Разработка экспресс-метода определения термического состояния мяса и рыбы по структуре мышечных волокон

Титульный лист и исполнители

РЕФЕРАТ

Отчет 21 с., 1 кн., 19 рис., 2 табл., 22 источн., 2 прил.

ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ, МЯСО, РЫБА, ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА, КАЧЕСТВО, БЕЗОПАСНОСТЬ

Объектом исследования являются пробы мышечной ткани убойных животных, птицы и рыбы.

Цель работы ‒ изыскание метода выявления признаков первичной или многократной дефростации мяса, мяса птицы и рыбы, который заключается в разработке и отработке упрощенного метода исследования структуры мышечных волокон в мясе и рыбе, а также оценке их в нативных препаратах в различных термических состояниях.

В процессе работы проводились экспериментальные исследования отдельных образцов мышечной ткани убойных животных, птицы и рыбы гистологическим методом, а также с помощью предложенного экспресс метода изготовления нативных препаратов.

В результате исследования впервые был разработан экспресс-метод изготовления микропрепаратов для идентификации, охлажденного и дефростированного мяса убойных животных и птицы позволяющий в кратчайшие сроки изготовить нативные препараты мышечной ткани с целью оценки термического состояния мяса по наличию механических повреждений мышечных волокон: разволокненность участков, разрывы мышечных волокон, наличие утолщений на окончаниях мышечных волокон.

Степень внедрения ‒ имеется положительное решение о выдачи патента на изобретение.

Эффективность экспресс-метода подтверждена значительным объемом проведенных исследований (69 проб: свинины – 12 пробы; говядины – 15; баранины – 8; мяса лося – 4; нутрии – 4; цыплят-бройлеров – 5; индеек – 7; мясо медведя — 3; рыбы – 11) и методами вариационной статистики.

Разработанный экспресс метод внедрен в работу ГУ «Санкт-Петербургская городская ветеринарная лаборатория» и в лаборатории ветеринарно-санитарной экспертизы на продовольственных рынках Санкт-Петербурга при исследовании мяса и рыбы, а также в учебный процесс ФГБОУ ВО СПбГАВМ.

ВВЕДЕНИЕ

Обеспечение качества и безопасности пищевых продуктов является неотъемлемой частью сохранения здоровья населения и поддержания высокого уровня экономического развития страны. В соответствии с «Доктриной продовольственной безопасности Российской Федерации», утвержденной Указом Президента Российской Федерации от 30 января 2010 года N 120, продовольственная безопасность является важнейшей составляющей демографической политики, необходимым условием повышения качества жизни граждан путем внедрения и реализации эффективных решений, отвечающих требованиям международных стандартов [1].

Одной из основных задач продовольственной безопасности является обеспечение безопасности пищевых продуктов, что достигается контролем соответствия требованиям законодательства Российской Федерации сельскохозяйственной продукции и продовольствия, в том числе импортированных, на всех стадиях их производства, хранения, транспортировки, переработки и реализации. Для осуществления такого контроля действующее российское законодательство предусматривает ряд методов и методик, устанавливающих доброкачественность пищевой продукции и безопасность ее использования на всех этапах обращения [2].

В рамках мониторинга выявляются случаи выпуска в реализацию мяса, рыбы и субпродуктов, полученных от больных животных, несвежей продукции, видовой подмены и фальсификации охлажденного сырья дефростированным, поскольку мясо и рыба являются одним из самых популярных видов питания, который обладает высокими вкусовыми и потребительскими качествами, содержат большое количество полноценных белков, витаминов, минеральных веществ и небольшое количество жира и, в то же время, занимают достаточно высокий ценовой сектор потребительской корзины граждан [3. 4. 5].

Химический состав и пищевая ценность мяса и рыбы зависит от его термического состояния. Известно, что содержание питательных и биологически активных веществ выше в охлажденной продукции. При обработке ее минусовыми температурами, свободная вода, содержащаяся в мышечных клетках, кристаллизуется и образовавшиеся кристаллы способны механически повреждать сарколемму, в результате чего, при размораживании мяса из поврежденных мышечных волокон высвобождается цитоплазма, а вместе с ней и питательные вещества [6, 7, 8, 9, 10].

