Титульный лист и исполнители
РЕФЕРАТ
Отчет на 14 листах, 7 рисунков , 1 таблица, 13 источн., 1 прил.
Научные исследования проведены на сельскохозяйственных птицах.
Настоящая работа проведена в рамках выполнения научно-исследовательских работ федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по заказу Минсельхоза России за счет средств федерального бюджета в 2019 году. Исследования проведены на базе диагностического центра по птицеводству при кафедре эпизоотологии им. В.П. Урбана ФГБОУ ВО СПбГАВМ.
Цель работы: Изучение циркуляции вариантных штаммов вируса инфекционного бронхита кур (ИБК) в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации, выделение возбудителя ИБК и разработка схемы вакцинопрофилактики болезни с учетом антигенных вариантов вируса.
Проведено эпизоотологическое обследование отдельных птицеводческих хозяйств с целью изучения циркуляции патогенных штаммов вируса инфекционного бронхита кур. В двух хозяйствах мясного направления обнаружены и выделены вирусы ИБК, изучены их антигенные и другие иммунобиологические свойства для последующей разработки технологии производства вакцин против инфекционного бронхита кур на основе выделенных вариантных штаммов и схем иммунопрофилактики.
Исполнители в рамках выполнения НИР приняли участие в следующих научных конференциях:
1). Национальная научная конференция профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ, тема доклада «Новые малоизученные болезни птиц», докладчик Джавадов Э.Д., СПб, 21 января 2019 г.
2). Проблемы инфекционных болезней в птицеводстве, тема доклада «Малоизученные болезни птиц. Актуальные проблемы вакцинопрофилактики в промышленном птицеводстве», докладчик Джавадов Э.Д., Пермь, 14 – 15 августа 2019 г.
3). Международная научно-практическая конференция «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК», посвященная 50-летию ВНИТИБП, тема доклада «Разработка высокоэффективных средств диагностики и специфической профилактики инфекционных заболеваний птиц, в том числе особо опасных», докладчик Джавадов Э.Д., Щелково, 25 – 27 сентября 2019 г.
По теме НИР за 2019 год было опубликовано 2 научные статьи в журналах WOS, также подготовлена и сдана для публикации 1 научная статья по теме научно-исследовательской работы в журнал WOS.
Исполнители НИР выступили в качестве лекторов на семинарах в рамках курсов повышения квалификации для ветеринарных врачей
1). «Ресурсосберегающие технологии производства и переработки яиц», ФНЦ ВНИТИП РАН, г. Сергиев Посад, ул. Птицеградская, д. 10,тема доклада «Прогрессивные методы вакцинопрофилактики инфекционных болезней в птицеводстве», 25 – 29 марта 2019 г.
2). «Ветеринарные технологии в обеспечении эпизоотического благополучия птицеводческих предприятий» ФГБОУ ВО СПбГАВМ, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5, темы докладов: «Эпизоотическая ситуация по инфекционным болезням в птицеводстве», докладчик Джавадов Э.Д.; «Диагностический мониторинг – важное звено в системе биобезопасности птицехозяйств», докладчик Хохлачев О.Ф.; «Новые малоизученные болезни птиц», докладчик Джавадов Э.Д., 18 – 22 ноября 2019 г.
Подана заявка на изобретение, которая прошла формальную экспертизу, получен приоритет № 2019135237 – «Штамм РВ-07 вируса инфекционного бронхита кур семейства Coronaviridae».
Подана заявка на изобретение, которая находится в стадии рассмотрения: «Вакцина против инфекционного бронхита кур из штамма РВ-07».
ВВЕДЕНИЕ
Инфекционный бронхит кур — высококонтагиозная болезнь, характеризующаяся поражением респираторного тракта, а также мочеполовой системы птиц. Возбудитель ИБК — РНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Coronaviridae [1]. В настоящее время выделено и серотипировано более 100 полевых вариантов вируса. Болеют куры всех возрастов, но наиболее восприимчивы цыплята до 30 — дневного возраста. Пути заражения — аэрогенный, контактный, трансовариальный. Клинические признаки у цыплят 1-30-дневного возраста проявляются вялостью, сонливостью, ухудшением аппетита, ринитом, синуситом, конъюнктивитом, истечением из носа и глаз, хрипами. Смертность составляет до 10-35%. [2]. У взрослых кур наблюдаются легкие респираторные признаки, снижение яйценоскости на 10-50%, обесцвечивание и деформация скорлупы, при этом яйценоскость не восстанавливается полностью даже после выздоровления, ухудшение племенных и товарных качеств яиц. Возбудитель инфекционного бронхита кур характеризуется высокими способностями к мутагенезу. Изменения в геноме вируса ИБК происходят в результате точечных мутаций, делеций, инсерций и рекомбинаций. Варианты вируса ИБК по механизму рекомбинации возникают, когда разные штаммы возбудителя инфицируют одну и ту же клетку [3,4].
