РЕФЕРАТ

Отчет 137 с., 2 части, 31 таблица, 17 рисунков, 85 источников.

БАКТЕРИОФАГ, БАКТЕРИИ, PSEUDOMONAS SYRINGAE, ФИТОПАТОГЕН, БИОПРЕПАРАТ, БИОКОНТРОЛЬ, ИНДИКАЦИЯ, ПОЧВА, СЕМЕННОЙ МАТЕРИАЛ, СВОЙСТВА, ПАРАМЕТРЫ ПРИМЕНЕНИЯ

Объектами исследования являются нативные и искусственно контаминированные бактериями Pseudomonas syringae пробы семенного материала, почвы, воды, растительной продукции. Подбор параметров индикации Pseudomonas syringae проводился с использованием оригинальных гомологичных бактериофагов.

Цель работы – разработать экологически безопасный биологический препарат на основе специфических бактериофагов, который позволит проводить биоконтроль растений на наличие бактерий Pseudomonas syringae на разных стадиях (посевной материал, в период вегетации и при хранении).

В результате исследований:

— сконструирован фаговый биопрепарат на основе наиболее производственно-перспективных фагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae;

— произведен подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов;

— разработана пилотная технология получения экспериментального фагового биопрепарата, позволяющая нарабатывать средство для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae с высоким титром фаговых частиц, включающая многоступенчатую схему контрольно-испытательных мероприятий;

— разработана методология индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции методом постановки реакции нарастания титра фага;

— изучена эффективность применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции; на основании полученных данных определена степень распространения бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства;

— разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю экспериментальной серии фагового биопрепарата и методические рекомендации по его применению для индикации в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Сельскохозяйственным предприятиям предложен новый биопрепарат на основе консорциума 2 бактериофагов Ps.s-7 и Ps.s-27 серии УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae, для индикации фитопатогена в объектах внешней среды и объектах растениеводства и разработана методика его применения.

ВВЕДЕНИЕ

Pseudomonas syringae — это видовой комплекс фитопатогенов, поражающий более 180 видов растений. Pseudomonas syringae являются причиной заболеваний многих важных для человека культурных растений, что ведет к значительному экономическому ущербу [1].
Среди болезней, которые они вызывают, различают опухолевые новообразования, гниение, прекращение роста и гибель части растения без загнивания, хлороз, некроз [2,3,4,5].

Заболевания растений, вызываемые Pseudomonas syringae трудно контролировать из-за высокой частоты мутаций, горизонтального переноса генов и видоспецифической изменчивости [2,6,7]. Никаких специфических антимикробных средств в настоящее время не разработано. Бесконтрольное воздействие химических веществ, применяемых для дезинфекции в растениеводстве, может привести к развитию устойчивости у данных бактерий [8,9,10].

В настоящее время перспективным направлением для контроля бактериальных заболеваний растений являются бактериофаги. Бактериофаги (фаги) — это вирусы, которые заражают бактерии, используя их метаболизм для завершения своей репликации, что приводит к лизису их бактериального хозяина, не причиняя прямого вреда растениям или животным. Фаги являются одним из наиболее распространенных типов организмов в биосфере и почти всегда очень специфичны для своего целевого бактериального хозяина. В настоящее время потенциал использования бактериофагов для биологического контроля Pseudomonas syringae активно изучается рядом исследовательских групп [11,12,13]. Литическая природа фага, высокая степень специфичности к хозяину, способность сохраняться и размножаться в окружающей среде делают бактериофаги потенциальными кандидатами для биоконтроля фитопатогенов [14 — 20].

Цель работы – разработать экологически безопасный биологический препарат на основе специфических бактериофагов, который позволит проводить биоконтроль растений на наличие бактерий Pseudomonas syringae на разных стадиях (посевной материал, в период вегетации и при хранении).

Задачи:

1. Конструирование фагового биопрепарата на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующихся определенными биологическими свойствами (максимально широкий спектр литического действия и явно выраженная специфичность, максимально высокий титр литической активности при хранении, устойчивость к факторам внешней среды, отсутствие в геноме производственно-перспективных бактериофагов «локусов патогенности»).

2. Подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов (разработка количественных и качественных параметров культивирования, подбор методики очистки биопрепарата, контроль стерильности).

3. Разработка технологической схемы наработки экспериментальной партии биопрепарата.

4. Разработка методологии индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции.

5. Изучение эффективности применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции.

6. Разработка нормативно-технической документации на сконстуированный фаговый биопрепарат Pseudomonas syringae и методические рекомендации по его применению в растениеводстве.

Новизна научных исследований

Впервые проведены исследования по разработке экологичного и высокоэффективного фагового биопрепарата для индикации бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства, который позволилит в перспективе снизить производственные потери в растениеводстве от фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae за счет своевременного выявления возбудителя.

Полученные результаты помогут в перспективе сформировать теоретические и практические предпосылки для создания нового для Российской Федерации класса технологических вспомогательных средств на основе бактериофагов – безопасного продукта для биоконтроля фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae, вызывающих опухолевые новообразования, гниение, прекращение роста и гибель части растения, хлороз, некроз.

Сформирована и адаптирована многоступенчатая схема контрольно-испытательных мероприятий нового средства для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Усовершенствована пилотная технология получения фагового биопрепарата, позволяющая нарабатывать средство для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae с высоким титром фаговых частиц.

Бактериофаги, входящие в состав биопрепарата, специфичны для фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae, не подавляют рост пробиотических штаммов и нормофлору растения и ризосферы. Что позволит, в перспективе, снизить количество применяемых при производстве средств химической защиты растений, сохранить урожай и получить органическую (экологически чистую) продукцию.

Теоретическая и практическая значимость полученых результатов

Получены данные о биологических свойствах бактериофагов, специфичных для бактерий Pseudomonas syringae, включая их молекулярно-генетическую характеристику (литическая активность, спектр литического действия и специфичность, влияние факторов внешней среды, урожайность и скорость адсорбции; дана молекулярно-генетическая характеристика).

Получены данные о степени распространения бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Сконструирован фаговый биопрепарат, активный в отношении фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae, имеющий высокий титр и срок хранения в течение 1 года.

Подобраны максимально эффективные методы индикации бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Разработана нормативно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Pseudomonas syringae» и «Методические рекомендации по индикации бактерий Pseudomonas syringae».

Сельскохозяйственным предприятиям предложен новый биопрепарат на основе консорциума 2 бактериофагов Ps.s-7 и Ps.s-27 серии УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae, для индикации фитопатогена в объектах внешней среды и объектах растениеводства и разработана методика его применения.

Внедрение результатов НИР

В процессе исследования получен биопрепарат на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующийся определенными биологическими свойствами — максимально широкий спектр литического действия и выраженная специфичность, максимально высокий титр литической активности при хранении, устойчивость к факторам внешней среды, отсутствие в геноме производственно-перспективных бактериофагов «локусов патогенности».

Известно, что вышеназванные микроорганизмы наносят значительный экономический ущерб российскому растениеводству. Разработка методологии индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции позволяет сократить экономические потери, так как в течение 24 часов лаборатория, оснащенная ламинарным боксом, термостатом, водяной баней и бытовым холодильником, может достоверно определить наличие этого микроорганизма в пробе.

Фаговый биопрепарат Pseudomonas syringae представляет собой прозрачную жидкость от светло-желтого до желтого цвета, розлитую в стеклянные флаконы под резиновую пробку и алюминиевый колпачок объемом 100-500 мл, титр фага не менее 10⁸ БОЕ/мл, условия хранения: 2-4 ⁰С в течение 12 месяцев при относительной влажности воздуха 70-80 %, при транспортировании необходимо учитывать хрупкость упаковки.

Полученные в результате исследований данные используются в учебном процессе обучающихся по направлениям подготовки:

— 35.03.03 Агрохимия и агропочвоведение (высшее образование — бакалавриат);

— 35.04.03 Агрохимия и агропочвоведение (высшее образование — магистратура);

— 35.03.04 Агрономия (высшее образование — бакалавриат);

— 35.04.04 Агрономия (Высшее образование — магистратура);

— 06.01.04 Агрохимия (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации);

— 06.01.01 Общее земледелие, растениеводство (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации);

-35.02.06 Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции (среднее профессиональное образование – программа подготовки специалистов среднего звена);

-35.03.07 Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции (высшее образование — бакалавриат);

— 06.04.01 Биология (высшее образование — магистратура);

— 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации);

— 03.02.03 Микробиология (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации).

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ОТЧЕТА НИР

1 Обзор литературных источников

1.1 Бактериальные патогены растений – как глобальная проблема

По данным Всемирного банка, население планеты, как ожидается, достигнет более 9,6 миллиарда человек к 2050 году, что неизбежно увеличит спрос на продовольствие примерно на 59%–98% [21]. Хотя Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций (ФАО) стремится решить проблему голода к 2030 году, продовольственная безопасность несколько снизилась с 2015 года из-за изменения климата, конфликтов и вредителей. По данным ФАО, на вредителей приходится ежегодные потери до 40% продукции растениеводства, что обходится мировой экономике в более чем 290 миллиардов долларов. Как таковые, эти вредители не только создают угрозу продовольственной безопасности и экономике, но и представляют собой значительную часть ограниченных ресурсов нашей планеты, которые теряются. В этой связи борьба с вредителями имеет решающее значение для перехода сельского хозяйства к большей устойчивости [22].

Многие экономически важные продовольственные культуры, включая рис, картофель, помидоры, капусту, бананы, оливки и цитрусовые, страдают от бактериальных инфекций, на которые, как полагают, приходится 5-10% потерь урожая [23]. Традиционно химические вещества используется для защиты этих культур от бактериальных заболеваний.

Однако бактериальные патогены растений уже сегодня приобрели устойчивость к биоцидам на основе меди [24,25], перекиси водорода [26] и другим химическим веществам, включая антибиотики, такие как стрептомицин [27].

Поэтому стратегии борьбы с болезнями часто могут сдерживать вспышки только путем сосредоточения внимания на профилактике. Кроме того, в связи с возросшей осведомленностью об их воздействии на окружающую среду и здоровье человека широкая общественность и правительства требуют, чтобы химические вещества были ограничены или, предпочтительно, заменены альтернативой (Директива ЕС 2009/128/EC). В связи с этим бактериофаги снова привлекли внимание со стороны научных кругов и промышленности в качестве агентов биологического контроля фитопатогенов [28-29].

1.2 Фаговый биоконтроль – современное состояние

Концепция использования фагов в качестве средств защиты растений не нова. На самом деле первые попытки датируются 1924 годом, когда Hemstreet и Mallmann [30] использовали фильтрат разлагающейся капусты, содержащий фаг, для лечения Xanthomonas campestris pv. campestris. Эта бактерия по-прежнему представляет всемирную угрозу для производства крестоцветных культур, таких как цветная капуста, брокколи и другие [31]. Однако по мере того, как химические биоциды становились легкодоступными и имели более широкий диапазон применения, они становились более простыми в использовании и интерес к фаговому биоконтролю значительно ослаб [32]. С начала 21-го века фаговый биоконтроль вновь приобрел интерес, движимый достижениями в области биотехнологии, о чем свидетельствует растущее число публикаций, патентов и патентных заявок [29].

На сегодняшний день в мире представлено более 20 биопрепаратов для биоконтроля фитопатогенов на основе фагов, протестированных илиапробированных в крупномасштабных испытаниях. Многие исследования были проведены для небольшого числа потосистем в течение последних трех лет с особым акцентом на Pectobacterium, Ralstonia, Pseudomonas и Xanthomonas. Патосистема определяется как отношение между растением и конкретным патогеном, например, Pectobacterium atrosepticum-картофель или патосистема Xanthomonas oryzae-рис [33]. Для каждого исследования суммируются применяемые бактериофаги, рассматриваемый патоген, вызываемое им заболевание, стратегии применения, дозировка препарата и основные результаты борьбы с заболеванием. Большинство исследований показывают значительное снижение развития симптомов заболевания, доказывая потенциал биоконтроля на основе фагов.

