунок 4 – Количественные показатели содержания лейкоцитов у гематологически больных животных за первое исследование второго полугодия среди поголовья крупного рогатого скота по разным возрастным группам ООО «Победа».
В пробах крови от 13 гематологически больных коров количество лейкоцитов составило от 12 до 20 тыс/мкл, что составило 46,43%, среди них 7 телок (12-18 мес.) – 63,64% и 6 коров – 35,29% (таблица 4, рис. 4, рис. 6).
Исследования проб крови от гематологически больных животных позволило выявить 6 особей с количеством лейкоцитов свыше 20 тыс/мкл, что составило 21,43%, среди них 1 телка (12-18 мес.) – 9,09% и 5 коров – 29,41% (таблица 4, рис. 4 и рис. 7); (Приложение 1, рис. 23-24).
Рисунок 5 – Мазок крови от гематологически больной коровы с содержанием количества лейкоцитов 12±0,3 тыс/мкл (окраска по Лейшману, микроскоп с программным обеспечением, Labor microscopes, 60×/0,75)
Рисунок 6 – Мазок крови от гематологически больной коровы с содержанием количества лейкоцитов от 12 до 20 тыс/мкл (Labor microscopes, 60×/0,75).
Рисунок 7 – Мазок крови от гематологически больной коровы с содержанием количества лейкоцитов свыше 20 тыс/мкл (Labor microscopes, 60×/0,75).
Установлено, что в 4 пробах крови от коров (23,53%) количество лейкоцитов было свыше 30 тыс/мкл (таблица 4, рисунок 4, рис.8).
Рисунок 8 – Мазок крови от гематологически больной коровы с содержанием количества лейкоцитов свыше 30 тыс/мкл (Labor microscopes, 60×/0,75).
При последующем исследовании 180 проб крови крупного рогатого скота (за второе исследование второго полугодия), в том числе 11 телок, обнаружено 11 гематологически больных животных (6,11%), среди них 10 голов — коров (5,9%) и 1 голова – телка (9,09%) (таблица 5, рис. 9).
Таблица 5 – Динамика выделяемости инфицированных и больных
лейкозом крупного рогатого скота животных
за второе исследование второго полугодия 2020 года в ООО «Победа»
| №
п/п |
Общее количество
исследуе- мых животных (n) |
Количество животных,
РИД (+) |
Общее
количество животных, подвергнутых гематологическим исследованиям |
Количество гематологически больных животных | Примечание | ||
| гол. | % | гол. | гол. | % | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 1 | 505 | 15 | 2,97 | 11– телка
(старше 18 мес.) |
1 | 9,09 | Процентное отношение от общего количества гематологически больных животных |
| 169– (коровы) | 10 | 5,92 | |||||
| Всего | 505 | 15 | 2,97 | 180 | 11 | 6,11 | |
В конце второго полугодия 2020 года среди общего количества исследуемых животных (505 голов) ООО «Победа» в РИД выявлено — 15 голов инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота особей (2,97%) (таблица 5). При этом среди общего количества животных – 180 голов, подвергнутых гематологическим исследованиям, выявлено 1 телка (9,09%) и 10 коров (5,92%) — рис.9.
Рисунок 9 – Динамика выявляемости гематологически больных лейкозом животных в ООО «Победа» в конце исследуемого периода.
Из данных таблице 6 видно, что при общем количестве 11 гематологически-больных голов крупного рогатого скота, из которых 6 коров и 1 телка имели в крови от 12 до 20 тыс/мкл лейкоцитов, что составило 54,5% и 36,4% соответственно; 4 коровы имели в крови свыше 20 тыс/мкл лейкоцитов, что составило 40,0% (рис. 10).
Таблица 6 – Показатели содержания лейкоцитов у гематологически больных животных поголовья ООО «Победа» (октябрь, 2020 год)
| №
п/п |
Общее количество гематологически больных животных (n) | Количество лейкоцитов в тыс/мкл | |||||||
| 12±03* | От 12 до 20 | Свыше 20 | Свыше 30 | ||||||
| гол. | % | гол. | % | гол. | % | гол. | % | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 1 | Коровы | ||||||||
| 10 | — | 6 | 54,5 | 4 | 40,0 | — | — | ||
| 2 | Телки (старше 18 мес.) | ||||||||
| 1 | — | — | 1 | 100,0 | — | — | — | — | |
| Всего | 11 | — | — | 7 | 63,64 | 4 | 36,36 | — | — |
_____________________________________________________________________________
* Показатели количества лейкоцитов близки к 12,0±03 тыс/мкл
При исследовании на гематологическом анализаторе URIT-3020 (Китай) по стандартной методике выявлено у 11 гематологичеки больных особей следующие показатели, представленные в таблице 7, свидетельствующие о более ярком представлении гематологических изменений в крови больных животных (Приложение 1, рис. 25-26).
У одной лейкозной телки содержание лейкоцитов составило 55,5 тыс/мкл, что превышало физиологическую норму на 246,88% (таблица 7, Приложение А, рис. 27-28).
Рисунок 10 – Количественные показатели содержания лейкоцитов у гематологически больных животных за второе исследование второго полугодия среди поголовья крупного рогатого скота по разным возрастным группам ООО «Победа».
У коров (7-9 летнего возраста) данный показатель составлял от 37,3 до 46,9 тыс/мкл, что превышало физиологические показатели на 133,13-193,13% (Приложение 1, рис. 29-30). В среднем по всей группе гематологически больных особей – количество лейкоцитов составило 42,5 тыс/мкл, что на 165,7% или в 3,0 раза выше физиологической нормы (таблица 7).