Методы определения термического состояния мясного и рыбного сырья и выявления многократно дефростированной продукции основываются на оценке органолептических показателей, таких как цвет, консистенция, а также прозрачность бульона при постановке пробы варкой, а также гистологическим методом по структуре мышечной ткани и целостности мышечных волокон. Одним из методов оценки качества мясного сырья является метод гистологического исследования, регламентируемый ГОСТ 19496-2013 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологического исследования», который позволяет определить степень свежести мяса и провести идентификацию состава мясной продукции [11, 12, 13, 14].

Метод основан на изучении микроструктурных показателей мясного сырья в гистологических препаратах, изготовленных с помощью замораживающего или санного микротомов с последующей окраской специальными гистологическими красителями. Гистологический метод весьма точен и достоверен, по наличию разрывов мышечных элементов и пустот в мышечных клетках, возможно, безошибочно определить предшествующую низкотемпературную обработку. Однако в производственных условиях данный метод сложно выполним, требует специальной подготовки персонала и оснащения лаборатории. Кроме того, гистологическое исследование выполняется в течение длительного времени, что теряет свою актуальность в условиях реального обращения мясной продукции [15, 16, 17].

Органолептические методы являются достаточно субъективными и при различных обстоятельствах могут не дать достоверного ответа на вопрос о термическом состоянии продукта. Для обеспечения выпуска в реализацию доброкачественной охлажденной продукции и исключения подмены, охлажденных мяса и рыбы дефростированными необходим метод быстрый, эффективный и легко воспроизводимый.

В связи с этим возникает необходимость изыскания доступного и достоверного метода, позволяющего в кратчайшие сроки в производственных условиях производить оценку термического состояния мяса и, в первую очередь, устанавливать признаки однократной или многократной дефростации [18].

1ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ОТЧЕТА О НИР

1.1 Методы исследований

В качестве прототипа классического гистологического метода исследования мяса нами предложен экспресс-метод изучения микроструктуры мышечных волокон в нативных препаратах мяса, раздавленных между стеклами компрессориума в тонкие срезы и окрашенных гематоксилин-эозином.

Из образца мясного или рыбного сырья отбирают пробу массой 20 грамм, зафиксировав ее пинцетом. Изогнутыми ножницами, направляя их лезвия выпуклой стороной наружу, делают 5 тонких срезов по ходу мышечных волокон размером 1 см длиной и 2 мм толщиной. Далее раскладывают их при помощи препаровальных игл на нижнем стекле компрессориума с промежутками между ними не менее 1 см. Аккуратно накрывают срезы верхним стеклом, отводя его относительно нижнего стекла максимально на себя, прижимают стекла с усилием друг к другу и сдвигают их в обратном направлении, сохраняя сжатие до исходного положения. Стекла фиксируют винтами, тем самым придавая мышечным срезам тонкую необходимую конфигурацию, доступную для просмотра структуры мышц в световом луче микроскопа.

Далее раскручивают винты, осторожно препаровальными иглами снимают раздавленные срезы и помещают их на дно фарфоровой чашки, после чего подвергают их окраске их гематоксилин-эозином. Сначала в фарфоровую чашку со срезами добавляют 3-4 капли квасцового гематоксилина Эрлиха и выдерживают окраску им в течение 3-4 минут. Далее промывают срезы в воде в течение 2 минут до обесцвечивания смываемой воды и для наиболее полного удаления гематоксилина срезы опускают в 1% раствор соляной кислоты до появления слабо-розовой окраски, затем помещают их в 1% раствор аммиака до синего окрашивания жидкости и промывают водой в течение 2 мин. Затем мышечные срезы обрабатывают 1% водно-спиртовым раствором эозина в течение 1 мин и вновь промывают водой.

После этого окрашенные срезы при помощи препаровальных игл, разравнивая, по одному помещают на нижнее стекло компрессориума, на срезы добавляют по 1 капле 50% водного раствора глицерина и фиксируют мышечную ткань, верхним стеклом слегка придавливая его и закручивая винтами. Подготовленный таким образом микропрепарат доступен для микроскопии и оценки структуры элементов мышечных волокон.