Проблема инфекционного бронхита кур в промышленном птицеводстве в последние годы получила новое развитие. Связано это с появлением в разных регионах мира, в т.ч. в Российской Федерации, новых «полевых» штаммов вируса ИБК, отличающихся по антигенной и иммуногенной активности и имеющих различную вирулентность для птиц (D274, D1466, 793B, CR88, 4/91, IT02, D388). Появление новых вариантных штаммов вируса обусловлено генетическим строением коронавируса ИБК, поддающегося сравнительно быстрой мутации и генетической рекомбинации [6]. Циркуляция в птицехозяйствах вариантных штаммов вируса ИБК значительно затрудняет работу ветеринарных специалистов хозяйств по диагностике и специфической профилактике болезни. Широко применяемые в предыдущие годы живые и инактивированные вакцины на основе классического вируса серотипа Массачусетс из штаммов Н-120, Н-52, Ма5, М41 в настоящее время во многих случаях не обеспечивают формирования надежного иммунитета у привитых птиц. Это требует новых подходов к изучению эпизоотической ситуации в каждом отдельном хозяйстве [8,9]. И с учетом выявленных особенностей формировать эффективные программы специфической профилактики ИБК на основе вакцин из штаммов классического вируса и изолятов вариантных штаммов возбудителя, аттенуированных до вакцинных параметров. В связи с этим, перед нами стояла задача провести комплексное эпизоотологическое обследование отдельных птицехозяйств, в которых отмечались признаки респираторной болезни у цыплят, сопровождающиеся ухудшением показателей по сохранности и продуктивности у цыплят и взрослого поголовья [13].
1. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ОТЧЕТА О НИР
В ходе выполнения НИР было проведено эпизоотологическое обследование нескольких птицеводческих хозяйств разного производственного направления. В результате проведенной работы были выделены «полевые» изоляты вируса ИБК в двух птицехозяйствах: ОАО «Рефтинская» (Свердловская область), ООО «Чебаркульская птица» (Челябинская область).
1.1. Проведение эпизоотологического обследования (в т.ч. бронхита кур) ОАО «Птицефабрика «Рефтинская» (Свердловская область)
1.1.1. Обоснование выбора направления исследований
Работа проведена в рамках выполнения научно-исследовательских работ федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по заказу Минсельхоза России за счет средств федерального бюджета в 2019 году.
В соответствии с техническим заданием были выполнены следующие работы:
• Проведено эпизоотологическое обследование птичников бройлерного цеха, в которых содержатся цыплята разного возраста (суточные, 23-, 30- и 37- дневные);
• Проведено патологоанатомическое вскрытие трупов павших и вынужденно забитых цыплят-бройлеров и сделан анализ выявленных патологоанатомических изменений у вскрытых птиц;
• Проведен отбор патологического материала от вскрытых птиц (органы и ткани с признаками, характерными для инфекционных болезней птиц);
• Проведены лабораторно-диагностические исследования патологического материала для выделения возбудителей инфекционных болезней птиц.
1.1.2 Методы исследований
• Патологический материал (легкие, почки, селезенка, трахея) отбирали в процессе вскрытия павших и вынужденно забитых цыплят-бройлеров.
• Сыворотка крови от клинически здоровых цыплят-бройлеров в количестве 60 проб.
• Сыворотка крови от клинически больных цыплят-бройлеров в количестве 45 проб.
• Для вирусологического исследования патматериала на выявление вируса инфекционного бронхита кур использовали метод последовательных пассажей на развивающихся эмбрионах кур.
• Заражение, инкубирование, вскрытие зараженных эмбрионов кур, сбор и исследование вируссодержащей жидкости проводили по ГОСТ 25583-83.