Интерпретируя данные таблицы 7 необходимо акцентировать внимание на том, что показатели содержания лимфоцитов и моноцитов превышают абсолютные единицы более чем в 2 раза; а содержание гранулоцитов более чем в 2,2 раза, что свидетельствует о тяжести лейкозного процесса у данных животных (таблица 7).
Таблица 7 – Показатели лейкоцитарной формулы у больных лейкозом крупного рогатого скота животных ООО «Победа»
| №
п/п |
Инв.
номер |
Возраст
коров |
Результаты лейкоцитарной формулы
по данным URIT-3020 |
|||||||
| Лейкоциты | Лимфоциты | Моноциты | Гранулоциты | |||||||
| тыс/мкл | %
увеличение от нормы* |
тыс/
мкл |
% | тыс/
мкл |
% | тыс/
мкл |
% | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 1 | 212326 | телка | 55,5 | 246,88 | 30,0 | 54,1 | 5,1 | 9,3 | 20,4 | 36,6 |
| 2 | 1611 | 8 лет | 37,8 | 136,25 | 19,8 | 52,4 | 3,1 | 8,3 | 14,9 | 39,3 |
| 3 | 212843 | 7 лет | 40,8 | 155,00 | 19,9 | 48,9 | 3,6 | 8,9 | 17,3 | 42,2 |
| 4 | 1274 | 8 лет | 46,9 | 193,13 | 25,6 | 54,7 | 3,9 | 8,4 | 17,4 | 36,9 |
| 5 | 358429 | 7 лет | 37,3 | 133,13 | 3,3 | 8,9 | 3,0 | 8,2 | 31,0 | 82,9 |
| 6 | 213369 | 8 лет | 45,2 | 182,5 | 20,3 | 44, 9 | 4,2 | 9,3 | 20,7 | 45,8 |
| 7 | 1200 | 9 лет | 40,3 | 151,88 | 16,9 | 42,0 | 2,8 | 7,1 | 20,6 | 50,9 |
| 8 | 1425 | 7 лет | 39,0 | 143,75 | 18,5 | 47,5 | 3,5 | 9,0 | 17,0 | 43,5 |
| 9 | 1328 | 8 лет | 40,1 | 150,62 | 16,84 | 42,0 | 3,73 | 9,3 | 19,53 | 48,7 |
| 10 | 1240 | 8 лет | 43,8 | 173,75 | 19,0 | 43,4 | 3,8 | 8,7 | 21,0 | 47,97 |
| 11 | 300339 | 8 лет | 40,8 | 155,00 | 17,2 | 42,4 | 3,9 | 9,7 | 19,7 | 47,9 |
| Всего | 42,5 | 165,63 | 18,85 | 43,63 | 3,69 | 8,75 | 19,96 | 47,52 | ||
__________________________________________________________________
— ** URIT-3020 — референтно-физиологические показатели здоровых животных: общее количество лейкоцитов — 5,0-16,0 тыс/мкл
Поскольку у РИД (-) отрицательных особей данные по количеству лейкоцитов, имеют физиологические нормативные показатели (Приложение 1, рис. 30-33), то можно с уверенностью говорить, что данные о количественном соотношении выше упомянутых форменных элементов, особенно лейкоцитов и моноцитов, можно было бы использовать при отработки методики в случае стабильных достоверных результатов для характеристики течения лейкозного процесса, используя его в качестве теста ранней диагностики инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных и на завершающем этапе проведения оздоровительных противолейкозных мероприятий.
Таблица 8 – Изучение гематологических показателей
у РИД (-) отрицательных животных в ООО «Победа»
| №
п/п |
Инв.
номер |
Возраст
коров |
Результаты лейкоцитарной формулы
по данным URIT-3020 |
|||||||
| Лейкоциты | Лимфоциты | Моноциты | Гранулоциты | |||||||
| тыс/мкл | %
увеличение от нормы* |
тыс/мкл | % | тыс/
мкл |
% | тыс/
мкл |
% | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 1 | 300780 | 8 лет | 25,4 | 58,75 | 10,7 | 42,4 | 1,2 | 4,9 | 13,5 | 52,7 |
| 2 | 308538 | 6 лет | 7,3 | — | 2,1 | 28,8 | 0,4 | 6,3 | 4,8 | 64,9 |
| 3 | 31051 | 6 лет | 13,4 | — | 6,7 | 50,1 | 0,4 | 3,4 | 6,3 | 46,5 |
| 4 | 1719 | 5 лет | 16,2 | 1,25 | 5,0 | 31,0 | 1,0 | 6,5 | 10,2 | 62,5 |
| 5 | 30209 | 5 лет | 15,5 | — | 6,4 | 41,5 | 0,6 | 4,0 | 8,5 | 54,5 |
| Всего: | 15,6 | — | 6,18 | 38,76 | 0,72 | 5,02 | 8,66 | 56,22 | ||
__________________________________________________________________
— ** URIT-3020 — референтно-физиологические показатели здоровых животных: общее количество лейкоцитов — 5,0-16 тыс/мкл
Изучив клинические показатели крови (содержания лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов) у РИД (-) животных нами установлено, что нормальные показатели лейкоцитов превышали у двух особей, а у одного животного приближались к верхней границе (таблица 8, Приложение 1, рис. 31-32).
Что касается количества лимфоцитов и гранулоцитам, то они выше физиологической нормы у коровы с инв. номером №300780 на 18,89% и 48,35% соответственно.