Интересно, что диверсификация стратегии применения фагов может наблюдаться в различных исследованиях, в основном следуя стратегии заражения. Для биоконтроля Pectobacterium или Dickeya, в литературе основное внимание уделяется послеуборочной обработке продукции и посевного материала, так как это один из моментов развития инфекции [34-38]. С другой стороны, контроль Ralstonia показывает оптимальные результаты, когда фаги доставляются в почвенные системы [39-41]. Это еще больше подчеркивается в патосистеме дыни- Acidovorax, в которой обработка почвы также увеличивает количество жизнеспособных семян [42]. Более того, те же авторы описывают профилактическую обработку семян на основе фагов для этой патосистемы, которая способна ограничить воздействие патогена [43]. Эта стратегия применения была опробована и на других культурах, таких как картофель, кукуруза, лук-порей и рис [44-46]. Для последних обработка семян превосходит обработку распылением с уменьшением симптомов на 95,4%-83,1% соответственно [46]. Наконец, для борьбы с болезнями, которые в основном проявляются на уровне филосферы, такими как Pseudomonas, ученые в первую очередь описывают успешные методы лечения распылением снижающие титр бактерий и развитие симптомов [47-49]. Таким образом, определенно существует связь между жизненным циклом и средой обмтания бактерий и оптимальным применением фаговой обработки (например, различные типы обработки необходимы для почвенных бактерий, таких как Ralstonia solanacearum, по сравнению с эпифитами/язвообразующими бактериями, такими как Pseudomonas syringae). Это также демонстрирует, что продолжающиеся усилия по разработке и адаптации методов фагового биоконтроля в соответствии с этой и другими специфическими особенностями не теряют актуальности.

Так же, исходя из проанализированной информации, можно утверждать, что детальное понимание биологии патогена и фага необходимо для внедрения эффективного фагового биоконтроля в растеневодстве.

1.3 Место бактериофагов в растеневодстве и перспективы применения

Как правило, стратегии комплексной защиты растений (IPP) включают передовые методы, позволяющие в первую очередь предотвращать вспышку заболевания, раннее обнаружение и тщательный мониторинг потенциальных инфекций, использование адекватных, но достаточных доз предпочтительно биологических обработок и оценку эффективности [57]. В IPP взаимодействие (-и) с патогеном (-ами) растение считается ключевым, поскольку эта взаимосвязь очень специфична и варьируется между этим разнообразием и инфекционностью фага. Однако помимо конструирования оптимального коктейля фагов, понимание биологии патогена, то есть их биологического разнообразия, основного источника инфекции и пути заражения, имеют решающее значение для разработки любой целевой стратегии IPP на основе фагов.

1.4 Влияние биоразнообразия патогенов и путей заражения для определения оптимальной стратегии применения

Детальное понимание разнообразия патогенов и взаимодействия растений и бактерий включает в себя выделение репрезентативной коллекции штаммов и их характеристику на уровне генома, а также сопоставление филогенетических данных с метаданными, включая, например, региональное местонахождение и период выделения [59]. Например, недавнее филогенетическое исследование Xanthomonas oryzae pv. oryzae показало, что внутри этого бактериального подвида существует шесть различных групп с различными генотипическими характеристиками [60,61]. При разработке фагового коктейля против этого патогена и многих других фитопатогенов, необходимо принимть во внимание это внутривидовое разнообразие, которое имеет решающее значение для обеспечения эффективной работы фагового коктейля против наиболее релевантных патогенных штаммов в данном географическом местоположении [23,62]. Более того, такие данные, связанные с вирулентностью конкретных штаммов, позволили бы рационально разрабатывать предложеия специально для наиболее инвазивных штаммов в этом регионе. Информация о сроках появления этих высоковирулентных штаммов потенциально позволит идентифицировать источник инфекции и остановить заболевание на ранней стадии. Поэтому определение источника инфекции и регулярный мониторинг необходимы для предотвращения вспышки и дальнейшего распространения болезни в интенсивном сельском хозяйстве.

На рисунке 1 представлен схематический обзор наиболее распространенных стратегий заражения, используемых фитопатогенами, и того, как фаги могут вмешиваться на разных стадиях при рациональном проектировании стратегии применения. Рационально разработанные стратегии защиты растений должны быть направлены на предотвращение неконтролируемого размножения вредителя путем непосредственного взаимодействия с его жизненным циклом, ограничивая при этом влияние на текущую и будущую сельскохозяйственную практику.

Рисунок 1 — Обзор наиболее распространенных путей заражения растений патогенными бактериями (красные стрелки) и способов рационального применения фагов (зеленые стрелки).

(а) Бактерии, такие как Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, Xanthomonas campestris pv. campestris или Acidovorax citrulli способны заражать семена. Здесь целенаправленное обеззараживание семян на основе фагов может служить инструментом борьбы с болезнью.

(b) Многие культуры сначала выращиваются в питомниках, а затем пересаживаются в поле. Рассаду и молодые растения выращивают при относительной высокой влажности и в непосредственной близости. Следовательно, болезни могут легко распространяться от одного растения к другому. Фаги могут применяться в таких условиях, чтобы защитить соседние растения от возможность заражения и сдерживать распространение бактерий после высадки рассады.

(с.1.) Насекомые — известные носители множественных заболеваний, вызываемых фитоплазмами, Xylella fastidiosa и Candidatus liberibacter spp. (с.2.) Загрязненная вода с соседних растений и зараженная почва способствуют распространению патогенов. Часто, бактерии используют несколько путей заражения, чтобы проникнуть в ткани листа. (c.3.) Физические повреждения и ранения являются идеальной отправной точкой для бактерий, колонизирующих растение. (c.4.) Патогены, такие как Ralstonia solanacearum и другие, заражаются растения через загрязненную почву и воду. В этих системах, фаги могут применяться в качестве добавки и/или обработки почвы для защиты или лечения заболеваний.

(d.1.) Бактерии, такие как Erwinia amylovora, способны заражать цветы и соцветия, поднимая опылителей и брызги воды, тогда как другие (d.2.) Проникают в зародыши семян, чтобы произвести зараженные. Здесь возможны прямые внесения, а опылители могут действовать как энтомовекторы для доставки фагов.

1.5 Подбор фагового коктейля и его значение для патоген-фаговых взаимодействий

Для разработки устойчивой стратегии биоконтроля фагов сначала необходимо выделить разнообразный и взаимодополняющий набор фагов. Глубокое молекулярное понимание геномики этих вирусов необходим для обеспечения их безопасности для применения в сельском хозяйстве [63,64]. Кроме того, следует позаботиться о предотвращении развития резистентности бактерий к фагу. Так как механизмы бактериальной резистентности к фагам чрезвычайно разнообразны [65,66]. Однако развитие резистентности в основном наблюдается в стандартных (богатых питательными веществами) лабораторных условиях, но в меньшей степени у растений. Одним из способов развития резистентности бактерий является потеря или модификация внешних мембранных структур [67,68], что является ключевой особенностью дизайна коктейлей. Устойчивость бактерий к коктейлю из фагов может возникать и на уровне распознавания рецепторов. Например, при обработке семян фагами [45]. Считается, что использование нескольких фагов, нацеленных на разные рецепторы, может ограничить возникновение этой резистентности, поскольку развитие резистентности часто связано с приспособляемостью. Действительно, Wright и его коллеги показали, что появление устойчивости Pseudomonas aeruginosa PAO1 в лабораторных условиях зависит от стратегии введения фага [69]. При использовании коктейля из 2 фагов, включающего фаги с различными рецепторами, наблюдаемая устойчивость была снижена по сравнению с последовательным использованием фагов, в то время как обе стратегии имели одинаковые затраты. Таким образом, развитие резистентности не обязательно является непреодолимым препятствием (по крайней мере, в краткосрочной перспективе), и на результат резистентности может повлиять рациональная разработка стратегии применения. Остается открытым вопрос, верно ли то же самое для внешней среды. Hernandez и Koskella, обратились к этому, разработав эксперимент, в котором они совместно культивировали патоген растений Pseudomonas syringae pv. Tomato и два фага, в богатой среде и на листьях томата [70]. Они обнаружили, что устойчивость легко приобретается в богатой среде, как и ожидалось. Однако им не удалось выделить из листьев устойчивые к фагам мутанты. Таким образом, они подтвердили предыдущую работу, которая показала, что лабораторно приобретенная устойчивость может возникать из-за преспособляемости [71], и показали, что у растений не возникло альтернативной устойчивости. Однако в настоящее время не существует основы для оценки развития и воздействия потенциальной устойчивости к фагам, и этот аспект следует внимательно учитывать при практическом применении.

1.6 Индивидуальные стратегиям применения фагов

В настоящее время существуют различные варианты применения фагов в зависимости от пути заражения. Однако, применение внекорневой подкормки в открытом грунте представляется довольно ограниченным методом, из-за проблем со стабильностью, вызваемых биотическими и абиотическими стрессами, включая солнечный свет, изменение погодных условий и высыхание [54]. Поэтому предпринимаются попытки по повышению выносливости фагов на листовой поверхности. Born и его коллеги протестировали рецептуру фага Erwinia amylovora Y2 и смогли выявить 28%, 34% и 38% исходного фага после воздействия высокоинтенсивного ультрафиолетового излучения, смешав фаг с 10% морковным соком, 5% соком перцев и 50 mM ароматических аминокислот соответственно. Это гараздо выше по сравнению с 0,21% выявления без предложенной рецептуры [72]. В другом примере GasˇI c et al. повысил стабильность фага Xanthomonas euvesicatoria Kf1, смешав его с 0,75% обезжиренного молока и 0,5% сахарозы. Таким обзаром подготовленная популяция фагов обнаруживалась после шестидесяти дней инкубации в УФ/темном состоянии 16/8 часа, в то время как неподготовленная популяция фагов была необнаружима через сорок дней [55]. Поскольку все фаги состоят из белкового капсида, аналогичные стратегии можно было бы предусмотреть для всех обработок распылнием в открытом поле. Другой подход в этой перспективе был предложен Svircev и др. для борьбы с инфекциями Erwinia amylovora для обработки цветков яблони и груши фагом в полевых условиях [73]. Чтобы минимизировать потерю фагов из-за стрессов, они применяют штаммы-носители фагов Erwinia такие как Pantoea agglomerans для поддержания высокой концентрации фагов in situ для предотвращения распада фагов [74]. Во многих патосистемах зараженные семена считаются одним из основных путей заражения [75]. Следовательно, фаги могут применяться в качестве дезинфекционного этапа при подготовке семян или замачивании для уменьшения развития болезней. Так, искусственно контаминированные Pseudomonas syringae pv. porri семена лика были замочены в растворе фага, после чего происходило снижение бактериального титра [45]. Другой подход в этой перспективе основан на покрытии семян. Например, Kimmelshue et al. снижал бактериальные титры Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis у кукурузы на 76% на семя в семенах контаминированны снаружи и 51% и 78% в семенах, инфицированных изнутри, в семенах и тканях проростков, соответственно [44]. Rahimi получил аналогичные результаты при контроле бактериальной пятнистости плодов дыни. Авторам удалось увеличить всхожесть семян с 13% в семенах без покрытия до 96%, в семенах покрыты фагами [43]. Они также показали, что фаги поглощаются рассадой и возможно использовать такой способ защитить растение от инфекции [42]. Поглощение фагов растениями описано и для других патосистем, таких как яблоки и бобы [76-78]. Эти подходы показывают потенциал бактериофагов в качестве обеззараживающего средства семян.

Кроме того, известно, что некоторые бактериальные заболевания растений распространяются в питомниках и проявляются после пересадки в полевые условия. Тут фаги могут быть применены в качестве обработки почвы для дезинфекции или их можно использовать в качестве профилактической обработки, промочив лотки для растений перед посадкой их в поле или теплицу. Полный потенциал этих методов еще предстоит изучить.

1.7 Интеграция фагового биоконтроля в цифровое земледелие

Современные революции в растениеводстве и сельском хозяйстве вцелом, именуемые умным или цифровым земледелием, включают в себя внедрение новых технологий и приборов. Смартфоны, робототехника, машинное обучение и сенсорные технологии могут быть интегрированы в сельскохозяйственный процесс, что облегчает обнаружение различных фитопатогенов как в тепличных, так и в полевых условиях [35, 79]. Гиперспектральные сенсоры, способны обнаруживать возникающие бактериальные инфекции с точностью до 96%, что позволяет своевременно идентифицировать возбудителя и применять терапию на ранних стадиях [80,81]. Таким образом, лечение может быть направлено конкретно на отдельные больные растения и их соседей. В случае интенсивного вертикального земледелия растения выращивают в гидропонных системах в условиях искусственного освещения с использованием светоизлучающих диодов (светодиодов) в качестве основного источника света. Эти условия идеально подходят для применения фагов, поскольку они не приводят к высыханию фага на поверхности листа, отсутствует воздействие ультрафиолетового излучения и другие абиотические стрессы,присутствующие в поле. Здесь фаги могут быть применены до развития симптомов в качестве профилактического средства в питательном раствор, предотвращающем заболевание, или в виде спрея для лечения потенциально зараженных растений после обнаружения. Шмели и другие энтомовекторы также могут быть использованы для распростронения бактериофагов, как агентов биоконтроля в тепличных условиях [82]. Кроме того, сенсорное обнаружение больных культур также возможно в условиях открытого поля благодаря оптимизации беспилотных технологий и беспилотных автоматизированных транспортных средств [83]. В этом случае больные культуры снова могут быть точно обнаружены в поле и уничтожены во время обработки почвы. Фаговые технологии вместе с другими организмами биоконтроля могли бы служить в этом контексте комплексной стратегией борьбы с болезнями, которую еще предстоит изучить или использовать. Однако такое рациональное использование ресурсов служит экономической и экологической логике, поскольку сокращает количество необходимых обработок. Эффект самоусиления и автоматического дозирования фагов еще больше увеличивает эффективность применения. Автоматизированное прецизионное нанесение также позволяет поддерживать постоянную скорость нанесения, обеспечивая равномерную обработку там, где это необходимо. Кроме того, при обработке только загрязненных культур и применение агентов биоконтроля заболевание может быть сдержано, а риск развития резистентности патогена снижен, поскольку он вводится только локально.