• Молекулярно-биологические исследования (ОТ-ПЦР) проводили с использованием комплекта реагентов «Рибо-сорб» и олигонуклеотидных праймеров производства ООО «Бигль» (Санкт-Петербург). РНК из проб патматериала от каждой группы птиц выделяли методом афинной сорбции на силикагеле. Для выделения РНК вируса ИБК первоначально проводили накопление вируса методом последовательных пассажей гомогената патологического материала на развивающихся эмбрионах кур.
Для решения поставленных задач применяли общепринятые в ветеринарной практике методы лабораторного анализа:
• Патологоанатомическое исследование, дающее возможность обнаружить в органах и тканях трупов птиц патологоанатомические изменения, характерные для тех или иных инфекционных болезней птиц. Проводили методом вскрытия павшей и вынужденно забитой птицы с последующим изучением и анализом выявленных признаков патологии.
• Вирусологические исследования с целью выделения из патологического материал вируса ИБК проводили по ГОСТ 25583-83. Для репродукции патматериала использовали развивающиеся куриные эмбрионы.
• Молекулярно-биологические исследования (ОТ-ПЦР), позволяющие обнаружить РНК и/или ДНК выделенных вирусов и идентифицировать их принадлежность к определенному виду или подгруппе, проводили общепринятым методом.
• Для реакции секвенирования брали 50 нг ДНК, 5 pmol праймеров, набор «DYEnamic ET terminator kit». Определение нуклеотидной последовательности осуществляли по методу Сэнгера с использованием флуоресцентно меченых терминирующих нуклеотидов на секвенаторе АВI Prism3130 (Applied Biosystem, CШA) согласно инструкции изготовителя. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями штаммов вируса ИБК, опубликованными в международной базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) с помощью программы BioEdit, версия 7.0.5.3.
• Исследования сопровождали постановкой диагностических реакций: РГА, РТГА, РДП, для дифференциальной диагностики изолятов по гемагглютинирующим, антигемагглютинирующим и преципитирующим свойствам.
1.1.3 Результаты исследований
26 февраля 2019 года было проведено эпизоотологическое обследование бройлерной площадки и отобран патологический материал для проведения диагностических исследований. При клиническом осмотре выявлено наличие респираторных признаков у цыплят старше 25-суточного возраста: затрудненное дыхание, чихание, конъюнктивит, ринит, опухание инфраорбитальных синусов, «посадка на ноги», депрессия, отказ от корма и воды. В ходе патологоанатомического вскрытия был проведен отбор патматериала для лабораторно-диагностического исследования на наличие возбудителей инфекционных болезней птиц.
| Группа
птиц |
Кол-во
проб (шт.) |
Болезнь | Средний титр антител | Коэф. вариа-
ции (%) |
Mин.
значе-ние титра |
Макс.
значение титра |
Качест-во
иммунитета (%) |
Количест-
во положит. реагирую-щих птиц (%) |
| Здоровые | 20 | ИБК | 2180 | 78,4 | 548 | 2616 | 100 | — |
| Больные | 20 | ИБК | 5946 | 24,6 | 256 | 9094 | 100 | — |
| Здоровые | 20 | МПВИ | 324 | 94,8 | 132 | 916 | — | 10 |
| Больные | 20 | МПВИ | 872 | 78,6 | 318 | 2756 | — | 20 |
| Здоровые | 20 | ОРТ | 446 | 77,5 | 130 | 1755 | — | 10 |
| Больные | 20 | ОРТ | 908 | 60,6 | 265 | 2076 | — | 20 |
| Здоровые | 20 | РМП | 268 | 72,2 | 57 | 803 | — | 0 |
| Больные | 20 | РМП | 1336 | 54,2 | 382 | 2014 | — | 20 |
| Здоровые | 20 | ИЛТ | 970 | 81 | 136 | 2850 | 20 | — |
| Больные | 20 | ИЛТ | 1228 | 112 | 9 | 3485 | 20 | — |
Таблица 1 — Результаты исследования в ИФА сыворотки крови цыплят-бройлеров на наличие антител к вирусу ИБК, МПВИ, ОРТ, РМП, ИЛТ
Количество положительно реагирующих цыплят и выявленный уровень антител указывают на относительное благополучие исследованных групп цыплят-бройлеров по МПВИ, ИЛТ, ОРТ и РМП. Вместе с тем, выявлены существенные отличия в иммунной реакции здоровых и больных цыплят в отношении инфекционного бронхита кур. Это ретроспективно подтверждает, что основной причиной болезни цыплят является полевая ИБК-инфекция.