В целом за первое полугодие текущего года среди вышеперечисленных четырех неблагополучных хозяйств, в которых насчитывается 4439 голов крупного рогатого скота выявлено РИД (+) положительных особей — 1476, что составило 33,2%.
Установлено наличие за этот период гематологически больных животных — 56 голов, что составило 3,8% от числа положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии.
Результаты серологических и гематологических исследований по лейкозу крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах на территории Белгородской области представлены в таблицах №1 и №2 и на рисунках 11, 12 и 13.
Рисунок 11 – Уровень инфицированности поголовья крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах Белгородской области (%).
Рисунок 12 – Количественный показатель выявляемости инфицированных животных вирусом лейкоза с использованием РИД в неблагополучных хозяйствах Белгородской области (голов).
Рисунок 13 – Выявляемость гематологически больных лейкозом животных в неблагополучных хозяйствах Белгородской области (голов).
В комплексе диагностических исследований в качестве дополнительного метода исследования применяли полимеразную цепную реакцию с использованием тест-системы «Лейкоз» на поголовье телят ООО «Победа», полученных от РИД (+) животных. При исследовании в январе 22 проб клинического материала от молодняка до 2-х мес. возраста – 3 головы дали положительный результат на наличие вируса лейкоза крупного рогатого скота. Для постановки ПЦР использовали тест-систему «Лейкоз» согласно инструкции по ее применению, утвержденную руководителем Россельхознадзора от 19 мая 2009 г. [18].
Таблица 9 – Результаты исследования проб крови от телят ООО « Победа» в полимеразной цепной реакции с использованием тест-системы «Лейкоз»
| №
п/п |
Общее количество
происследованных телят (n) |
Возраст
животных |
Количество положите
льных проб в ПЦР |
% к общему количеству происследо
ванных проб в ПЦР |
Примечание |
| Январь | |||||
| 1 | 144 | 15 дн. –
6 мес. |
16 | 11,11 | Поголовье телят на период исследования |
| Май | |||||
| 2 | 50 | 15 дн. –
3 мес. |
14 | 28,0 | Поголовье появившихся телят на период исследования |
| Июнь | |||||
| 3 | 36 | 15 дн. –
1,5 мес. |
2 | 5,55 | Телята от РИД (+) коров |
| Всего | 230 | — | 32 | 13,91 | — |
Далее было принято решение провести исследование всего поголовья телят от 15 дней до 6 месяцев, полученного от РИД (+) коров (таблица 9). В результате проведенных исследований в январе месяце от 114 телят (проб кров) в 16 пробах выявлено присутствие вируса лейкоза крупного рогатого скота, что составило 11,11%. На основе полученных данных при очередных исследованиях в мае и июне также использовали данный тест для обследования телят с целью недопущения распространения лейкозной инфекции через инфицированный молодняк. Поскольку данные особи являются источниками возбудителя инфекции и находясь в общем стаде с другими телятами перезаражают вирусом лейкоза все остальное поголовье. Во избежание перезаражения и с целью эпизоотологической цепи последующие исследования с использованием полимеразой цепной реакцией проводились через каждые три-четыре месяца.
Исследованиями, проведенными в мае месяце проб крови от 50 голов телят от 15 дней до 3-х месяцев было выявлено в 14 пробах присутствие вируса лейкоза крупного рогатого скота, т.е. в 28% проб, полученного от данного поголовья.
В дальнейшем, в июне при исследовании телят от 15 дней до 1,5 месяцев из 36 проб крови было выявлено всего 2 позитивные пробы, в которых присутствовал вирус лейкоза крупного рогатого скота, что составляло 5,5% от общего количества исследованных животных.
В целом же за исследуемый период было детектировано наличие вируса лейкоза у 32 голов телят до 6 месяцев из общего числа 230 телят, полученных от РИД (+) коров, что составило 13,9% (таблица 9).
Все телята, у которых было выявлено в крови провирусное ДНК вируса лейкоза, были удалены из общего стада и отправлены на откорм в отдельное помещение.
Таким образом, молекулярно-генетические исследования с использованием ПЦР тест-системы «Лейкоз» позволяет выявлять 32 инфицированных теленка, что составило 13,91%.
Анализируя данные таблицы 10, необходимо отметить, что наиболее успешными противолейкозные мероприятия с использованием ранней диагностики были в ЗАО «Восход». В данном хозяйстве на начало года, перед применением ранней диагностики было 56,4% инфицированных особей, а на конец исследуемого периода 41,4%, т.е. количество инфицированных животных снизилось на 15%, а выделяемость гематологически больных животных снизилась с 12,3% до 1,9%, т.е. в 6,5 раза (таблица 10, рис. 18).