Мышечные срезы из мяса птицы окрашивают смесью красителей, состоящей из 1% спиртового раствора метиленового синего, 1% спиртового раствора эозина и водного раствора метиленового синего с бурой в течение 30 минут, после чего промывают водой до обесцвечивания смываемой жидкости.

Для оценки эффективности предложенного экспресс-метод изучения микроструктуры мышечных волокон в нативных препаратах мяса проводили сравнительный анализ результатов данного метода с результатами, полученными при применении органолептических методов и гистологического метода.

При органолептических исследованиях мяса оценивали внешний вид, цвет, состояние мышц на поверхности и разрезе, консистенцию, запах, прозрачность и аромат паров бульона при помощи пробы варкой.

Внешний вид и цвет определяли визуальным осмотром, сразу после разреза мышц в глубоких слоях. При этом обращали внимание на наличие липкости мяса с поверхности и его увлажненности на разрезе путем прикладывания к поверхности разреза фильтровальной бумаги и оценке влажных следов, остающихся на ней. Консистенцию мяса определяли, надавливая на его поверхность шпателем и наблюдая за скоростью выравнивания образовавшейся ямки. Запах оценивали с поверхности, а также в глубинных слоях при разрезе, особое внимание обращали на запах мяса, прилегающего к кости. Кроме того, устанавливали цвет, запах и консистенцию жира, сжимая и растирая его между пальцами.

Для постановки пробы варкой мясо измельчали ножницами до состояния фарша, при этом отделяли соединительную и жировую ткань и брали навеску 20 гр., помещали в коническую колбу на 100 см³, добавляли 60 см³дистиллированной воды, колбу накрывали часовым стеклом, ставили на водяную баню и нагревали до температуры 80-85ºС. При появлении первых паров бульона оценивали его запах, отмечали специфичность, наличие посторонних запахов, кислого или гнилостного запаха. Прозрачность бульона, присутствие в нем хлопьев, оценивали в проходящем свете, переливая бульон в мерный цилиндр.

Изготовление гистологических препаратов проводили в соответствии с ГОСТ 19496-2013 «Мясо и мясные продукты. Метод гистологического исследования».

1.2 Результаты исследований

При микроскопии гистологических препаратов охлажденного мяса и рыбы на поперечном разрезе мышечных волокон обнаруживали чёткую и ровную структуру ткани, целостные мышечные волокна (рисунок А. 1, 2).

При микроскопии гистологических препаратов дефростированного сырья установили, что такие показатели как структура мышечной ткани, определяемая количеством разрывов мышечных волокон, наличие пустот внутри мышечных волокон и между ними, утолщенных мышечных волокон регистрировались в каждом образце (рисунок А. 3, 4), в то время как в аналогичных препаратах, изготовленных из охлажденной продукции подобные морфологические изменения встречались в единичных случаях либо не обнаруживались в материале.

Проводя анализ полученных значений, было установлено, что количество утолщений миофибрилл в дефростированной продукции составило 5,55, что на 259% больше, чем в охлажденной; количество пустот внутри мышечных волокон и между ними – 2,67, на 256,78%, больше, чем в охлажденном сырье; количество разрывов мышечных волокон дефростированного мяса и рыбы составило 41,24, что превышает данное значение у охлажденной продукции в 15,3 раза. Полученные значения статистически значимы — р<0,0001 (таблица 1).