На рисунке 2 представлен схематический обзор полного внедрения фагов в качестве устойчивых агентов биоконтроля в современную сельскохозяйственную практику.

Рисунок 2 — Обзор комплексной стратегии защиты растений на основе фагового биоконтроля. 1. Репрезентативная бактериальная коллекция должна быть создана путем выделения штаммов из больных культур. Филогенетический анализ этих бактерий позволяет оценить общее бактериальное разнообразие. Метаданные о географическом местоположении и периоде ыделения помогают понять географическое распределение штаммов. Кроме того, необходимы данные о вирулентности штаммов, находящихся в коллекции, для определения наиболее релевантных штаммов из коллекции. 2. Коллекция бактериофагов может быть получена из различных зараженных районов. Диапазон хозяев различных фагов должен быть протестирован и соотнесен с бактериальной филогенией, чтобы иметь возможность разработать рациональное применение фагов на основе распределения штаммов. Кроме того, глубокие геномные данные позволяют отбирать на литических фагах те, которые безопасны для использования в сельскохозяйственных условиях. При составлении фагового коктейля коктейль предпочтительно должен состоять из фагов, распознающих различные рецепторы, чтобы ограничить развитие резистентности. 3. В вертикальном земледелии растения выращиваются в полностью контролируемых гидропонных теплицах с использованием светодиодов в качестве основных источников света. Растения можно контролировать с помощью сенсорных методов, позволяющих контролировать рост растений. С этой точки зрения гиперспектральные датчики, могут быть использованы для раннего выявления заболеваний. Как только инфекция обнаружена, и подтверждена уведомление может быть отправлено на смартфон фермера 4. и зараженные растения могут быть уничтожены, а соседние растения обработаны биопестицидом, таким как бактериофаги. 5. Гиперспектральные датчики могут быть прикреплены к БПЛА, которые могут отправить отчет фермеру, что позволит своевременно избавиться от больных культур и рационально обработать зараженный участок.

1.8 Перспективы полноценной вирусо-ориентированной комплексной борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур

Исследования по биоконтролю фагов привели к появлению ряда коммерчески доступных продуктов. В США они зарегистрированы как биопестициды. В отличие от этого, до настоящего времени не зарегистрировано ни одного фагового продукта в Европе или России. На сегодняшний день несколько вирусов насекомых и вирусов растений были зарегистрированы в качестве биопестицидов для борьбы с вредителями (База данных активных веществ для пестицидов растений; URL:https://ec. https://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database/). Кроме того, в пищевом секторе несколько фагов получили статус GRAS от Управления по контролю за продуктами питания и лекарствами США, в том числе Фаги листерий, сальмонелл, эшерихий и шигелл используют как технологические добавки (URL-адрес:https://www.accessdata.fda.gov/scripts/fdcc/). Кроме того, применение фагов Pectobacterium в качестве упаковочного средства для поверхностной стерилизации клубней картофеля после уборки урожая разрешено в пищевой промышленности Европы. Изменения в регистрации фагов в качестве биопестицидов в соответствии с требованиями пищевой промышленности могли бы послужить дополнительным стимулом для полного изучения потенциала бактериофагов. Это даст толчок целенаправленным исследованиям и потенциальной коммерциализации методов борьбы с болезнями на основе фагов.

Все же сегодня отсутствуют устойчивые биологические стратегии борьбы с бактериальными инфекциями в растениеводстве. Предпринимаются усилия для решения этой проблемы путем применения бактериофагов. Предыдущие исследования действительно показали, что фаги перспективны в качестве биоконтролирующего средства для индикации профилактики и лечения бактериальных инфекций. Однако современные цифровые технологии земледелия, до сих пор таят в себе неисследованные и уникальные возможности для внедрения фагового биоконтроля. В последующем необходима полноценная оценка безопасности бактериофагов с точки зрения развития долговременной резистентности и их влияния на природные микробные сообщества. Сбор таких данных будет иметь решающее значение для регулирования и коммерческого внедрения фаговых технологий в современные методы ведения сельского хозяйства.

2 Результаты исследований

2.1 Объекты, материалы и методы исследований

Научная литература, посвященная исследованиям бактериофагов, была проанализирована формально-логическими методами. В работе использованы микробиологические, иммунохимические, молекулярно-генетические и статистические методы исследований.

Для работы со штаммами бактерий и фагами, выделенными из объектов внешней среды были использованы изолированные боксированные помещения для проведения микробиологических исследований.

Обязательными начальными этапами работы было:

— определение спектра чистых культур Pseudomonas syringae — как перспективных штаммов бактерий (т.е. кандидатов в производственные штаммы бактерий);

— определение спектра вирулентных бактериофагов, специфичных для Pseudomonas syringae для конструирования фагового биопрепарата.

Объектами исследования стали 8 бактериофагов активных в отношении Pseudomonas syringae выделенные из объектов окружающей среды: почвы, воды (река, сточные воды) и сельскохозяйственных растений (листья, плоды, стебли).

Для исследований были предусмотрены раздельные микробиологические боксы для работы с производственными бактериальными штаммами и маточными фагами.

При производстве фаговых препаратов проводили валидацию технологического процесса, технологического оборудования, сырья и методов контроля. Все исходные материалы и сырье, используемые при производстве, имело документы, подтверждающие их качество. Производственные питательные среды обладали хорошими ростовыми свойствами и были стерильными.

В экспериментах применяли штамм бактерий Pseudomonas syringae Ps.s № 3 (коллекция музея бактериальных штаммов и бактериофагов кафедры (МВЭ и ВСЭ) микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ); референс-штамм бактерий Pseudomonas syringae В-10917 из коллекции БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика.

Для изучения специфичности бактериофагов были использованы штаммы бактерии: Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Рectobacterium carotovorum, Хanthomonas campestris, Saimonella enteritidis, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Echerichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis.

Термостат (ТСО-1/80) ОАО «Смоленское СКТБ СПУ»; Термометр; Ультрафиолетовая лампа марки «Phillips» с длиной волны 253 нм; Спиртовка; Петля пастеровская; Плитка электрическая; Лабораторная стерильная посуда; Дистиллированная вода; Лабораторные весы; Автоклав (ГК-100-3); Дистиллятор (Liston); генцианвиолет 548-62-9 (ЗАО «Вектон», РФ); Набор реагентов для окраски микроорганизмов по методу Грама (НИЦФ Россия, Санкт-Петербург; ГРМ-агарагар (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск);ГРМ-бульон (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск); Среда Кинга В (Пептон Пептон ферментативныйООО НИЦФ СПБ; Глицерин раствор ОАО Самарамедпром РФ; калий фосфорнокислыйдвузамещенный ГОСТ 4198-75 УлХИМ РФ; магний сернокислый УлХИМ РФ; ГРМ-агарагар (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск)); Оксидазные диски HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Водорода перекись раствор 3% ООО «ЮжФарм». Краснодарский край, Крымский р-н, ст. Троицкая; Аргининовый бульон HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Питательный желатин HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Раствор Люголя (НИЦФ Россия, Санкт-Петербург); Пептон ферментативный ООО НИЦФ СПБ; Натрий хлористый ГОСТ 4233-77 УлХИМ РФ; калий фосфор¬нокислыйдвузамещенный ГОСТ 4198-75 УлХИМ РФ; бромтимоловый синий (HiMediaLaboratoriesPvt.Limited (Индия);Натрий хлористый ГОСТ 4233-77 УлХИМ РФ; Кальций хлористый ГОСТ 450-77 УлХИМ РФ; ГРМ-агарагар (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск);Tween 80 (HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Сахароза (чда) ГОСТ 5833-75УлХИМ РФ; Полоски с реактивом Ковача (на индол) HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Железосодержащий пептонныйагарHiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); питательные среды Гисса (ООО «НПЦ «Биокомпас-С» Россия, г. Углич), хломамин Б, 70 % этиловый спирт, среда Кесслера, среда Эндо, среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон), среда Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон).

Среда CRL содержала следующие компоненты: пептон 12.0 г, глицерин 10.0 г, агар 18.0 г, MgSO4 0.7 г, K2HPO4 2.0 г, KH2PO4 2.0 г, глюкозу 2.5 г, дрожжевой экстракт 2.0 г, мясной пептон 2.0 г, сахарозу 15.0 г, NaCl 2.0 г, CaCO3 20.0 г (реактивы производства PanReac AppliChem, Испания) на 1 л дистиллированной воды. Среда CRL.2 состояла из тех же компонентов, за исключением CaCO3. Все ингредиенты перемешивали, доводили рН 20%-м раствором соляной кислоты до 7,0-7,2 с помощью pH-метра (МР 220, Mettler Toledo, Швейцария) и стерилизовали при температуре 121℃ в течение 15 мин (автоклав MLS-3020U, Sanyo, Япония). Для получения среды mCRL.2 к среде CRL.2 после стерилизации и охлаждения до 50℃ добавляли спиртовой (70%) раствор циклогексимида до его конечной концентрации 200 мг на 1 л среды и водный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) до конечной концентрации 50 мг на 1 л среды.

Изучение биологических свойств фагов проводили по методам, описанным в научных работах (Н.А. Феоктистова и др., 2017; Д.А. Васильев и др., 2017; П.С. Майоров и др., 2020).

Реакция нарастания титра фага – это метод индикации, позволяющий выявить бактериальный агент в анализируемом материале, не выделяя чистую бактериальную культуру (Г.Р. Садртдинова, 2017).

Реакцию нарастания титра фага ставили на пробах почвы (садоводческое общество «Садовод УСХИ» п. Октябьский Чердаклинского района Ульяновской области), семенах огурца «Китайский змей», речной воде (р.Свияга, г.Ульяновск), томатах сорта «Бычье сердце», цуккини сорта «Цукеша», огурцах сорта «Аэлита» на базе кафедры (МВЭ и ВСЭ) микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ). Пробоподготовку осуществляли следующим образом: гомогенизация и последующее разведение анализируемого материала в стерильном физиологическом растворе, используя соотношение 1:10.

При подборе оптимального времени экспозиции компонентов фагового биопрепарата с исследуемой пробой эмпирически подбирали временной диапазон термостатирования с учетом температуры культивирования индикаторной бактериальной культуры. Эксперименты ставили на стерильном МПБ.

Параметры постановки эксперимента:

— исследуемый субстрат вместе с введенным бактериофагом термостатировали при температуре 28±1 0С, не применяя этап «предварительного подращивания», в течение 3,5; 7,0; 15,0; 24,0 часов);

— исследуемый субстрат вместе с введенным бактериофагом термостатировали при температуре 28±1 0С, включая этап «предварительное подращивание», в течение 3,5; 7,0; 15,0; 24,0 часов).

Схема исследования показана в рисунке 3.

Результаты индикации бактерий в анализируемом субстрате методом реакции нарастания титра фага (РНФ) учитывались следующим образом: увеличение на чашке Петри количества негативных колоний фага (бляшкообразующих единиц) по сравнению с контролем в пять и более раз свидетельствует об наличии в опытной пробе искомых бактерий, на которых адсорбировался специфичный им бактериофаг и был зафиксирован цикл его развития (Е.О. Чугунова и др., 2016).

Рисунок 3 – Схема индикации бактерий Pseudomonas syringae с методом реакции нарастания титра фага с использованием изучаемого бактериофагового биопрепарата

Для протеомного анализа нами были использованы ресурсы систем SnapGene Viewer v.4.1.7 и UGENE (v.36).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета программ Statistica Desktop 13 Russian (for Windows; StatSoft Russia (TIBCO USA), Microsoft Excel 2010).

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Конструирование фагового биопрепарата на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующихся определенными биологическими свойствами

Морфологию негативных колоний изучали на плотных питательных средах по методу Грациа. Установлено, что бактериофаги бактерий Pseudomonas syringae на МПА формировали схожие между собой негативные колонии — прозрачные, округлой формы, без зоны вторичного роста диаметром от 5 до 9 мм (рис 4).

Рисунок 4 – Морфология негативных колоний бактериофага Pseudomonas syringae Ps.s-8 УлГАУ

Литическая активность — это свойство фага вызвать лизис бактериальной культуры на плотной (по методу Грациа) или жидкой (по методу Аппельмана) питательной среде. Для получения достоверных результатов такая активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях. В связи с этим, индикаторный штамм Pseudomonas syringae — Ps.s №3, выращивали на стандартном мясопептонном бульоне в течение 18-20 часов и использовали в эксперименте.