Таблица 10 – Динамика изменения уровня инфицированности и количество гематологически больных животных в неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйствах на территории
Белгородской области за 2020 г.
| № п/п | Наименование хозяйства | Всего поголовья, голов | Уровень инфицированности животных, % | Выявлено РИД+ животных, голов | Выявлено гембольных животных,
голов/% |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1. | До начала применения ранней диагностики | ||||
| ООО «ММФ Нежеголь» | 1105 | 67,7 | 748 | 59/7,9 | |
| После применения в течении года ранней диагностики | |||||
| ООО «ММФ Нежеголь» | 1090 | 80,2 | 874 | 100/11,4 | |
| 2. | До начала применения ранней диагностики | ||||
| АО «Орлик» | 3526 | 31,7 | 1118 | 75/6,7 | |
| После применения в течении года ранней диагностики | |||||
| АО «Орлик | 572 | 0 | 0 | 0 | |
| 3. | До начала применения ранней диагностики | ||||
| ЗАО «Восход» | 663 | 56,4 | 374 | 46/12,3 | |
| После применения в течении года ранней диагностики | |||||
| ЗАО «Восход» | 1637 | 41,4 | 678 | 13/1,9 | |
| 4. | До начала применения ранней диагностики | ||||
| ООО «Победа» | 1311 | 84,1 | 1103 | 39/3,54 | |
| После применения в течении года ранней диагностики | |||||
| ООО «Победа» | 1009 | 11,5 | 116 | 19/16,4 | |
| ВСЕГО | 10913 | 59,98/33,28 | 835,75/417,0 | 54,75/7,61
7,61/7,43 |
|
Рис. 14 – Динамика изменения уровня инфицированности и количество гематологически больных животных в неблагополучном по лейкозу крупного рогатого скота хозяйстве ООО «ММФ Нежеголь» на территории Белгородской области за 2020 г.
Рис. 15 – Динамика изменения уровня инфицированности и количество гематологически больных животных в неблагополучном по лейкозу крупного рогатого скота хозяйстве АО «Орлик» на территории Белгородской области за 2020 г.
Рис. 16 – Динамика изменения уровня инфицированности и количество гематологически больных животных в неблагополучном по лейкозу крупного рогатого скота хозяйстве ЗАО «Восход» на территории Белгородской области за 2020 г.
Рис. 17 – Динамика изменения уровня инфицированности и количество гематологически больных животных в неблагополучном по лейкозу крупного рогатого скота хозяйстве ООО «Победа» на территории Белгородской области за 2020 г.
В ООО «Победа» показатель инфицированности лейкозом крупного рогатого скота снизился с 84,1% до 11,5%, т.е. на 72,6%, однако количество гематологически больных животных интенсивно выросло с 3,5% до 16,4% (таблица 10, рис. 17).
В ООО «Нежеголь» наблюдается процесс более активного выявления инфицированных вирусом лейкоза и гематологически больных животных за счет применения ранней диагностики. Это проявилось увеличением количества инфицированных и гематологически больных животных соответственно на 17% и 3,5%. На наш взгляд это связано с наличием большего количества животных, по сравнению с предыдущими хозяйствами, находящихся в скрытой стадии лейкозного процесса с низким уровнем антител, что в свою очередь влияет на результаты реакции иммунодиффузии (таблица 10, рис.14).
Таким образом, необходимо отметить, что применение ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении оздоровительных мероприятий позволило полностью оздоровить от лейкозной инфекции поголовье в неблагополучном хозяйстве АО «Орлик» (таблица 10, рис.15). А в двух других неблагополучных по лейкозу хозяйствах: ЗАО «Восход» и ООO «Победа» снизить уровень инфицированности соответственно с 56,4%, 84,1 до 41,4%, 11,5%.
Об эффективности используемой ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении оздоровительных мероприятий в этих двух неблагополучных хозяйствах свидетельствуют данные о снижении уровня инфицированности восприимчивого поголовья животных в 2 и 3,6 раза соответственно в ЗАО «Восход» и ООО «Победа» (рис.16-17).
Рисунок 18 – Динамика изменения уровня инфицированности и выявляемости гембольных после применения ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных хозяйствах Белгородской области
В целом же по всем неблагополучным хозяйствам за счет безукоризненного выполнения плана реализации программы по оздоровлению Белгородской области от лейкоза крупного рогатого скота (Приложение Б), удалось снизить уровень инфицированности поголовья животных BLV в два раза.
2.5 Отработка поэтапного выявления больных лейкозом животных с применением более раннего выявления инфицированных особей для усовершенствования системы оздоровления в отдельно взятом хозяйстве ООО «Победа».
Перед началом проведения исследований был проведён эпизоотический мониторинг с использованием данных официальной статистики государственной ветеринарной службы Белгородской области. Согласно этим данным ООО «Победа» является стационарно-неблагополучном пунктом по лейкозу крупного рогатого скота. ВЛКРС инфицировано 43% животных, среди которых у 3% выявляли признаки гематологической стадии данного заболевания.
Анализируя результаты мероприятий по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, проводимые в стационарно неблагополучном хозяйстве ООО «Победа» в течение последних 13 лет можно утверждать, что данные мероприятия по борьбе с ВЛКРС показали низкую эффективность.
Нами совместно с органами государственной ветеринарной службы были разработаны мероприятия по разделению стада на инфицированных РИД (+) и условно здоровых РИД (-). РИД положительные животные были размещены на отделении Терновое, в трех помещениях, и в телятнике, а условно-здоровые на отделении Белянка в корпусах №3, №4, №5, №1 и №2, где содержались соответственно 210, 120, 151, 203, 32 и 78 голов крупного рогатого скота. В корпусе №3 Белянка размещены телята от 6 до 18-месячного возраста. И отдельно содержались телята до 6 месяцев в количестве 86 голов на ферме №1. Что касается распределения животных, условно-здоровых, то в корпусе № 4 располагались сухостойные коровы и нетели, №5 – коровы дойного стада; №1 – молодняк до 6 месяцев; №2 – родильное отделение (коровы и молодняк до 3-недель) (рисунок 19- 20).
Рисунок 19 – Карта-схема расположения РИД+ и РИД- животных в неблагополучном по лейкозу крупного рогатого скота ООО «Победа», с. Белянка
Рисунок 20 – Схема размещения РИД (+) и РИД (-) животных на площадке село Белянка.