Таблица 1 – Морфологические характеристики мышечной ткани в гистологических препаратах охлажденных и дефростированных образцов мяса и рыбы (М±m, n=69)

Характеристика	Охлажденная продукция (контроль)	Дефростированная продукция
Количество разрывов мышечных волокон, ед./20 п.з.	2,69±0,21	41,21±1,01*
Количество пустот внутри мышечных волокон и между ними, ед./20 п.з.	1,04±0,12	2,67±0,13*
Утолщения миофибрилл, ед./20 п.з.	2,14±0,13	5,55±0,17*
*р<0,0001 — статистически значимое отличие от контроля

В препаратах, изготовленных нами из мяса и рыбы, отчетливо видны мышечные волокна с поперечной исчерченностью, плотно прилегающие друг к другу (рисунок Б. 5,17). Цитоплазма окрашивается эозином в розово-красный цвет, просматриваются ядра мышечных клеток, окрашенные гематоксилином Эрлиха в фиолетовый цвет. То есть, при микроскопии нативных препаратов, изготовленных предложенным способом, просматриваются основные структурные элементы мышечной ткани, позволяющие проводить ветеринарно-санитарную экспертизу мяса.

При оценке структуры мышечной ткани охлажденной мясного и рыбного сырья, не подвергшейся замораживанию, установили, что мышечные волокна целостные, располагаются параллельно друг к другу, структура ткани сохранена. При соответствующей фокусировке объектива микроскопа в мышечных клетках просматриваются ядра. Окончания мышечных волокон в срезах ровные, обрывистые (рисунок Б. 5,6,7,8) [19].

В нативных препаратах из охлажденного мяса птицы, окрашенных препаратах смесью красителей, состоящей из 1% спиртового раствора метиленового синего, 1% спиртового раствора эозина и водного раствора метиленового синего с бурой, просматривается поперечнополосатая мышечная ткань. Цитоплазма окрашивается в бледно-синий цвет, также просматриваются ядра мышечных волокон, окрашенные в темно-синий цвет. Мышечные волокна располагаются плотно, однонаправлено по отношению друг к другу, структура ткани сохранена. Окончания мышечных волокон ровные, обрывистые (рисунок Б.9,10).

В нативных препаратах дефростированных мяса и рыбы установили нарушение структуры мышечной ткани, волокна располагались хаотично, с разрывами и нарушением единого направления (рисунок Б. 11, 12). Кроме того, на окончаниях мышечных волокон обнаруживали утолщения (рисунок Б. 13, 14, 15, 16, 17, 18). Такие образования объясняются ослаблением саркоплазмы в результате замерзания и последующего оттаивания, выходом ее за пределы мышечных клеток, чему способствует сдавливание при изготовлении срезов.

При исследовании нативных препаратов из дефростированного мяса птицы нами было установлено, что мышечного волокна имеют вид разорванности. Окончания мышечных волокон набухшие, закругленные с обоих концов (рисунок Б. 19) [19].

При анализе результатов микроскопии нативных препаратов мяса и рыбы установили, что количество разволокненных участков мышечной ткани в дефростированной продукции в 11,3 раза больше, чем в образцах охлажденной; разрывов мышечных волокон – в 47 раз. Ярким идентификационным признаком, позволяющим дифференцировать термическое состояние мясного и рыбного сырья в нативных препаратах является наличие утолщений на окончаниях мышечных волокон, которые отсутствуют в препаратах из охлажденного материала. Полученные значения статистически значимы — р<0,0001 (таблица 2).

Таблица 2 – Результаты оценки нативных препаратов охлажденных и дефростированных образцов мяса и рыбы (М±m, n=69)

Показатель	Охлажденная продукция (контроль)	Дефростированная продукция
Участки разволокненности мышечной ткани	0,43±0,09	4,84±0,28*
Разрывы мышечных волокон	0,27±0,07	12,69±0,61*
Утолщение окончаний мышечных волокон	отсутствуют	20,33±0,41
*р<0,0001 статистически значимое отличие от контроля

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с действующим законодательством свободная реализация повторно замороженного мяса в нашей стране запрещена, и такая продукция должна быть направлена на промышленную переработку, что влечет за собой экономические потери для владельца мясного сырья. В результате нарушения условий транспортировки, хранения, а также несоблюдение требований при реализации мяса либо при намеренных действиях продавцов, выдающих замороженное мясо за охлажденной, возрастает вероятность присутствия в торговой розничной сети фальсифицированного по термическому состоянию мяса.