Установлено, что бактериофаги проявляли разную литическую активность на культуре бактериальных клеток штамма №3 Pseudomonas syringae. Результаты представлены в таблице 1.

Литическая активность изучаемых бактериофагов Pseudomonas syringae составила по Аппельману от 10-4 до 10-8; по Грациа от 1,0±0,1×106 до 2,0±0,1×109 (БОЕ/мл).

За изменениями литической активности во время хранения наблюдали в течение года, проверяя результаты через каждые 3 месяца. Все фаги хранились в виде фаголизата бульонной культуры в закупоренных стекляных флаконах в условиях холодильника при температуре 2 — 4 ºС. Результаты определения литической активности по методам Аппельмана и Грациа приведены в таблице 2. Установлено, что бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-13 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ не изменяют свою литическую активность в течение 12 месяцев. Литическая активность фагов Ps.s-1 УлГАУ, Ps.s-8, Ps.s-15 УлГАУ, Ps.s-30 УлГАУ, Ps.s-77 УлГАУ снижалась при хранении в течении года в пределах 1-2 порядков и легко востанавливалась после 3-5 последовательных пассажей.

Таблица 1 — Литическая активность

Таблица 2 — Литическая активность бактериофага через 3 месяца хранения

Спектр литической активности бактериофагов, т.е. диапазон лизиса гомологичных к бактериофагу бактерий является их характерной особенностью и одним из критериев отбора для включения бактериофага в состав биопрепарата. Диапазон литической активности устанавливали на 15 штаммах Pseudomonas syringae, 2 из которых референс-штаммы и 13 — полевые.

На подсушенный газон бактериальной культуры наносили каплю бактериофага по секторам и инкубировали при температуре 28°С в условиях термостата. Оценку результатов проводили через 16-20 часов (рис. 5).

Рисунок 5 – Стерильные зоны лизиса в месте нанесения бактериофагов — положительный результат

Опыты показали, что фаги характеризуются различным спектром литической активности по отношению к бактериальным культурам.

Установлено, что спектр литической активности изучаемых фагов варьировал от 21,4% (Ps.s-13 УлГАУ) до 85,7% (Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-27 УлГАУ).

Изучение специфичности действия бактериофагов Pseudomonas syringae проводили по методу Отто. Установлено, что все 8 изучаемых бактериофагов специфичны к бактериям вида Pseudomonas syringae и не проявляют активности по отношению к представителям других родов и видов бактерий: Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pectobacterium carotovorum, Хanthomonas campestris, Saimonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Echerichia coli, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis (табл. 4).

Таблица 3 — Спектр литической активности фагов по отношению к штаммам Pseudomonas syringae

Степень устойчивости бактериофагов и клеточных хозяев к инактивирующим факторам физического воздействия имеет теоретическое и практическое значение, поэтому при изучении биологических свойств фагов определение их чувствительности к таким агентам является обязательным. Нами было проведены исследования по изучению термоустойчивости бактериофагов в диапазоне 40-64 °С в течение 30 минут.

Бактериофаги прогревали на водяной бане при температуре от 40°С до 62 °С с интервалом 2°С в течение 30 минут. Контролем служил стерильный мясопептонный бульон. Качественное изучение активности фагов подвергнутых прогреванию проводили по методу Отто. Культивировали посевы в условиях термостата в течение 18 часов при температуре 28±2 0С. Наличие зоны лизиса в виде «дорожки» свидетельствовало об устойчивости фагов к воздействию температуры (табл. 5).

Таблица 4 — Результаты изучения специфичности действия бактериофагов Pseudomonas syringae

Таблица 5 — Определение температурной устойчивости бактериофагов Pseudomonas syringae

Установлено, что бактериофаги бактерий Pseudomonas syringae умеренно термоустойчивы. Нагрев выше 62 °С приводит к инактивации бактериофагов.

Изучение устойчивости фагов к воздействию хлороформа проводили при следующих условиях: соотношение фаголизата и хлороформа 10:1, время воздействия 5-40 минут с 5-минутным интервалом. Надосадочную жидкость после отстаивания использовали в исследованиях с индикаторным штаммом Pseudomonas syringae по методу Отто. Культивировали посевы в условиях термостата в течение 18 часов при температуре 28⁰С. Наличие зоны лизиса в виде «дорожки» свидетельствовало об устойчивости фагов к воздействию хлороформа. Результаты исследований представлены в таблице 6.

В экспериментах также определено, что контроль в виде индикаторной культуры Pseudomonas syringae Ps.s №3 не выдерживал воздействие хлороформа даже в течении 5 минут. В свою очередь изучаемые фаги Pseudomonas syringae показали устойчивость к воздействию хлороформа даже при воздействии в течении 45 минут, таким образом обработку хлороформом можно считать оптимальным способом очистки фаголизатов от бактериальных клеток.

Таким образом, нами изучены биологические свойства 8 фагов, которые обладают способностью инфицировать и лизировать эти бактериальные патогены и, следовательно, потенциально могут быть использованы в качестве агентов биологического контроля Pseudomonas syringae.

Таблица 6 — Определение устойчивости фагов Pseudomonas syringae к воздействию хлороформа

Для того чтобы фаг был эффективным агентом биологического контроля, предпочтительно, чтобы он обладал способностью лизировать целый ряд генетически разнообразных штаммов бактериального патогена. В связи с этим спектр литической активности фагов устанавливался нами на 15 штаммах Pseudomonas syringae, в т.ч выделенных из объектов внешней среды, что позволило определить штаммы фагов с широким диапазоном хозяев — Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-27 УлГАУ.

Изучение специфичности фагов на 15 видах гетерологичных культур, показало, что все 8 изучаемых бактериофагов видоспецифичны для Pseudomonas syringae и не оказывают негативного воздействия на другие бактерии.

Все изучаемые фаги, имели схожую морфологию негативных колоний и продуцировали прозрачные бляшки, демонстрируя цикл литической инфекции, что ограничивает риск горизонтальной передачи патогенного гена, возможного при лизогенном фаге.

Для определения оптимального способа очищения фаголизата от бактериальных клеток была изучена устойчивость фагов Pseudomonas syringae к воздействию физических и химических факторов. Исследования показали, что изучаемые фаги умеренно устойчивы к нагреванию и теряют активность при 30-минутном воздействии температуры выше 62°С.

Оптимальным же способом освобожения фаголизатов от жизнеспособных бактериальных клеток Pseudomonas syringae стал трихлорметан в соотношении 10:1 и временной экспозицией 45 минут.

Чтобы использовать фаг в качестве агента биологического контроля, он должен быть способен сохраняться в течение продолжительного периода времени, не снижая свою литическую активность. Результаты изучения литической активности фагов при хранении в условиях холодильника показали, что бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-13 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ не снижали литическую активность в процессе хранения, а литическая активность фагов Ps.s-1 УлГАУ, Ps.s-8, Ps.s-15 УлГАУ, Ps.s-30 УлГАУ, Ps.s-77 УлГАУ снижалась при хранении в течении года в пределах 1-2 порядков и легко востанавливалась после 3-5 последовательных пассажей. Таким образом, хранение фагов в условиях холодильника при температуре 2 — 4 ºС является оптимальным.

Изучаемые фаги потенциально могут быть использованы в качестве биологического контроля Pseudomonas syringae, наиболее производственно-перспективными с учетом биологических свойств являются фаги: Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, обладающие характеристиками:

Ps.s-7 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10-8 (при определении по методу Аппельмана) и 2,0±0,1х109 БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) (при определении по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; в исследованиях установлена устойчивость к температуре до 600С в течение 30 минут и трихлорметану в соотношении 1:10 (временная экспозиция 35 минут).

Ps.s-27 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10-8 (по методу Аппельмана) и 1,0±0,1х109 БОЕ/мл (по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; определено, что бактериофаг устойчив к воздействию температуры до 600С в течение 30 минут и трихлорметана в соотношении 1:10 (время экспозиции составило 35 минут).

Для данных производственно перспективных штаммов фагов был проведен еще ряд исследований.

На первом этапе исследовании были изучены температурные показатели культивирования выделенного бактериофага. Для этого в опытную пробирку, содержащую стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6) вносили 0,2 мл суточной культуры Pseudomonas syringae штамм № 3 в две пробирки, в одну добавляли 0,2 мл бактериофага Ps.s-7 УлГАУ и другую – 0,2 мл Ps.s-27 УлГАУ. Параллельно ставился контроль. Для чего, в пробирки, содержащие стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили суточную культуру Pseudomonas syringae штамм №3 в количестве 0,2 мл. Пробирки помещали в термостат (культивирование при температуре: 19 °С). Далее опыт проверяли 22°С, 25°С, 28°С, 31°С, 34°С, 37°С, 40°С соответственно.

Помутнение пробирки указывало на отсутствие лизиса, просветление в сравнении с контролем на наличие лизиса.

Таблица 7 – Температурные показатели культивирования бактериофага

Примечание: «-» — отсутствие лизиса, «+» — лизис.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что оптимальная температура культивирования бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ находится в диапазоне 250С -31 0С. Нами решено инкубировать систему фаг-культура Ps.s-7 УлГАУ — Pseudomonas syringae штамм №3 и Ps.s-27 УлГАУ — Pseudomonas syringae штамм №3 при температуре 280С.

На втором этапе исследовании мы подбирали количественное соотношение бактериофага и культуры для культивирования. В опытную пробирку, содержащую стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили 0,2 мл фага Pseudomonas syringae Ps.s-7 УлГАУ и также в другую пробирку Ps.s-27 УлГАУ, затем в пробирку вносили 24 часовую культуру Pseudomonas syringae штамм №3, сначала 0,2 мл, затем 0,4 мл и т.д. постепенно доводя объем культуры до 2,5 мл. Параллельно ставился контроль. Для этого в пробирку, содержащую стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6) вносили культуру Pseudomonas syringae штамм №3 по 0,2 мл.пробирки помещали в термостат и культивировали при температуре 280С.

В результате исследований было установлено, что для бактериофагов Pseudomonas syringae Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ оптимальным количественным соотношением бактериофага и культуры является соотношение 1:1, т.е. 0,2 мл фага х 0,2 мл индикаторной культуры и температуре 28 ⁰С.

Анализ протеомов селектированных бактериофагов

Нуклеотидная последовательность выделенных и селектированных бактериофагов, полученная при секвенировании, позволила нам провести сравнительный анализ их геномов. Однако исследование биологических свойств бактериофагов включает в себя также их протеомный анализ (аминокислотную последовательность протеинов, их качественный и количественный состав, а также молекулярный вес).

Основной целью исследования протеомов выделенных бактериофагов было определение отсутствия факторов патогенности для возможности их дальнейшего использования при фагоиндикации бактериальных культур.

Исходя из данной цели были определены следующие задачи:

Составление карты протеомов бактериофагов в соответствии с аннотированными геномами бактерий и вирусов на основе триплетной кодировки аминокислот;

Исследование протеомов бактериофагов на предмет соответствия локусам патогенности;

Составление филогенетической схемы каждого из протеомов исследуемых бактериофагов на предмет аналогии с аннотированными факторами патогенности.

Ps. syr. phage 7 УЛГАУ

При анализе протеома бактериофага Ps. syr. phage 7 УЛГАУ было выявлено 29 белков с молекулярными массами от 18,8 до 138,8 кДа. Качественный протеомный состав фага представлен на рисунке 6.