Инфицированные вирусом лейкоза животных (РИД положительные) разместили следующим образом. На отделении Терновое в коровнике №1 (коровы дойного стада), в телятнике ферма №2, где располагались бычки и телки 3-6-месячного возраста; ферма №3 – бычки и телки с 3-6-месячного возраста и телки старше 18-месячного возраста. Всего на начало исследований числилось РИД положительных (больных лейкозом) – 451 голов, из которых: коров – 281 гол., бычки с 6-12-месячного возраста – 85 гол., телки с 6-12 месячного возраста и старше 18-месяцев – 85 гол.
Формировали фермы с поголовьем РИД (+) положительных животных (инфицированные вирусом лейкоза) в соответствии с инструкцией по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота и с учетом путей их передвижения. Как на территории соответствующих отделений, так и в внутри животноводческих площадок. С учетом раздельного доения (отдельный доильный зал), отдельного обслуживающего персонала и использования технических средств. После растёлов от РИД положительных животных немедленного перемещение приплода в телятнике с РИД отрицательными особями (Приложение, рис. 20-21).
Всего было подвергнуто исследованию в первом полугодие , протестировано 320 проб с использованием гематологических исследований, из них дали положительный результат, , телки старше 18-мес. возраста и нетели – 18 голов и телки 6-12 мес. возраста и старше 18-мес. возраста – 22 головы. В июне 2020 года выявлено 14 гембольных животных, из которых 8 коров дойного стада, 6 телок старше 18-мес. возраста и нетелей.
Применение ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием усовершенствованной постановки реакции иммунодиффузии при исследовании испытуемых сывороток крови от животных ООО «Победа» в начале года позволило выявить 1103 головы РИД положительных особей, что составило 84,1% от 1311 общего количества поголовья крупного рогатого скота в стаде. После было принято решение об уменьшении интервала между проведения серологических исследований с шести до двух месяцев (таблица 1-2).
Рисунок 21 – Отдельный доильный зал для РИД (+) животных
Поголовье крупного рогатого скота, положительно реагирующее в РИД было размещено в отдельные помещения с автономным кормлением, отдельным обслуживающим персоналом, а также использованием отдельного доильного оборудования, инвентаря и отделением в течение одного часа после растела от РИД (+ ) коров, телят (здоровых), в отдельное родильное отделения с выпойкой молозива и молока от РИД отрицательных особей (рис. 21-22).
Рисунок 22 – Схема раздельного применения для РИД (+) животных инвентаря, спецодежды и т.д.
При первом серологическом исследовании исследовании в 2020 года 1192 проб сывороток крови от животных ООО «Победа» выявлено РИД положительных особей 399 голов, что составило 33,5%. При обследовании проб от 399 РИД-позитивных животных выявлено 14 голов крупного рогатого скота, находящихся в гематологической стадии развития лейкозного процесса.
При этом в марте было выявлено 140 положительно реагирующих коров в реакции иммунной диффузии, из которых в первой лактации – 40; во второй – 60; в третьей – 18, а в четвертой – 22 головы. В этом же цикле исследований среди коров выявлено 10 голов гематологически больных: в первой лактации – 2; во второй – 3 и в третьей – 5 голов.
В марте среди положительно реагирующих телят в РИД выявлено 170 голов телят: до 12 мес. – 140 и старше 12 месяцев – 30 голов.
Исследования сывороток проб крови проводили с использованием усовершенствованной методики постановки реакции иммунной диффузии, входящей в состав комплекса ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота, при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных хозяйствах.
Методика ранней диагностики лейкоза крупного рогатого с целью усовершенствования системы оздоровления предполагает кроме сокращений сроков серологических исследований еще и совершенствование постановки реакции иммунодиффузии.
Постановка реакции иммунной диффузии осуществлялась в условиях испытательной лаборатории ФГБОУ ВО Белгородский ГАУ (Приложение В).
Этапы проведения усовершенствованной реакции иммунной диффузии, проведенные нами в условиях лаборатории ФГБОУ ВО «БелГАУ», представлены из следующей этапов ниже:
- Центрифугирование сывороток крови от испытуемых животных в пробирках Эппендорфа, на центрифуге в течение 5 минут (Приложение 1, рис. 35).
- После приготовления солевого агара и создания лунок, а также нанесения лейкозного антигена, положительных контрольных сывороток, производим нанесение испытуемых ранее процентрифугированных проб сыворотки крови (Приложение 1, рис. 36-46).
- Следующим этапом является помещение плашек с нанесенным агаром, разнесенными испытуемыми сыворотками с антигеном и положительной сывороткой в металлический бикс с незначительным количеством дистиллированной воды, на его дне (Приложение 1, рис. 47-48).
- Помещение закрытого металлического бикса в термостат при температуре 37 ºС (Приложение 1, рис. 49-50.
- Учет результатов реакции иммунодиффузии через 24 и 48 часов
(Приложение 1, рис. 51-52).
В опыт было взято 1251 голов крупного рогатого скота из неблагополучного хозяйства по лейкозу ООО «Победа» Испытуемые сыворотки от этих животных готовили по вариантам №№1-3 и проводили в условиях, указанных в соответствующих образцах.
Вариант №1. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2,5 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Испытуемую сыворотку вносили в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37ºС, затем читали реакцию.
Вариант №2. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 5 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Испытуемую сыворотку вносили в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 40ºС, затем читали реакцию.