В результате проведенных вирусологических исследований на инфекционный бронхит кур (ИБК) был выделен вирус ИБК, патогенный для развивающихся куриных эмбрионов. Гибель и характерные патологоанатомические изменения у зараженных эмбрионов (отставание в развитии, скрюченность в «шар») были отмечены начиная со второго последовательного пассажа.
В результате изучения иммунобиологических свойств выделенного вируса были установлены антигенные характеристики и вирулентность возбудителя для развивающихся куриных эмбрионов и цыплят-бройлеров. Использование молекулярно-генетических методов исследования (ОТ-ПЦР, геномное секвенирование) позволило определить идентичность изолята вариантному штамму «QX» вируса ИБК.
1.2. Проведение эпизоотического обследования в ООО «Чебаркульская птица» (Челябинская область)
1.2.1. Обоснование выбора направления исследований
Работа проведена в рамках выполнения научно-исследовательских работ федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по заказу Минсельхоза России за счет средств федерального бюджета в 2019 году.
В соответствии с техническим заданием были выполнены следующие работы:
• Проведено эпизоотологическое обследование птицехозяйства.
• Проведено патологоанатомическое вскрытие трупов павших и вынужденно убитых цыплят и кур разных возрастных групп и изучения выявленных патологоанатомических изменений во внутренних органах и тканях.
• Отобран патологический материал от вскрытых птиц (органы и ткани с патологоанатомическими признаками, характерными для инфекционного бронхита кур).
• Проведены лабораторно-диагностические исследования патологического материала в целях выделения возбудителя ИБК.
• Изучены иммунобиологические свойства выделенного вируса.
1.2.2. Методы исследований
Патологический материал от цыплят-бройлеров: легкие, печень, селезенка, трахея, почки от трупов птиц .
Патологический материал от реммолодняка и взрослого поголовья кур: печень, почки, селезенка, трахея от трупов.
Для вирусологического исследования патматериала на выявление вируса инфекционного бронхита кур (ИБК) использовали метод последовательных пассажей на развивающихся куриных эмбрионах 10-дневной инкубации.
Молекулярно-биологические исследования (ОТ-ПЦР) проводили с использованием комплекта реагентов «Рибо-сорб» и олигонуклеотидных праймеров производства ООО «Бигль» (Санкт-Петербург). Суммарную РНК из проб патматериала от каждой группы птиц выделяли методом афинной сорбции на силикагеле. Для выделения РНК вируса ИБК первоначально проводили накопление вируса методом последовательных пассажей патологического материала на развивающихся куриных эмбрионах.
Исследования проводили следующими методами:
Патологоанатомическое исследование, дающее возможность обнаружить в органах и тканях трупов птиц изменения, характерные для тех или иных инфекционных болезней птиц.
Вирусологические исследования с целью выделения из патологического материала различных вирусов и определения их антигенных и других иммунобиологических свойств.
Молекулярно-биологические исследования (ОТ-ПЦР), позволяющие обнаружить РНК или ДНК выделенных вирусов и идентифицировать их принадлежность к определенному виду или подгруппе.
Для реакции секвенирования брали 50 нг ДНК, 5 pmol праймеров, набор «DYEnamic ET terminator kit». Определение нуклеотидной последовательности осуществляли по методу Сэнгера с использованием флуоресцентно меченых терминирующих нуклеотидов на секвенаторе АВI Prism3130 (Applied Biosystem, CШA) согласно инструкции изготовителя. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями штаммов вируса ИБК, опубликованными в международной базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) с помощью программы BioEdit, версия 7.0.5.3.
Исследования сопровождали постановкой диагностических реакций: РГА, РТГА, РДП, для дифференциальной диагностики в изолятов по гемагглютинирующим, антигемагглютинирующим и преципитирующим свойствам.
1.2.3. Результаты исследований
Проведено эпизоотологическое обследование бройлерного отделения птицефабрики, зоны ремонтного молодняка и взрослого поголовья родительского стада. Был проведен клинический осмотр птицы в птичниках, в которых отмечалась повышенная выбраковка по причине снижения продуктивности, изменения цвета скорлупы, деформации скорлупы и неправильная форма яйца (рисунок 7).
В ходе патологоанатомического вскрытия (рисунок 1 – 6) был проведен отбор патологического материала для лабораторно-диагностических исследований на наличие возбудителей вирусных болезней птиц.