Рисунок 6- Качественный протеомный состав фага Ps. syr. phage 7 УЛГАУ

✓ORF #3 566 .. 1315 750 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTTWVSTVSGNPLLIRVTCTRKPVSFPLVGMILILYRRPTRVRLWLVLMVVPFDEVVVGPDEELEPVLLGIRQPCYLQIAQHYWRSIGR

DLLVHPFLAEGALLLGDLLTVEHIGQDIAHVWRTLLLHVVLQAELDQLCNGTHGSVPHVSKADGISRTVVLIAEVPKVLVQLVPDTGELFP

GLDRTEAEPHQQQPALLELESLGPAKTSKVIDGDVTDTVETSELEHQMFSLVSVRSRRAMTTSTSSDTK*

249 amino acids = 27,6 kDa

✓ ORF #11 3268 .. 3789 522 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MEASQTTANAGHLEVHVAVLPGEVHEPLYGLGYVTDVTGDQPPTVGPVLGGQGIGHASRPFPYAHFCTLVVSCIEGSTSPVDASIVATEH

EHHVIGFHQLNPPNLLRGPLPRWLISWFRTGISHLGIRLDFFTGLGSWSSMWAIILSSSAVMSMYTMSIFQPLYLRTSSSLFR*

173 amino acids = 18,8 kDa

✓ RNA polymerase small subunit 4987 .. 5919 933 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTITHMLPEDMQRANEYRFARAHIDGYIREFIRGDEDLPGLMEQGVALLEEYRTTEYSYNSKNLRMETVRNLDLEHIVFEIIVASAYCQVP

DMFISFTAKLAGVLGFDDKADSIKTIAEMVAVLAELDVYDIEQVSKYGTYKVISNIQLPEKLQHAVERAMYLPPMVCKPSKLTGNKSKLHLT

LEKESLILNNNHHNEDICLDVLDKMNAVELCLNTEFLSTVEEESHKYLDTQDKKDDWYRFVSESHEMYKLMVQQGNRFYLLHKYDKRGRV

YAQGYHISTQGSPYKKAMLDLANKKVVTGVPEHLKIK*

310 amino acids = 35,9 kDa

✓ ORF #5 6708 .. 7994 1287 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MASSDLVNDIVEDVAVGQFGEDVDVVLAHLVAEVRVALELIVHGDQFEGFVNPHGVPQGTQSFQVVSLQLTHVDSVDVVEDHCIDHVGA

VVQVFVDSQLGVQGFTGFTLTRVTVHQFSPNQLHYLGDGFAVVVAAAVHGTQHVGVDGVDDVGSILHSTLYTAVLLVDVLEACTFHLVY

FHPSLEHVRGLDDGVEVVRQHPGVLHGIGLPSVDQVIPHLVGDGSYHLHALVEGFQFRSVLTEQVLRLSLRAIEVGHGCSLDVRPLDLTY

RLTQVGRGGSGDQAIRILTEASVDEVGGLCTRFTATQGGHDLHARAAGIQPYKVADRLTTLSSTDGHDSLEILRTSLLVALQILQVVEVV

VAPLDTLFEEPLVMAHLVCSVDQQVFESGVRGHGLVPIKRRWIGIKDRRWSTVLEVLSVFPRYKLQACTY*

428 amino acids = 46,4 kDa

✓ RNA polymerase large subunit 8614 .. 9240 627 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MQVRNFTYEDGGWVLDGMDTFDPGDSLTVIHDSFEHIDSTEGLEAELRAFGAMWWLRGETDWWCRFPRMDPRPEQVMYYDIATFIR

ENDFLIDNVGKRFKLGVDEESFLDVLRKLVEDALERDSQYLDKPVARKVIQEAASTAMDWLRVGYRAARRKYPDNFAVADLMYDIYCRVY

ALNFRALEGSMLQLKYTLNGKLVEISLDGEPI*

208 amino acids = 24,3 kDa

✓ hypothetical protein 1 9791 .. 10 372 582 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MDKITWFRRGEPIEVPIERCLYFLADGKLVQFLYYDERGLFQIAHVTGISVGKIYSAVKGKFVYVRHGFIVKNERVGITLGHGEDYRRPVC

VYVKGFEHVRGSLTAGAQELITAQLLGDHVRLCTKQNIGGTLVMLPGEPGERVRKKVIIEEIGTDIHRNWCGNACFEIAVIDKHGRRYTEL

NDHFQLYGVNK*

193 amino acids = 22,0 kDa

✓ hypothetical protein 2 10 372 .. 10 890 519 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MLMSEDKFQYEISAMKSKMKRLRRRVEVLNNKRDILLEDIDATNKMVENLSGQVETLLREANKVKGPVMQPGHLHQSDVLLTGQNIQGM

MDSGEAVAQFEVKKGDDQTTTILKDAVVTQMSNKLAELLDALGFGKEHVQKHGLDETVYDACLYIQSLKGGEALLNNLRSMLK*

172 amino acids = 19,3 kDa

✓ ORF #7 11 731 .. 12 432 702 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MDQCNRLDIMLPMTEVNCASLTKEGYSGLSLSKALAPLATLGNVPNVVFCDEMDKLFLSGNSNDSHANEISIGVQNEFLRVLEGSTTQTFG

DYGKYNTVSVERSLFIFAGAFNGQENMDATELLKCGVKTEFIGRTGLVYNLEKPTLEALVQYLKESELWANYRSLFPKEDHKKAEKWLIKEI

GHQYPDSNIGVRLINTLIHQYYINAGEDSKPQAGKKEFARTLDFSTGRLK*

233 amino acids = 26,1 kDa

✓ ATPase 12 703 .. 13 773 1071 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHFPQEQEVSIFDAKFIAEGFLRAGLKPMIHGSPGIGKSAVACQIAKENNLKLIDLRLTQMDPADLNGLPNLSGERAKFQVFEQFPLVGDE

LPVNPETNEPFAGWLLFLDELTSADDDRQAAAYKLILDRQIGNEDLHPKCLVMGAGNLETDGAIVNPMSSALISRLHHIVVRNDLKRWLQ

VVAPKLDIATKVQAFLEFSPRAFYTFDPQNSGRVYACPRTWEDFSKWFLKMSPEQDPRALDDMLNLAAAMGIIGTVATDFKAFLAYFGRL

PSLEEILTSPSTIYVPKDEPGLMFAMCSMLADNAKVDNIEKILIFLDRFNPDHMVITLRMACQRNKGLIQNPRISEWVKKNLNML*

356 amino acids = 40,0 kDa

✓ N4 gp25-like protein 14 302 .. 15 528 1227 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTDRSAEDIALSKAKIRIIGDSKVSFYANIMMGLKYVWEEGMGTAAIDGVTMFIDPKFFLSLDETSRKAVILHEIEHVWRHHIGETRRGD

RDPMLYNIAGDHVINNNLLACGYGPISWTDYKTGAKCNWVCDPKFADMSTEEVYDALYQEQKSQSGGGSGALDQGNSGNNPVPFDDI

SRPTPTKEDGTPMSETEIQGAINDLILSAATAARANGNPGSIPGEVQVFIDSLMFPKLPLPHLLRQFFQVVKRGGFTWARPNRRLINRYY

LPSRRGKALLRIAIAMDLSASVSNEEIRRYLSEIANIFVTLKPAQLDIIQFDASIRSVDTVPNLNALMNMELKGWGGTCIAPVMQWAAENK

PHALVVFSDGEFHHYNDNPGVPILWLIHPYSRKSNWKAPYGQVILFDPKE*

408 amino acids = 45,6 kDa

✓ putative RecD-like DNA helicase 15 447 .. 16 784 1338 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MVDSPVQQEIELESPVRASDPVRPEGVGKPAPFVLTPGQEAGFQTFINFYTNPDAQVMVLKGWSGTGKSTLIRRILDEMESLDRALSTL

DDNFEPFEPLLTATTNQACDALAVAMKEFNHEVKTIHRALGLRLRTDYKTGKSELMPIRNFDIPFRCLIVVDEASYIDSALLQFCFDRTYCC

KFIFVGDDCQLTPVGTNIMPAFAMKDIVVELTEVKRQNSGPLLDLCNAFRHTVKTGEWPKIQLDGDQLIHVPRDKFVEMAEEAFQNPQV

HGSTKVLAYTNACVTEYNKHFSQLLLGSSDPQVGQKMLVNEAVINKHAQLSNGSEVVIEDIRPTREFDVDGYLVKLMHHNSSFFLPKSLK

DRKDREKLARKEEDYKILQLIDQNWVDLRPAFSCTVNKSQGSTYDTVFIDLDNICGKVHRPNALARLLYVGFSRARRRVVMTGDM*

445 amino acids = 50,3 kDa

✓ putative DNA polymerase I 17 311 .. 19 926 2616 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MKYITWEEQDSYPVAILIKEAAVSRSAAESTYIKQLEGLGVPRKNVIVISLDYEGKKVSAKAIKECIKDRDQLLRDLGVQYAYVADSKYFK

EWTKRKTDADFGNLSPPAGYDPGYLVTPGVNHQVLLFDPGQMHKLSRGFKAIVDHANGVYRPVGSDLLHNVTYIYRGHVSQAREALAR

LMDKPEISCDIEGFSLSMFDSGIATIGFAWNEHDAVQIQCDYREMIQDENKHHGYYEPNAEMREVLKWFFTEYPGRIIYHRANHDVKVLI

YTLFMEHDLDKEGMHRGLEIMTPRMDDTKIIAYLALNSTADVSYSLKDLGQEHAGNWAQDDIKDIRLITLDDLMKYNAVDAVTTVWVKN

KYYPIMVQDQQDALYHGLFKDSLDLIIQMELVGMPMNPRKITEVNTELNNLRDGYHNTVMSHPAVAKVEVLIQTSEMEKANAKLKTIQHP

LSKFSHIRFNPNSGPQVARLLHEVLDLPVLDVTATKQPSTSGGTLKKLLNHIKAEPYKDLIQALMDLGAVEKVISAFMPAFKAGRMKADGM

MYLHGSFNLGGTISGRLSSSDPNLQNLPAGSTYGKLVKSLFCAPPGFLFGGADFAALEDRINALLTQDPNKIKVYTDGYDGHSMRTFAFW

PDKCDGIVDTVDSINSIQKVYPDLRSKAKTPHFLLQYGGSWMGLVRQVGFSDEEAQEIETNYNKLYRVSNEWVAGEIDKATKTGYVELAF

NLRLRTPLLGSTILGLKATPKEAAAESRSAGNAVSGQSWGLLTNRAAVEFRKLLLDSPYKLKVEIISLIHDAIYVMWPDDPDVTVWVNNTL

CKCMAWQEDPKINDKRVPLGANLDIFWPSWREACTLDYPITKERLIEQCREHAAALKEKAA*

871 amino acids = 98,1 kDa

✓ DNA topoisomerase VI subunit B 21 354 .. 23 873 2520 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MQVTHQKDYATHVVIGGKQAISMGISDDPAFFQVLSSSLYTDKILAVVRETLCNAYDAHKMVGIEKETPVEITLKDDEFVIRDFGPGIHP

DDVGTIYGVYGGSTKKHDGSQTGGFGLGCKSPFAYVDNFQVTIHHEGKTNVYRMQKASIQNGGRPAITPVVTDIPTDQTGLEVRINIK

NEDVRRFGTLIRRIVANAEMLANFNGVKLPTLPFSQVTEDWSIATEQVLEYNGHIICVRYGDVIYPVERDEFIAEVYDPAHKFVNSLPGNVN

VLVLQAKPNSVSITPSREALSMEDHTRKTLLQLLNKFLRATRNITKERSDILAKSCEELVQARKGAMVQPEEVNANRVLVSSMCGSKLCTK

GLMSTMEEVGLSQLYHSHNRSEKEHFKALLKQLSLIGKQPRNQGNTLYLSFIRLLKKVGLADGISHYERSNFGELLRFNKSSWQALEVQK

WGQKHLVSKLLPLIHEEGLCPTRLVWYGFGRNLHNGDSVRNYNNHAAYPLVRYWSKNPMSYVPLFRRCIVLTHSRRDIHNRVKDHDEW

VGGYGADDSLIAYVVPRSEKKLQEARKALSTLKGWSVIDLTEEYEKVEYSSASSSSTTVATKPRKKGYPMLSACQSSGIFSLEMARTDSV

ARVENPSYYVRLPTKSDYYTRKCVRGLDKVCSAYLLKNFGDVGAVVYTETQEANMEKKGIKSARDFLLVKLLEEVEKPEFSKACSLRYTLLL

DAAKEPEYVDLIRKMMQVEECRKVFKLPEPEDPAAEELLTTVYSMDSRFFTQEQKESLETLGKKIKAIPGDKQVLEMLKKISEAPLVALLNT

SEVRRALGDKKTVTSAVKLLKTAIRG*

839 amino acids = 94,5 kDa

✓ lysis inhibitor 23 885 .. 25 663 1779 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MSNKVTVVGAVLDERYLTLYVKGSAEQIRIPQGDPRVAVFVEKYVPILSQGGEVDYSEDLLVINNVYEAAEKKSGGIMRFFRVAKKKVAEFF

SAASASEPAAPVAPVTAGAVPGDCAPDTDAGQDVGEEVVEKVTIKDPALAKAVDDILAHAVPASAPQFSSVDLENLSEDGVESEDPDDDV

GEGDTIIAVTDQGTIVPDAQKLKTQLTAAVQSKAKGSTVGIENFLRRAGAVSVKRQHSVQDLMRFIERGDLPIADDGCIVIYKLLLKGGP

DGHKEFSYRDIHSQKVPQGVSTLVCMNESLVDPDRRNECSNGLHVARRQYLGSFSGNVCVLAKVAPEDVIAVPSYDANKMRVHAYHILF

ELPNEAMVALKANRSMTDIKEASRMLGAALSGQHSEPAYHVEITGHRGSSIVVHKGPASTKNKVQTAVPKNAPEARSLPTKPNEVVGEKV

DVLDVVDTVMTETKKPEPEAPSLTKDVPVAEPKPVKAEKKSKSRVPARKAKKLKSVKVEAKPVAQPVQDTFKAKGKPLPSDKKTAMTLVE

QGQVLWQAFVDSKGDKAKAQACLDFKKAKKKGWTVLGMPGDAADKLAKALK*

592 amino acids = 63,5 kDa

✓ putative tail fiber protein 29 803 .. 31 995 2193 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTTKVIFTFHSPDGSPQANEKFTVRLTRPGMSDAEHCVVIPETYEMVTDAKGEFTMDLESSTSAYRVTAIGDDDEYEDDPCSQYTFTFYV