Вариант №3. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 7 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Испытуемую сыворотку вносили в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37ºС, затем читали реакцию.
Вариант №4. Стандартное проведение реакции иммунодиффузии. После получения сыворотки крови, центрифугирование не проводили. Исследуемый материал сразу помещали в лунки с агаром. После проводили учет реакции (проведено согласно Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота от 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130).
В результате проведенных исследований по изучению эффективности выделения РИД (+) инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных с использованием усовершенствованной реакции иммунной диффузии установлено, что при первом исследовании сыворотки крови от 383 голов крупного рогатого скота, ранее дающих отрицательную реакции иммунной диффузии, положительные реакции на стандартную постановку РИД выявлены у 36 голов.
При тестировании 3-х вариантов постановки усовершенствованной реакции иммунодиффузии было выявлено наибольшее количество дополнительно выявленных РИД (+) животных (43 головы) при использовании III варианта постановки РИД, что составило дополнительно 7 голов, выявленных инфицированных животных или 19,44%.
Далее по убывающей при постановке II варианта выявлено 41 голова (10,7%), что привело к дополнительному выявлению 5 инфицированных вирусом лейкоза животных или 13,9%.
Первый вариант усовершенствованной постановки РИД позволил дополнительно выявить 3 головы, инфицированных ВЛКРС, что составило 8,3% от стандартных показателей (таблица 11).
Таблица 11 — Эффективность выделения вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных с использованием усовершенствованной
реакции иммунной диффузии (начало текущего года)
| №
п/п |
Общее количество
исследуе- мых животных (n) |
Количество животных,
РИД (+) (стандарт) |
Количество животных,
РИД (+) (усоверш.) |
Увеличение выявляемости инфицированных животных ВЛКРС | Примечание | |||
| гол. | % | гол. | % | гол. | % | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 1 | 383 | 36 | 9,4 | 39 | 10,2 | 3 | 8,33 | Вариант №1 |
| — | — | — | 41 | 10,7 | 5 | 13,9 | Вариант №2 | |
| — | — | — | 43 | 11,2 | 7 | 19,44 | Вариант №3 | |
| Всего | 383 | 36 | 9,4 | 41 | 10,7 | 5 | 13,89 | |
Таблица 12 — Эффективность выделения вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных с использованием усовершенствованной
реакции иммунной диффузии (середина текущего года)
| №
п/п |
Общее количество
исследуе- мых животных (n) |
Количество животных,
РИД+ (стандарт) |
Количество животных,
РИД+ (усоверш.) |
Увеличение выявляемости инфицированных животных ВЛКРС | Примечание | |||
| гол. | % | гол. | % | гол. | % | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 1 | 363 | 34 | 9,37 | 37 | 10,19 | 3 | 8,82 | Вариант №1 |
| — | — | — | 38 | 10,47 | 4 | 11,76 | Вариант №2 | |
| — | — | — | 39 | 10,74 | 5 | 14,71 | Вариант №3 | |
| Всего | 363 | 34 | 9,37 | 114 | 10,47 | 12 | 11,76 | |
Испытания на поголовье 363 голов крупного рогатого скота привело к следующим результатам 3-х вариантов постановки усовершенствованной реакции иммунодиффузии. Проведенными исследованиями было выявлено наибольшее количество дополнительно выявленных РИД (+) животных (39 головы) при использовании III варианта постановки РИД, что составило дополнительно 5 голов, выявленных инфицированных ВЛКРС особей или 14,71% (таблица 12).
Менее эффективным по выделяемости инфицированных ВЛКРС особей оказался II вариант, позволивший выявить 38 голов (10,7%), что привело к дополнительному детектированию еще 4 голов, инфицированных ВЛКРС вирусом лейкоза животных или 11.76%.
Что касается первого варианта усовершенствованной постановки РИД, то он позволил дополнительно выявить лишь 3 головы, инфицированных ВЛКРС, что составило 8,82% от стандартных показателей.
Таблица 13 – Эффективность выделения вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных с использованием усовершенствованной
реакции иммунной диффузии (середина текущего года)
| №
п/п |
Общее количество
исследуе- мых животных (n) |
Количество животных,
РИД+ (стандарт) |
Количество животных,
РИД+ (усоверш.) |
Увеличение выявляемости инфицированных животных ВЛКРС | Примечание | |||
| гол. | % | гол. | % | гол. | % | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 1 | 505 | 15 | 2,97 | 17 | 3,37 | 2 | 13,33 | Вариант №1 |
| — | — | — | 18 | 3,56 | 3 | 20,00 | Вариант №2 | |
| — | — | — | 19 | 3,76 | 4 | 26,67 | Вариант №3 | |
| Всего | 505 | 15 | 2,97 | 54 | 3,56 | 9 | 16,67 | |
При проведении исследований на наибольшем количестве поголовья 505 голов крупного рогатого скота было установлено, что испытуемый III вариант усовершенствованной реакции иммунной диффузии показал наибольшую эффективность по дополнительной выявляемости ВЛКРС животных. Дополнительно выделенные 4 головы, инфицированных ВЛКРС животных в процентном отношении позволили детектировать до 26,67% особей, которые ранее не давали положительной реакции при применении стандартной РИД (таблица 13).
Сыворотки крови от всех 39 голов имели широкие линии преципитации с лейкозным антигеном.