В результате проведенных исследований из патматериала (цыплята-бройлеры из птичников № 22 (возраст 26 дней), № 20 (29 дней) и № 16 (34 дня) был выделен вирус инфекционного бронхита кур (ИБК), патогенный для развивающихся куриных эмбрионов. Результаты проведенной ОТ-ПЦР и геномного секвенирования позволили установить антигенное родство «полевого» изолята с вариантным штаммом «QX» вируса ИБК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате эпизоотологического обследования птицефабрик мясного направления ОАО «Рефтинская», ООО «Чебаркульская птица» и проведения лабораторно-диагностических исследований патологического материала выделен патогенный вирус инфекционного бронхита кур, имеющий антигенное родство с вариантным штаммом «QX» вируса ИБК.
Проведенные исследования свидетельствуют о циркуляции патогенного вариантного штамма вируса инфекционного бронхита кур на птицефабриках Российской Федерации.
Полученные в результате выполнения научно-исследовательской работы данные могут быть использованы в дальнейшем для разработки вакцин против ИБК на основе аттенуированных вариантных штаммов вируса ИБК. Внедрение новых вакцин в схемы лечебно-профилактических мероприятий позволит повысить эффективность специфической защиты птицеводческих хозяйств от инфекционного бронхита кур.
Также, полученные результаты могут быть использованы при проведении занятий для слушателей курсов повышения квалификации и при чтении лекций студентам факультетов ВМ и ВСЭ по дисциплинам «Болезни птиц», «Эпизоотология».
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. «Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита. Государственный стандарт Союза ССР. ГОСТ 25582-83. М. 1983, с. 9 – 15.-
2. «Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний». Методы лабораторной диагностики болезни Марека. Государственный стандарт Союза ССР. ГОСТ 25586-83. М. 1983, с. 21-30.
3. «Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний».
Методы лабораторной диагностики болезни Ньюкасла. Государственный стандарт Союза ССР.
ГОСТ 25587-83. М. 1983, с. 31-39.
4. «Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний».
Методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита. Государственный стандарт Союза ССР. ГОСТ 25583-83. М. 1983, с. 16-20.
5. Методические указания по эпизоотологическому обследованию птицеводческого предприятия: Утв. ГУВ МСХ и продовольствия Респ. Беларусь 10.04. 2004/ Б.Я. Бирман, Р.П. Лизун, И.В. Насонов и др. Минск: Полибиг, 2004. 10 с.
6. А.Б. Терюханов. Инфекционный бронхит кур. Л., «КОЛОС» (Ленингр. отд-ние), 1976, с. 44-45.
7. Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени/ Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, А.В. Андриясов [и др.]. – Владимир, ФГУ «ВНИИЗЖ», 2010. – 10 с.
8. Бочков, Ю.А. Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России: дисс. канд. биол. наук /Бочков Юрий Александрович.-Владимир, 1999. – 180 с.
9. Дандал А.Ш., Сухарев О.И., Макаров В.В. Патогенез инфекционного бронхита кур. Сообщение 1. Репродукция вируса генотипа «QX» в организме цыплят при различных способах заражения. Актуальные вопросы ветеринарной биологии №1, 2015. с. 24-27.
10. Дандал А.Ш., Кулаков В.Ю., Сухарев В.Ю., Макаров В.В. Патогенез инфекционного бронхита кур. Сообщение 2. Диссеминация вируса в организме цыплят по результатам ПЦР. Актуальные вопросы ветеринарной биологии №2 [26], 2015. c 41-45.
11. Л.О. Щербакова, С.Н. Колосов, З.Б. Никонова, У.В. Овчинникова, И.А. Чвала. Генетическая характеристика изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных на территории стран СНГ в 2015-2017 гг. Ветеринария сегодня. Сентябрь №3. 2018. c 31-34.
12. Balykina A.B., Nikonov I.N., Karpenko L.Yu., Bakhta A.A., Kuznetsov Yu.E. HE INFLUENCE OF THE ANIMAL FEED COMPONENTS AND BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES INTO THE INTESTINAL MICROBIOTA STATE OF THE BIRD. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018. Т. 9. № 6. С. 1876-1880.
13. Balykina A.B., Nikonov I.N., Karpenko L.Yu., Bakhta A.A., Kuznetsov Yu.E. THE COMPOSITION AND ROLE OF THE MICROBIOTA OF CHICKENS GASTROINTESTINAL TRACT. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018. Т. 9. № 6. С. 1881-1885.