PDSVDPVYVQELILMPPPNNLPWDEEAMNKITQAVVDARNARDDAEESADRAEAQVGLAAEQVTLAKAEVTKATAQADRSKAEADRATT

QATNAANSATAAANSATQANTQANRAKTEADRAKTEADRSKSEADRARDLADAVAEKVEGGSLPPLVGMNETFTYEGTDPYRWTVSGPA

TAVSDGNVMRLTKTDGSGSRAFLRQAVTFPDSHWIVYMRVKTQTGTAAQNRSAQIRFIAADNKDCVVYFNVNANGLVEPNTIHMQGTE

GGTRNAATMFTGLGTEDWLDLAVKYDAVNRHIELFRRMPNGIWQKGGGRLMVDAIKPAFIEVSSMPVAPQNWWLDLDYISVCKPNLIC

YGDSIAAGQNEYGVTRGNNPYNNNRNWAGTWFGKVPLYATNRNNLVLVQGVQGRRTWQYLSQLSEISNSGVKVVFMHASTNDVKDAT

MTMAKRTSDTQAIIDQLHAVGAQVVLFNSMQGTKAYNDASSNTVKLRDYTDQWWNTELPKVNGLAQTLDIARLIAKDGYMDPDLAAS

DGLHLTNASAQKIAYKLGQFFSNSSDTNGFASLDSPAFTGTPTVPTQTPFLPYGRLSPTPSTWLRSSKTGLNGTATVNSPWIAAPVLSCL

AEVYVAATTMFPLVQVTPCLLA*

730 amino acids = 79,5 kDa

✓ tail fiber protein 32 998 .. 34 287 1290 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MVDTCNINGVCGTGDWNGPKPGDPNMNDLLLKATPAFGGIDIEFTWPTTNPGAVGTTRLFRSTDANFAGATIRAFVNGNFYFDKTDPGS

KVDQRYYYWIQLVSINGTDGDIIGPATATARPLIEQMIEQLTGEIDNGLLSQELRKEIAQIELNKLGITQEEIERAKNDDALGVRLTQIDAK

MDQNTAILQEEVRARVTADSSLVQTVNTMYADFNGNIAAIQQENTALATKVNALASSVTTINATVNGDSASGKVGLVAEVQTLDGKVTQI

GARWTATVDVNGLVGGFGVYNDGRTVEAGFNVDRFWIGRPGTPKNPGSYPFIIDNNIVYIKEAAIQKLTFDKLRAQDGSFIVQNGKIQAD

YIEAKDIVVNNIQSDNYQPGVQGWAFRPNGIMEINGTAGTGRMTINNATIKVFDQAGKLRVHIGNLQA*

429 amino acids = 46,4 kDa

✓ hypothetical protein 3 35 487 .. 36 497 1011 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MGQIYTNQTGIPMAMALWLASDYYDYSEAGLSATTLMKPIRQVVLARRIKPSDSMADIEGMIANRMGAAIHDSIEKAWTMNKDRALDA

LGIPASVAKRVLVNPTEAELKAFNEANEQPAITVYMEQRSKKEYAGVTVSGKYDFVADGQVEDFKSTTTFSYIKDTKDNDYILQGSIYRAL

NPELITKDTMRIHFIFTDWQKFMAKQNKDYPQSRVASKVFNLMPIAETEEWITNRVKWLMSLKDTPEADLPLCSDEELWRSQPVYKYY

RDPAKADQKGARSTKNFDSLSEAMAHRAKDGNVGVVKTIPGQVKACLYCPAYLLCTQKDMLIAKGDLIV*

336 amino acids = 37,9 kDa

✓ phosphate starvation-inducible protein 37 741 .. 38 580 840 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MPRKNRNSQSNQHSQGNRSQQRSRKDRRQNETHAGLHAQADLDIAAHEAAKLVKARDTSPVVGRNPNQKEYIKGIKHSPITIGDGPA

GVGKTWVVAALAAEMLELGEIDKILLTRPAQEAGEKLGFLPGEKEEKYEPYLQPFREALEERLGKSTLEYYLKVGKIEGAPLAYMRGRTFKN

TLMILDEAQNTTPVQMKMFLTRAGEGSRIVVNGDLAQQDTYGVSGLLTAKKKLGWLPSVKLVEFKVADVVRSGLVQEVLEAWEAPDLPP

NELDSHVKEVA*

279 amino acids = 30,9 kDa

✓ putative DNA primase P4 type 38 846 .. 40 423 1578 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MDKKWFDYRLLHPTVATYLFAQCYTKGYQRFIRVSQDHERAAFVKGFKGYARRCFFGMAGEGKKVDMTPEEVYDLMTKNSTSTFIEDL

CDDLERLADASNMRRVLTMDKDTALLSIEYKLKCEKIAAGLPEHQEAKKAEVTHRYFKALKLAGAYAFVDDSPVLTMDHLYAAIKVAEESG

ECFDMLMTRDRPYVKLAKYLAATNAETTVAELDEDLPFYRGSRQQKDDMLVMATAWGYKNNIIIKKTYEQDIMFLRGEALQATDIHDKS

MIVAYSQDIAYGYFNDLATWDDLWKMTQANGIHWINHHLNGGEDRKGHRNEENCRVGFNLLVIDIDHGCKMSTAKEFLKGYKALLYTTK

RHQTENNGDRFRIILPLNYTLKMDAKEYKEFYNAVIESLPFEVDDGVGQRARKWLSHAGHYEYLDGELFDALPYIPKTTKDEERRRNLKD

QASMDKLERWVINNTGDGNRNNMLLRYAMILLDAGFSVNAIHGKVNELNSKMADKLSEIEIASTIMVSVAKKAGANGN*

525 amino acids = 60,3 kDa

✓ putative single-stranded DNA-binding… 41 233 .. 41 979 747 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MFGNLSTSNNSDIKEAKDSIGGGSRIFDTDIYAFKILAAYGSESSGGALAVNFEFEEHGTGRKLKIQQYVTSNKEKGQTNYYVNAEGEKHY

LPGFNIVNAICLMTAEKELAACAPEQRTLKIYDYDAKAEVPKQVPVLTDLTGKDIYLALEKIIENKRVKNEATGQYEDSSETRESNDVAAVFH

FGTKKTLNEARAKAEPEFFDKWKEAKAGTVRDKSKKVAGGGAASGRPAPAGGQAGGGKPASLFS*

248 amino acids = 26,8 kDa

✓ ORF #21 46 945 .. 48 795 1851 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHTGVAHRTSQQANLTTTTTGHQNLVGFQASTLVYLHITSNSVAALLEVGQVTAVYGQHFDLGVEDVRYIAIGVQTFGALEQGILGALT

QAMMHGQDQIHTVAIGTVGFGLQHFTGTALHLGTRVLPPIDSLQLVQQFDGFRTICLGGLEHTLGTKHVCDVRTVQHQVRTDVAANH

TVVSQVLHSTQVILTIRQCQKLVFEVFAEIGELAIVQKDFLQPIHTQSFTQVAHVGTQETLGQCSTVFSAQVLTVVLEALIDHRSGVLDVL

LTSHLVGLGLLEQSVCSEVTLVCSTHLVHYLHGHAVLALESVVTDASDTVQDQANTLIGDGADGLASYPNEGAVRLSEEGRFSDPVQVVL

DGFTSVRQGSFHLVQGTHFLVSQTATTLGFDVYQTIHQSEQAALSHFTRTGLVVQLTQTGKQATEHLHQTSSQWHTSQGLLAATGSEL

KQIRYFLARYTQGSKAAQVVAAGTHTLRTEQEVVLLLGHILLCLGGLIPLAREEVLRSQSILGFTPQILQAAAYEDTVVAVQGSGHSSLD

LLQHVGFLRADNERRSQCLRGEWQAASVQGLQDSISGGQCLATSNLVAECTHGTVKLGDDAVQDRLQLVAVSLGKRGLLAL*

616 amino acids = 66,1 kDa

✓ ORF #22 49 108 .. 50 733 1626 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHVRHSVGVLGRQTTVLAQHVASTGTDHLQVVDHTPGHGIVVGVGLLLVQFTLDGTAQAHMEQFVGQHLFGDARLDELRTLHIERFEV

ALGCIPATSLAHTLTDGTVRASGRGDQLDRYIFTDGPESSTQYLLAERVIGASYQSLSQTTSGQVIGFGQQIHQCLVRRSYRLAQFTPY

RGLGTAVLLNGLDHLSSTIFRQDFLGRLQAQVGLLHHLGYLLDVLLQLTFSLDAVHGVQRSSRSQGLYRVIAQRLTSSGLGFTRSSLQLS

VDSISHRFRFRVEGATDLFAGLHSSSTVSIGDDVATAIGGVLTHCTHVGQHVQLVGVSLFSDVTDAGQLSGDGSFLAFQVLAELVCNLRIL

YPLAEASKGTLEGRNHLTGCRVVQHQLEGLLVQTLASSVHTQYTHTVSIVDVQDIFTHQCIVGDERVTCVGSSDERSYTRTFVDGGHAT

GTEALHGLLTAFLIGELQRFSEVDFRAVQGRVVQFTTSLRHQHPRIQVTTSFRESGVQDRFHVLQLVADLVDLSTSEVSEGLAIIATRQV

GRSQ*

541 amino acids = 58,8 kDa

✓ hypothetical protein 4 51 796 .. 55 659 3864 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHLAGLRVDHVGSQANTLRLPHAPVEVQRLFHAKVRNLLDPTEELVEVVDLTHQTIVLGLSASTVGLVYEPTFDVYSTSDGGQCVLGQVA

PHLVHVLTKTHGTLTCVVQDLGQFLGNRLLSTLGILLCERHRSEARLSLTFSRTEQLGQDGLATGIGFTDLASNCTRNQLAIYTLTDRGQ

EVVLDTRVGRFVGVHQGLQLGIAHSGDLGHAHLHQKSQGMFTKGSFQSSTLVHRSIRQDFQTKDINDLGTQLGSCGGLASTYVAQDC

IGSRRDFFISVLAQDGIDTGIGVHQVVGSIDSPVVRTVGNGGGQVLVQSTVSIHQELSIVPEVVTSGVTGLRGVWLQRTLDDRLGSTLE

LHELLDGRLLLTSEALHTSEFSHAAFTSTDLGSEVFDCYQRLLSVTVVTCRGLLEESRNQIGSLVVLSSNFLATHSFTLTDSREFTSFGLGS

RFCLDRLGFTDWDIFSDLSDRRLYRGHLFSYLYGRFLCGGSFLHHRGRTSNRTSLDQFTQGLSRARQCSGFQCYSITQLEGASGDLQ

TTSRLQLAGSHGLRCFGPVASFITYDTDGVVGTLDLLIRSVDGIELRHTTVSEGTQLVYLTSSRFFVAVHQSHTHSVAVLRQTFEAITTR

LDVSAYTAQTREFVECNLCFAEATQGCTLLSGKGVAGVSYQSIYLLQAQSIRVDHGQGDQTLGGFRLDSSFLNQSLYLGSLRSGFHLETL

DGVTSSGQYLLSILQFLGLSLTLLRSDVADLLTYAAQVGQFFVQAGNGSFISTLLGLLTLFDGLLDLGQTFFTEQDLFLLQLGYTLGSFLLD

GVSLLQGTVLDLLGHTISHDLFLENYHCTSRVIGLRGHIGQGRDVAGFTGSIHSFTRSQSSLSTGSTRAGTYSSTATDVHGSADSSTNG

CSFDDLFQARVLQVGNVLTPGLVTLGHAFTSAGTKSRADQTTAFTTDTTQDASNGYLFSYCQGGSSKTHPQTIVSIRQLALVLGLVLGD

AFTVFIRGIAHVGSSTQYRVSGIGQHLRSVLHSVLADCQRVGCRCTDSGSSGLANTECTLHQAIQNLATAEGLACIAETFYATSSRISDV

VAQLVTASSVYDARPVEELVHVGRELAEFVHTLHALQHGLGNTVVTGSSLAQDGFIAFLHLAGDIAVVGFDGFVGYASLTHVSSSVDRQS

NHVAENTASTGYEGSSSVEDLSASSTGGDTHLADEGFFHVALLALADAVEVVSLLRTLHVQAHTGKVQSVECRALQPLLDDGRAQDITIT

AEQPHNGWLNLQIDITDATGNPQVFRQPVRVN*

1287 amino acids = 138,3 kDa

✓ hypothetical protein 5 57 303 .. 58 922 1620 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MQKIGDSTSTANASGEYTEGNPGAGVDATLIRAPWLNAVQRELVGLVQGAGIDLDPADDAQVLKAVRALAALALGKALPNNNPLPGGSL