В отношении второго варианта, усовершенствованной реакции иммунной диффузии, необходимо отметить, что он позволил выявить лишь 38 голов, инфицированных ВЛКРС, что на 3 головы больше по сравнению со стандартной постановкой и это прибавило в процентном отношении по выявляемости инфицированных особей 20,0%.
Первый вариант испытуемой усовершенствованной реакции РИД позволил дополнительно выявить 2 головы, что составило 13,13%.
В среднем исследования 505 проб сыворотки крови с использованием усовершенствованной РИД позволили довыявить 9 голов (16,67%).
В результате проведенных исследований можно сделать вывод, что предлагаемый способ усовершенствованной РИД при проведении диагностики лейкоза крупного рогатого скота основанный на установление прямой связи концентрации искомых антител в испытуемой сыворотке и абсолютного связывания антител с антигенами при более физиологически приближенным к in vivo условиям реакции антигена с антителом, приводит к повышению чувствительности реакции иммуннодиффузии (вариант №3) и позволяет выявлять в среднем на 20,25% больше инфицированных вирусом лейкоза животных по сравнению с постановкой стандартной реакции иммунодиффузии.
Применение предлагаемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет выявлять инфицированных лейкозом животных на более ранних стадиях, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, что позволяет сократить время их нахождения в стаде. Это способствует ускорению проведения оздоровительных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.
Дополнительное применение молекулярно-генетических тестов по детекции провирусной ДНК вируса лейкоза позволяет выявлять на ранних стадиях развития лейкозного процесса у телят с 15-дневого возраста геномный материал ВЛКРС до 14% телят со скрытым течением лейкозного процесса и ничтожно-малым недектируемым лейкозным индексом. Это, в конечном счете, позволит в более короткие сроки провести качественное оздоровление молодняка крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах.
3. Публикации по результатам выполнения НИР
3.1 Список публикаций
Публикации по результатам выполнения научно-исследовательской работы:
1. Development of approaches to the diagnosis of cattle leukemia in the system of antiepisootic measures in the Belgorod region / I.M. Donnik, А.М. Коvalenko, S.N. Belyaeva, A.F. Dorofeev, N.V. Yavnikov, V.Yu. Oskol’skaya, M.V.Petropavlovskiy.
2. Ранняя диагностика инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота животных – залог успешного оздоровления хозяйства / Коваленко А.М. [и др. //]. Ветеринария Кубани. -№ 6, 2020г.
3. И.М. Донник, Н.И. Гулюкин, И.А. Шкуратова, Д.В. Карайченцев, А.М. Коваленко, Н.В. Явников, С.Н. Беляева, М.В. Петропавловский, В.Ю. Оскольская «Методические рекомендации по ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота с целью усовершенствования системы оздоровления неблагополучных хозяйств». — Методические рекомендации, п. Майский, изготовлено в ФГБОУ ВО Белгородский ГАУ 2020 г.-39 с.
3.2 Копии статей
1.
2.
3.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные эпизоотологические исследования в четырех неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйств Белгородской области с применением разрабатываемой ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота показали, что за текущий год выявляемость в РИД (инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота) в неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота хозяйствах с уровнем инфицированности от 31,7 до 84,1% снизилась под конец текущего года к 11,5 — 80,2% по различным хозяйствам.
При изучении уровня заболеваемости лейкозом крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах Белгородской области установлено, что если на начало текущего года выявлялось до 50,6% инфицированных вирусом лейкоза РИД (+) животных, то на конец года этот показатель инфицированности снизился на 11,9% и 38,7%.
Использование разработанной методики ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет повысить выявляемость в реакции иммунодиффузии инфицированных животных с 1668 до 1741 голов, что составило на 6,35% больше. Применение ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении оздоровительных мероприятий позволило полностью оздоровить от лейкозной инфекции поголовье крупного рогатого скота МТФ АО «Орлик» с. Воскресеновка Чернянского района, а в других двух ранее неблагополучных по лейкозу хозяйствах: ЗАО «Восход» и ООO «Победа» Шебекинского района Белгородской области снизить уровень инфицированности с 56,4%, и 84,1 % до 41,4%, и 11,5 % соответственно.
Об эффективности используемой методики ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении оздоровительных мероприятий в этих двух неблагополучных хозяйствах свидетельствуют данные о снижении уровня инфицированности восприимчивого поголовья животных в 2 и 3,6 раза соответственно в ЗАО «Восход» и ООО «Победа». В целом же по всем неблагополучным хозяйствам уровень инфицированности за истекший период исследований понизился в два раза.
При отработке поэтапного выявления больных лейкозом животных с применением более раннего выявления инфицированных особей для усовершенствования системы оздоровления в отдельно взятом хозяйстве ООО «Победа» было уставлено, что предлагаемый способ усовершенствованной РИД при проведении диагностики лейкоза крупного рогатого скота, основанный на установление прямой связи концентрации искомых антител в испытуемой сыворотке и абсолютного связывания антител с антигенами при более физиологически приближенным к in vivo условиям реакции антигена с антителом, приводит к повышению чувствительности реакции иммунодиффузии и позволяет выявлять в среднем от 8,8% до 20,25% больше инфицированных вирусом лейкоза животных по сравнению с постановкой стандартной реакции иммунодиффузии.