Идентификация термического состояния мяса и рыбы в современных условиях пищевой промышленности и экономической деятельности несет определяющее значение в обеспечении продовольственной безопасности и защиты интересов потребителей. Гистологическое исследование наиболее информативно, достоверно позволяет дифференцировать охлажденную мясную и рыбную продукцию на любом этапе ее обращения. Кроме того, данный метод по интенсивности автолитического распада и разволокнения мышечных волокон в виде зернистой массы, и, соответственно, сохранению восприятия окраски составными элементами ткани позволяет установить степень созревания мяса. В мясных продуктах при микроскопии гистологических препаратов возможно также идентифицировать компонентный состав, включая ингредиенты растительного происхождения, субпродукты, пряности и др. Однако данная методика не предусматривает определение термического состояния мяса, установления факта предшествующего замораживания или неоднократной дефростации поскольку выполняется длительный период времени, порой превышающий срок хранения охлажденного мяса.

Результаты исследований указывают на возможность использования метода микроскопии нативных препаратов мышечной ткани с целью идентификации термического состояния мяса различных видов животных. Обработка мясного сырья низкими температурами приводит к структурным изменениям мышечных волокон, которые визуализируются в препаратах, изготовленных компрессорным методом и окрашенных гематоксилин-эозином и включают в себя нарушение целостности волокон, наличие их множественных разрывов, а также выход саркоплазмы за пределы мышечных клеток.

Данный метод легко и быстро воспроизводим, не требует дорогостоящего оборудования и специальных навыков и может быть повсеместно применим для идентификации дефростированного мяса сельскохозяйственных, промысловых животных и предотвращения выпуска в реализацию фальсифицированной охлажденной продукции, в том числе при осуществлении входного контроля мясного сырья в местах его хранения и реализации, на перерабатывающих предприятиях, в лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизы продовольственных рынков.

Полученные результаты исследований позволяют использовать предложенный метод изготовления и микроскопии нативных препаратов мяса и рыбы и устанавливать предшествующее замораживание продукции. Идентификационными критериями при этом являются нарушение структуры мышечной ткани, что проявляется наличием разволокненных участков, разрывы мышечных волокон, а также наличие утолщений на окончаниях мышечных волокон [21, 22].