DLHGASYAFVTAPSESSVCQNCYYSGTAWLRHDISRPAICVTVDGGQFYVRRAGAGQNPIIWQTMSPVWDASNAKFSGLLERPTTLA

GYSISDAFTKAETNANIETAIARLIGSAPGAVDTIEELARALNNNPNFATDVINGLATKADKATSLQGYGITDALQNVNPLPGGSIDIHGAAY

GFLSAQSEASLCQNCYWNGSAWMRHNTSAPAVSITADSGRVTVRKAPAGANPIAWGTVRELWDSGNATFANLSAKPTSIDGYGITDAI

KNINPLSGGSIDLHAAAYGFLSAQEEASVCQNCYWSGSVWMRHDTSRAASTLTVSNGQVRIRSVAAGANPIAWVTDSPVWHNAAVTT

SLSSSLGILALPNGWTQQVFEVTESTSATDYRYYPLEFPNGVFGVFPVLLSSTVGTGWGTNVGLVTGAWDKQKFVLNGGGSFSSEGRFR

ILALGW*

539 amino acids = 56,5 kDa

✓ IS3 family transposase 63 203 .. 64 633 1431 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MNVNNAKLQREANTQSYLDQVAASTLEQLSNADYRSGLEAQRDAMGMNLDRAATRDAITKQISAQQNQAAATQKFDDMQAEVGQRGI

VDQLRTLAAEGRAGEVNQILAEQQLINEGEIRKELTGVQDAIQNRQYRAAGEQRAQAAANRAAEAHSLSMAAGRENLAFTREQRDELRR

DRDEAKLVSGTIATTFQDYDESRQAQSEIMRIVGKEVGMPTDDQGMPDMSRASQDQLDAFSNALNEAGVQANTSPTERRNAALKSLVD

AGVSSKGIAQAKQEMELRESLEGLAPQDRTKVEATIGAVNAELDTLQRTATEDYEREVARNPFVEPDKDPLGSVNKIVDKAVKSGFGWEG

DRQDLNNMLVDFATNGIKLPDGRTAVVPSKLLEQAFNTTNTWLFNNAGDVEKRIIELMTTDGMTQMREDAPTIRENFLKTVSDIANQKRS

NAVKVTRSAEREKGVTMDPTDDLTFALRGRKR*

476 amino acids = 52,5 kDa

✓ N4 gp53-like protein 65 209 .. 67 431 2223 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MGLFSSKKKTVVNTTVQRVFDDAHIPDSPRTGVIQGITHETGIVENILEKLADSIGVRANTAYLWAQRNNYYWGLPESKVVNGVDARAV

VVQTIARSEGTITTYYNQFGPLNSLHWGFTELVRLYQYNPLTNELPGLSTTKGSKVYLFDMIPVFQTDTVAWADETANKGMLQDFGFSPK

SGYAPSRPYNTIGGMGQFAGWSPYRTDNSYGEDYVLLTYEWKDAQGVIKQETIRMLMNLDLSLDYHQVRYRRQNGTQGFFTYQDGK

GTYPLIDGVFNLDYTKQGTYYPWMYCRFNKMNVKDIPGNAYRDVKEVAKISGIGIDELIDGVHADPDIGDVAQVVLFYGVPPGATNQDQ

LTYIFEYLLLLHSEALAQIQKAENLQGKLGDYSNTADQMITMRDKYFKMDFSFSGITVNRKSGKVGPIGFINVKSGMADKSSGQIKTQQP

AYTYTRQAMDSMYDEVIIYNPAMHYQITSKKGHVAQLGQPELLIPVDRVVLSQLGLRAQEQLLCRSLHMAINTQVQIKTPWYASGFFK

VILIVVSVAVTIFTAGSAWGTIVAAASLGVAALTMVIVQMIVTTLAVSYGVKLFVRAVGPELGILAAVAALAVGAYGMSNNATWSENLMAV

SHGIAKESQTMEQAGLMDTLKELERNQTYYADQLQSLEDQRRELGLVQFQALQGEDFVNRPLAILGESTDDFFSRTVHAGNIGAASFQL

TEYFVDAKLQLPSINETIEEINNGLSVQ*

740 amino acids = 82,2 kDa

✓ ORF #28 69 344 .. 70 336 993 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHRNLVVRVHGLADAGPVHHLRVDDDAEATQLADFAVHGGTTGSVLLDGDEGRIAVVVLHGFDGRNQIGTNVQSTGVAHGTGVDHAG

TGDHLDLGRSTRVVQVQTQTHQRVVGDLGGGVDFSVGGCSARITDGASRVEQVDLQQVFGDLVRALHHFGGDVTFHRRIAVEVELLL

GVLAEEAVLLQLALDLDTLETNTVHATADLGEGRHLRGDVAHVTARTVEVAVGDGSAGSVDTLVVHVAVVEQRDVVQSHDLFAVVLRHRE

GIGQLTEVRFLGGVDERALVPVAGMDLGTDGRLYPVRGVVVLHRLDVIYRTGHEMFSLFQFQGLLS*

330 amino acids = 35,1 kDa

✓ ORF #27 70 224 .. 71 627 1404 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MEDSTPFAGSLYFIGLMLSTGPAMRCFPYSSFRDCLVEAQLLEFFVRHRQGIELGRLSLSRYSFGRSRSPTFFFHSRFLCLGAGGDSLHR

FSGCFTLAFSGRGLNQIVECTLSLKLIPNRLICVQVRGTISDRAECLTALDLGVDSVEYPIGHVLFEVADDLRMFGNQLLRSFIQLAQRSN

HSVVGWTVLDGIELFVQCFTNLVEWYSSRFVIRNTLLIQVERIYTGIFSQLSDGFRFLVFEKIDHIGDSLRVQQTSIIQLTHHVQVRFERG

HLVVVVSTHLHQTDSLFRRLDLEITAIRFERCSDLRHEVSRIYLLLGSLGLLGFRFFFSRSIFRLFLVAVFFFLPRLFFSRFLFRRKIAEFIVR

RVERILFLLLFFFLLFISRFFFFFLDNFFRLHVVLLSLLGFFLIGASLLFYFVELGQIVVTHFEEVSHYSSSSSSRTRSSSASQSLMACSASSP

RTPISWK*

467 amino acids = 54,0 kDa

✓ putative portal protein 71 933 .. 74 113 2181 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MADVDEDYLTLPNEDGDPSKRLQPEWSNAPSLAQLKQDYQEAKQVTDEKITQINRWLDYMHVRGEGKPKTEKGKSAVQPPTIRKQAE

WRYSSLSEPFLSSPNIFEVNPVTWEDAESARQNGLVLNQQFNTKLNKQRFIDEYVRAGVDEGTIIVKVGWNYQSRTVKEQVVTYEMMPD

SSEELAQIYQTAAQIREESPSEYPEIPEDVRLGLEETEANGIQVRAVPVGSEEEEREETVENHPTVQVCDYNNIVIDPSCGSDFSKAKFLIET

FESSYAELKADGRYQNLDKIQVEGQNLLSEPDYTGPSEGVRNFDFQDKSRKRLVVHEYWGYYDIHGDGVLHPIVATWVGAVMIRMEENP

FPDKRIPYVVVNYIPRKRDLYGESDGALLIDNQRIIGAVTRGMIDTMARSANGQVGVMKGALDVTNRRRFDRGENYEFNPGADPRAAVH

MHTFPEIPQSAQYMINLQQAEAESMTGVKAFNAGISGAALGDTATAVRGALDAASKRELGILRRLSAGIIEIGRKIIAMNAEFLDDVEVVRI

TNEHFVDIRRDDLAGNFDLKLDISTAEEDNAKVNDLTFMLQTMGPNMDPMMAQQIMGQIMELKKMPDFAKRIREFQPQPDPIAQQKAQ

LELMLLQAQIEAERARAAHYMSGAGLQDSKVGTEQAKARALASQADMTDLNFLEQESGVQQARKRELQQAQSEAQGKLAMLNSQLKR

LDEATSARTSQK*

726 amino acids = 81,7 kDa

Ps. syr. phage 27 УЛГАУ

При анализе протеома бактериофага Ps. syr. phage 27 УЛГАУ было выявлено 34 белков с молекулярными массами от 19,7 до 128,4 кДа. Качественный протеомный состав фага представлен на рисунке 7.