Применение предлагаемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет выявлять инфицированных лейкозом животных на более ранних стадиях развития лейкозного процесса, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, что позволяет сократить время их нахождения в стаде. Это, в конечном счете, способствует ускорению проведения оздоровительных противолейкозных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат. В тоже время дополнительное применение молекулярно-генетических тестов для детекции провирусной ДНК вируса лейкоза позволяет выявлять на ранних стадиях развития лейкозного процесса у телят с 15-дневого возраста геномный материал ВЛКРС, что также позволит в более короткие сроки провести качественное оздоровление молодняка крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Выявление специфических антител классов G и M к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотках крови / М.И. Гулюкин, О.В. Капустина, И.Ю. Ездакова, С.В. Вальциферова, Т.В. Степанова, М. Аноятбеков // Вопросы вирусологии. – 2019. – 64(4) : 173-177. – [Электронный доступ]. – URL : https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-173-177 (дата обращения: 01.06.2020).
2. Mutation of a Single Envelope N-Linked Glycosylation Site Enhances the Pathogenicity of Bovine Leukemia Virus/ A. De Brogniez, A.B. Bouzar, J.R. Jacques et al. // J. Virology. – 2015. – V. 89 (17). – P. 8945-56.
3. Межвидовая передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте / М.И. Гулюкин, Н.Г. Козырева, Л.А. Иванова, Т.В. Степанова, А.И. Клименко, А.В. Коваленко, Ю.Д. Дробин, В.Н. Василенко // Вопросы вирусологии. – 2015. – 60(5) : 32-37. – [Электронный доступ]. – URL : https://virusjour.elpub.ru/jour/article/view/354 (дата обращения: 01.06.2020).
4. Валихов, А.Ф. Лейкоз крупного рогатого скота: контроль и профилактика болезни [Обзор] // Молочная промышленность. – 2018. – № 9. – С. 74-77.
5. Донник, И.М. Результативность комплексных мероприятий борьбы с лейкозом крупного рогатого скота на Среднем Урале / И.М. Донник, И.А. Шкуратова, А.Т. Татарчук [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – 2015. – № 2. – С. 42–46.
6. Степанова, Т.В. Анализ экономического ущерба при заболевании лейкозом крупного рогатого скота в период с 2010 по 2014 годы в Российской Федерации // Russian J. Agricultural and Socio Economic Sciences (RJOAS). — 2016. – №8(56). – Р.49-56.
7. Тимошина, С.В. Успешная борьба с лейкозом крупного рогатого скота в Вологодской области / С.В. Тимошина, О.Б. Бадеева // Ветеринария и кормление. – 2012. – № 4. – С. 6–7.
8. Проблема лейкоза крупного рогатого скота / В.А. Мищенко, О.Н. Петрова, А.К. Караулов, А.В. Мищенко. – Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2018. – 38 с.
9. Храмцов, В.В. Экспертная оценка качества мышечной ткани и молока коров, скомпрометированных в отношении лейкоза / В.В. Храмцов, Н.Г Двоеглазов, Р.С. Хафизова // Инновации и продовольственная безопасность. – — 2014. – №2(4). – С.61-70.
10. Свириденко, Г.М. Проблема безопасноти молочных продуктов в связи с лейкозом крупного рогатого скота // Молочная промышленность. – 2017. –№ 8. – С. 13-16.
11. Reduced humoral immunity and atypical cellmediated immunity in response to vaccination in cows naturally infected with bovine leukemia virus / M.C. Frie, K.R. Sporer, J.C. Wallace, R.K. Maes, L.M. Sordillo, P.C. Bartlett et al. // Vet. Immunol. Immunopathol. – 2016. – 182 : 125-35. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2016.10.013 (дата обращения: 05.06.2020).
12. Increased expression of the regulatory T cellassociated marker CTLA-4 in bovine leukemia virus infection / S. Suzuki, S. Konnai, T. Okagawa, R. Ikebuchi, A. Nishimori, J. Koharaet al. // Vet. Immunol. Immunopathol. –2015. – 163(3-4): 115-24. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vetimm.2014.10.006 (дата обращения: 05.06.2020).
13. A point mutation to the long terminal repeat of bovine leukemia virus related to viral productivity and transmissibility / H. Murakami, H. Todaka, J. Uchiyama, R. Sato, K. Sogawa, M. Sakaguchi et al. // Virology. –2019. – 537 : 45-52. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2019.08.015 (дата обращения: 05.06.2020).
14. Влияние препарата «Лейкозав» на клеточное звено иммунитета крыс: электронный журнал EESJ: [сайт] – URL: https://eesa-journal.com/2017/03/14/vliyanie-preparata-lejkozav-na-kletochnoe-zvo/ (дата обращения: 05.06.2020).
15. Характеристика В1-клеток в процессе экспериментального лейкомогенеза / И.Ю. Ездакова, О.В. Капустина, М.И. Гулюкин, Т.В. Степанова // Вопросы вирусологии. – 2020. – 65(1) : 35-40. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-1-35-40 (дата обращения: 06.06.2020).
16. Экспериментальные данные по эффективности диагностических исследований на ранних стадиях вирусоносительства вируса лейкоза крупного рогатого скота / И.М. Донник [и др.]. – Научные рекомендации. – ООО «ИРА УТК», Екатеринбург, 2011. –26 с.
17. Донник, И.М. Профилактика лейкоза крупного рогатого скота в племенных хозяйствах Краснодарского края / И.М. Донник, Г.А Джаилиди, С.В.Тихонов // Ветеринария Кубани. – 2013. – № 5. – С.15-19
18.Инструкция по применению тест-системы «лейкоз» для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота (крс) методом полимеразной цепной реакции, утверждена 19 мая 2009 г. – [Электронный доступ].– URL : http://docs.cntd.ru/document/1200137604 (дата обращения: 06.06.2020).