Предлагаемый метод позволит проводить идентификацию охлажденной и замороженной продукции как при входном контроле мясного сырья на перерабатывающих предприятиях и в лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизы продовольственных рынков, так и в местах реализации продукции, что может упростить систему контроля обращения мяса, обеспечивая продовольственную безопасность в соответствии с действующим законодательством.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Доктрина продовольственной безопасности Российской Федерации, утв. Указом Президента Российской Федерации от 30.01.2010 г. № 120. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/902195504. Дата обращения: 15.01.2020.
2. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013). [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/499050564.Дата обращения: 15.01.2020.
3. Калюжная Т.В. Ветеринарно-санитарная экспертиза и оценка мяса нутрии при различных температурно-влажностных режимах хранения / Т.В. Калюжная // – Международный вестник ветеринарии. – 2019. – № 2. – С. 86-92.
4. Орлова Д.А., Терехов А.А., Хорева М.В. Ветеринарно-санитарная экспертиза баранины на продовольственном рынке / Д.А. Орлова, А.А. Терехов, М.В. Хорева // Инновационное развитие. 2017. № 12 (17). С. 232-234.
5. Хвыля С.И., Корешков В.Н., Лапшин В.А., Гиро Т.М., 2019. Влияние неоднократного замораживания — размораживания на качество мясного сырья. Холодильная техника. №1, 46-49.
6. Калюжная Т.В. Послеубойная ветеринарно-санитарная экспертиза и идентификация продуктов убоя нутрии / Т.В. Калюжная // – Международный вестник ветеринарии. – 2018. – № 3. – С. 101-104.
7. Shchebentovska O.et all. Criteria to determine the freshness of chicken meat using biophysical and morphological methods / O.Shchebentovska, O.Yaremkevysh, O.Karpenko, V.Novikov// Біологіятварин. — 2015. — Т. 17. — № 4. – P. 136-144.
8. Xiong, Z.et all. Applications of emerging imaging techniques for meat quality and safety detection and evaluation: A review / Z.Xiong, D.-W.Sun, H. Pu, W.Gao, QDai // — Critical Reviews in Food Science and Nutrition. – 2017. — № 57(4), Р. 755-768.
9. Zhu, S., Ramaswamy, H.S., Simpson, B.K., 2004. Effect of high-pressure versus conventional thawing on color, drip loss and texture of Atlantic salmon frozen by different methods. Food Science and Technology. 37 (3), 291-299.
10. ГОСТ 19496-2013 Мясо и мясные продукты. Метод гистологического исследования. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/1200107317. Дата обращения: 15.01.2020.
11. Хвыля С.И. Гистологический метод оценки влияния замораживания и хранения на микроструктуру мяса / С.И.Хвыля// Холодильная техника. — 2016. — № 11. — С. 44-47.
12. Орлова Д.А., Калюжная Т.В., Дрозд А.В. Оценка микрокартины нативных препаратов мышечной ткани при ветеринарно-санитарной экспертизе мяса / Д.А. Орлова, Т.В. Калюжная, А.В. Дрозд // – Международный вестник ветеринарии. – 2019. – № 2. – С. 62-67.
13. Хвыля С.И., Пчелкина В.А. Стандартизованные гистологические методы исследования мяса и мясных продуктов / С.И.Хвыля, В.А.Пчелкина // Мясная индустрия. — 2013. — № 7. — С. 28-31.
14. Bozzetta, E., Pezzolato, M., Cencetti, E., Varello, K., Abramo, F., Mutinelli, F., Ingravalle, F., (…), Teneggi, E., 2012. Histology as a valid and reliable tool to differentiate fresh from frozen-thawed fish. Journal of Food Protection, 75 (8), pp. 1536-1541.
15. Хвыля С.И., Пчелкина В.А., Бурлакова С.С. Применение гистологического анализа при исследовании мясного сырья и готовых продуктов / С.И.Хвыля, В.А.Пчелкина, С.С.Бурлакова// Техника и технология пищевых производств. — 2012. — № 3 (26). — P. 132-138.
16. Popelka P., Nagy J., Pipová M., Marcinčák, S., Lenhardt, L., 2014. Comparison of chemical Microbiological and histological changes in fresh Frozen and double frozen rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Acta Veterinaria Brno. 83 (2), 157-161.
17. Tinacci L., Armani А., Guidi A., Nucera D., Shvartzman D., Miragliotta V., Coli A., Giannessi E., Stornelli M. R., Fronte B., Iacovo F., Abramo F., 2018. Histological discrimination of fresh and frozen/thawed fish meat: European hake (Merluccius merluccius) as a possible model for white meat fish species. Food Control. 92, 154-161.
18. Orlova D.A., Kalyuzhnaya T.V., Tokarev A.N., Smirnov A.V., Smolkina A.S., 2019. Morphological features of the meat of various species of animals in assessing the thermal state. Indo American Journal of Pharmaceutical Sciences. Т. 6. №6, 11756-11760.
19. Kalyuzhnaya T., Orlova D., Tokarev A., Kuznetsov Yu., 2019. Development of an algorithm for identifying the thermal state of meat and fish raw materials. International Journal of Recent Technology and Engineering. Т. 8. № 4, С. 7952-7954.
20. Токарев А.Н. Сравнение микрокартины мышечных волокон охлажденного и замороженного мяса птицы / А.Н. Токарев, В.А. Лашкова, Д.А. Орлова, Т.В. Калюжная // Международный вестник ветеринарии. — 2019. — № 4. — С. 101-105.
21. Tokarev A., Lashkova V., Orlova D.A., Kalyuzhnaya T., Drozd A., 2019. A new express method for determination of the thermal state of poultry meat. International Transaction Journal of Engineering, Management and Applied Sciences and Technologies. Т. 10. № 14, С. 188.
22. Kalyuzhnaya T., Karpenko L., Orlova D., Drozd A., Urban V. An express assessment method for meat quality and safety, 2020. International Transaction Journal of Engineering, Management and Applied Sciences and Technologies. Т. 11. № 1, С. 11A01H.

Приложения