Рисунок 7- Качественный протеомный состав фага Ps. syr. phage 27 УЛГАУ

✓ terminase small subunit 198 .. 1694 1497 bp CDS

/product = terminase small subunit

/translation = MVIALVDKHREVVRVIQLVGREVVDVDKAPEIYIPQVFEPYLYPAMVKVARGGRASAKTHSFIRIILARMQATRTHVGCFREIQKSIADSI

KQTIETVIEDLGLKDQFYITDKEISHVATGSKMVFAGLYRNVVSVKGMDWIDIAFCEEAENISEASWNVLIPTLRKPGAELMVCYNPKNAL

DATHLRFGPGVCKAWHYKDDGTKFRYSVTRQVNYTENPYFTETSRIQMETMRDDDPDLFQHIWLGMPNADSELAIIKPSWIEAAVDAH

LVLGFEAEGRKRVGQDVADEGKDTSALCYAHGSIVEDLEEWRDQDTNYTARRCYAYAKAVDADEIVYDSIGVGAGVKAELRQIMSKDVD

RNGGQVFDVRVYGFNAGGEVQNKNQVYRSGKKNKDMFSNVKAQAWWHVADRFRKTYQAVREGKQIHPDELISLPKNLPHLDKLKAEL

SRPRVDYAENGKVAVESKKAMKKRDIPSPNLADALIMCFAPIKADHKGMLTS*

498 amino acids = 56,3 kDa

✓ ORF #5 2049 .. 2990 942 bp CDS

/product = ORF #5

/translation = MAMPILPSSVTDPTGQDRRERGAIAEFNRRFKQINKGAQAILAAIPVTKKTLSVNVRGLSFALNAESLTRYEFQVDTIQMELIGEEIDRLV

DQWIEVRGDASEQWLNSGYVGPAYQQGTAMTFANLSAQSVQYKASRQSLTELIKTPEYRRRIGFVRGRVFEEMKGLSASVKTGLRNAL

SDGIAQGLNPLEVARNIDEATRVGEVRARRIARTEITTALRRARLDEAEQASGDLGLGMRMMQMSALSSTTRPSHAARHSKLYTFEQAR

VWMATSPNMINCKCSFVEVLVDANGKPLTPKIVSLAFAQKAKNGW*

313 amino acids = 34,7 kDa

✓ hypothetical protein 3018 .. 4436 1419 bp CDS

/product = hypothetical protein

/translation = MQNAITLPAPGTPMALALNSALGETRAAWARQRFGGPAYGMDDKRQNAWQAFGWKEHPTFMDYYRLWERGSLANGAVGRTISKCW

QDEPKVIRGAEDTDDREQSEWEVELAKFAKTYKLWEAIRETDLRRCVGHYAGMILQIADNKTWESPVRGRIKRLVKIIPAWEGQLTVSE

WDTDETSPTYGEPKMYQFQEGAVGIQANTASAVGSAGRNVMVHPDRVIILGDLVNGVPLLRAGFNDFSNIEKILGGSGESFLKNAARQLA

IAFDKEVDLEDIAAAHKVSMAGLKTLYDDVTRGLNQGIDQTVVTQGAQVTPLVASVPDPEQHFNVAVMSAAASIMIPVMVWIGSQTGER

ASGEDQKDWAATCQGRRVRVLASDIEKIITHLVRIGLVKPVDEFSVIWTDLTEATQAEKLGNSKLLGEINEKFASMGEVPFSIEEARTAAGY

ANKGRQRVVLPDQQDTGESEEEKEKPE*

472 amino acids = 52,1 kDa

✓ hypothetical protein 2 4266 .. 5030 765 bp CDS

/translation = MLFPAEGLPCVLALVVHAVCRPAKTLTSPCSTGLAKRAIQRQGHRRPWCWQSDSVLHWVPLNLRLAIVHRLNPVYLGGSYHNGDTRP

MKSTIVTRALIFLGTCFPLLLAYAFPAKADAFGLAGVISAYVVAALTALGIFFLEATRIGVGQDKVEDYKNAANILDKDPLGRSGIIFFALNW

GLFAVLLLSLNHIVPVAVLATAAFVSILSLGRLKRIVTIARLNPRAYYKIAKYRDSEAQKGWTEAKDKSQATRT*

254 amino acids = 27,8 kDa

✓ major capsid protein 5120 .. 6409 1290 bp CDS

/translation = MAVSSTLRINASAKVRNQDIKMIQHNGKDHWVIPSYTLPAGVVMNGGLYPGDEIDKAYKTLEGTLAPIGHPVVNSKAVKAGTAEAINSHY

HGVWNKNVSKSKCGRIYIEKWVDIEFAGRTEEGRQLLGAIEAGLPIHTSTGLYCEKEPVTNGAAGYSWIARNMRFDHDAILFDEPGAATP

DDGVGMMVNSAELVVNAVVPELTTNGVLKNSWGMKRDALNAALREVYGTNDNWVSVEDFDDTDVVFYSKEGVRMVSYEFDDGVPVLGS

NITELVSRTEFVAKGTVVGTNLSLQKNSVESEPSTTITQPEKTPDMDPKELAAALKDALAVGLAPIQEALTATNQAVAKLQSEADARQEQLT

ANAKKADDELRTAIIAADPGLEMVANSLSGEPLELLAAKTAKAAPLGAGASMTTNSKDGVAAFDNVKGA*

429 amino acids = 45,7 kDa

✓ ORF #11 6406 .. 7590 1185 bp CDS

/translation = MQGKRLVPEVQDCIVGGARRSQIDAHDGHVDLTGVAVVADALAVEAFFGHVRRAVQDVITHGLEHVAHFQRLRLGHGVHVGQLVTLPL

APVDTETGLENRNRVTVAGAVDVVVGDQALTVHGDFNLLVDVAGDRVRLEGVADVHRGGQLHQVGQQLTTLVVVTNGNGALVHRQPEL

WRELVGVVLDQILGRQRVAVHVNQALLYGVTELALVPYGLELPLELMGAMLLAEAVFLFHHVRHGAPLEHANFDVTAGNRGSRYGVGLEG

DGDGISRAGGDFQLTASTDGQQGLTFYDGNAGLDQSRKDAGFVNVVGGDAIADSDWVEDRAADLVVAASDVKRLDGISSSQNQSARS

ELEELARQDRHGRFADDGLRLAVDVDAMRALAHYRIASHGD*

394 amino acids = 42,1 kDa

✓ hypothetical protein 2 6871 .. 7962 1092 bp CDS

/translation = MSYVMEQKYRLGEEHGSHEFEGQFQAVWNQRKLGYAVQKGLVDMYGNALSSEDLVKNNADQFAPEFWLSMDKRAVAIRDNDKGRELLT

DLMKLATPVDIGHTFKAYPISGDIDKEVKISMDGQRLITYDHVDRTSDGNPIPIFQTGFGINWRKWKGHQLANMNTVAESQALKMRDM

FEAMCDYVLDGSPDVTEKGFDGQGIRNHRNTRKIDMTVVGIDLTAASTTNDAILNFWNQTFALHLDANYVNGKIDVVWVSPEIERRMNV

PFSNSQGFKGGTLRSFIMEFGRVGEFRSTYKLSGNEFLAYNRDQEAISPLVAQAVATVPVERRGPRDNYNFEIWGAMGLEIKADMNGRGS

VFYAAPLT*

363 amino acids = 41,0 kDa

✓ ORF #34 8951 .. 9520 570 bp CDS

/translation = MNGATVLFEPLFEKARLGVGVPVVPVPGTATELYAGLGDAKVSTRLALERALGVMHRKGVGSGVTNDGAPAVPVVAQPAEHGVNQVRGV

DRCEQRREGLPGCGASGSRSLRLDVYDVVGHCRALGADACKSDHWHQHALLKSGSGSLKNDISQFVWLRIGLAPTVVGLGSACSPC

AIMSPNLTRLSSWK*

189 amino acids = 19,7 kDa

✓ putative glycoprotein 10 537 .. 11 214 678 bp CDS

/translation = MHIITEIGEQGITIGEKTYILRPSFRAMTRLGEPDEIVEIFAAIHKPPNFIEHMEWDGVGVRSAGDTVSRTVFKRYWLEMLYLSRDVMIAC

CDEDLTPAIGEPGSRYGSYRIGPVSPEIMLAMARSLMQHGCIGPVAKAVQRSERSGSKSGYTREFNALGFVSKAIANLGVTESDAWNMT

MSSFHAHWEAKYGEPKEARYVDEHEATMSWLAKVNAIRDKGKTNG*

225 amino acids = 25,1 kDa

✓ tape measure protein 11 207 .. 12 286 1080 bp CDS

/translation = MAETVVGDIVYNLDVNTKKFVDGMQTADKNLEKMGESMDKTDQKAQQLGGGLTKLAAAIGGLVLIDKLRDLQKLSEEFTVLSARINRVSA

DSAEGAENYQRLLAISSKSGADLGTAVKTWESLTLSLREFGKTNDEILGVTDSIMKMGAIGGSSTEEMKNGLRQLGQSFSGGIVRAEEFN

SVLENVPEIARQIAKGIGIPFSELRQMMLDGKLTAEVVLEALKKQAAEVDAEFAKMPRTVAQASNAMTNNFGTMISKLDQTSGASANLAKA

IDIVAGAFLSLSGDANAIQTIFDGITMAGASRCQCHSNHLRRHHHGWRIARSHPGWSTPDGPVQRYSGESVDDARYHCQHRSAARS

SC*

359 amino acids = 38,6 kDa

✓ tape measure protein 11 207 .. 12 286 1080 bp CDS

/translation = MAETVVGDIVYNLDVNTKKFVDGMQTADKNLEKMGESMDKTDQKAQQLGGGLTKLAAAIGGLVLIDKLRDLQKLSEEFTVLSARINRVSA

DSAEGAENYQRLLAISSKSGADLGTAVKTWESLTLSLREFGKTNDEILGVTDSIMKMGAIGGSSTEEMKNGLRQLGQSFSGGIVRAEEFN

SVLENVPEIARQIAKGIGIPFSELRQMMLDGKLTAEVVLEALKKQAAEVDAEFAKMPRTVAQASNAMTNNFGTMISKLDQTSGASANLAKA

IDIVAGAFLSLSGDANAIQTIFDGITMAGASRCQCHSNHLRRHHHGWRIARSHPGWSTPDGPVQRYSGESVDDARYHCQHRSAARS

SC*

359 amino acids = 38,6 kDa

✓ tape measure protein 2 12 060 .. 14 372 2313 bp CDS

/translation = MPMPFKPSSTASPWLAHRDANAIQTIFDGITMAGASLAAILAGRLLTALYSATAAKVSMMRATIANTAAQRVAAAEAVRAATAEFAAARAE

QQRAAAHLAATSAVVQGSAARAAAADAMAAANARAVLAEKGLQAAMAASAAVAKTTSIAMRGLQTVMGFLGGPVGVVLLAATALYQFAT

SAREAKDPTDLLTQSVDALGNAQLRLQKIKLTEAIAEQDKLAKGSMWTQYKVNALKKDIAEAPEGSNAWKGYTKQLTEIEAESEGAREMS

AKLQEQLAKVNAEIGKRSGEKQVVNTPKRKEDPEDAKVRQRLQDELELAKLSGEAKARQAALQKLSANATDEERQKVSDLAAEVWRLDE

AKKATTKTDKEGAALAKKKTAEEKKGAEENKQAIIDYAIEIGKLADKTQDYSEASALAKLNKFATPEDVRVMRELAAAQAQIIEAEKNKALLG

QLDPMAGEDQRFTKQLEDLKKLNDAKLLEDERYLELKGIAERQHLETVRQLQEENFKAASLGNEILMNSIDAMASGATGALSGILSGTMSL

QEALGNLANTVLNSVIGAFVQAGVDFVKQEIIKRAAIQATQTTQQASMAAVAATQAGTTAAMAATTTTTAATTGASVAGSMAPAAGLSSI

ASFGGAAVIGGAALLATMALAKSFGGGRRYGGDVNSDSFYRINESGPEIFTANDGKQYMTGANGHVTSNADAFNNGGGSRPVQVIIEDY

RGNGADPQVSQETLTDRDVIRIVLNDMQSGGQLARATNQITGTKRPGG*

770 amino acids = 80,7 kDa

✓ hypothetical protein 3 15 525 .. 18 296 2772 bp CDS

/translation = MMTPKIPKMNSLAAAGQGKDLDSATAKGNKVKINQVRPEVAGKCRIYGNYAKPARRFFNDKRDQRVDLCLDLGVGDIEVLPSEIYIGLTP

VTSYGADVSYAIYRPGQSLAADRRADWWHDVQEVGSGSNGSSGLDMTESTELTKSYVAYSHQMNGYQVLIPSGAGNFPADWTAGLIV

RIVVPYQYNVIDDATADIIEGDNLTMLAPVVGQSIEIVGASGGFYTVRSFSPKVPAVPADPGSPAYSTGSAAPSTFNFTTTPANFTVRVGT

TDYPVTINTNTTNMAGLISAINAAKPSGAPFVASDVGGRVRCTDNASVNTGRALTITGDSRIFGLSTNAVAGVAATGGTPEVPPRMTLNL

NGQPAKSLALGQQSMCIGPAGLRYRLTAASTTALTVVRLNSTGGNDNSFPGFTYQETTGTVITLDQSNLQGGFRGPFACCPEGEKITKI

QWDVFHPSGLFGLGREGQIYDIRSFHRLEWRDMDLAGAWTQVDIEHVGGKQDAMGFTYELTLPYPMRAEARIVKRFVSQPGRIDNEK

QDEIVWYGLRGLIPRGRKVYPNSTILCLTVRGGDRLSAESEAQVWVKGTRRLPVRRGGVWQPPEPTRDIVPFALHVLKSAGYTDDALD

LEEWDALDALYRSRGDRYDRLHTEESTVQSVLEDCLNAGFARLTVKHGLLTPVRDESRSIFTALYTFDTQLEGEGLDIRFNMISGDDYDG

VDVQYTDQVKWQNDTVKCRLPGVPNPKKVKVIKAEGITERLQAYRYGMRDLMEIRYRRKTGEWASEMAAFNSNFGDLVQVGGECPGY

AQSHVMRSVSADKKTFTLRAPLDLSQLAPPYMASFRRIDGTCFGPALVTNIVGDRTFTIANPLDFDPILDQPGTVLPTYVLFGNGYGVLI

DEIDPEGTESARIKATFYDERVYTYDNAPLPAGA*

923 amino acids = 100,6 kDa

✓ hydrolase 18 788 .. 22 336 3549 bp CDS

/translation = MADLPYNTGNAIGSADPKDRWDNSIGLDYAMLSTTDYWKDRLGRNRRTLYWMERAATGIPAVSAAERAETAAAAAQLSAGIYDTTAAG

LAATTNGKYFSVPQPGNPSTALMLYKNNAGAALYITSYATGVASSLTINYGKTFPNRRAVRNGVDSADSTQLNEFVLDACVIGAEPGYYYR

IGYYVNGNPTYPISPDGWAIERIASANYETAANAAEDVVRYTDPAPTIGNGIQTITLTSVVYPDLKFVLTVDGSKRPARGTSITTRLPAYA

GYSHIIDPSVYLETTRRNGLNLNSGSIVPFKSMTRDGTVSPSNSLMFNAILGVTVINAKPGMYYGLKYFQNGNADAVPAADNWMIEEIKV

ADYATSAVIDPANLISTIQEITQPPISRSLGIQTITLTTKTDVRILVTIDPAQLPAYGTAVAMSSKGGSGWSHIIDPAFYQTKSDKGGEMS

YYIDANGRLTVNWLDTNGETRGYTFGINGANDLPNFFNFLKGTKIVSQFGTDMLPPMVLDAVNNVDADPYPIDFTGGNHTIDGQKTAVNT

IFDIIADGRLVSVKGTSGRARSLVVRITNRLMACNTVKSGRYVGQQNFVVSFFPGGAQVEAQFTPYEAVQVYIDYGPQLVTINVEETIFFF

DGQYASPIPYDPGANSGKPSEYPNTWAVVTTGADGQLGAWIDRSYGIAEAKNSSDEFGFITGSGAGSTSRKLYPTAIHQPLRRADGGI

QFMAGESYFWRGGYTWSPKVTRAGMVATMEYMLGGTVRRAEAATGSRTYAPDADWVAREVRRISNELDAVAKDVETIGVPPQELSEL

AKALRNPFHSVCLLGIGDSITYGSGAAYIPGANPVPEYDVPNAKINFAMRTWFNRFRENIGTTYGEGDVIQDGSGNGYYEKLHLVDVLDG

YKYADWYDGRTGFKIAMPVPVISASATFGKYLDLSTWIRPTVDVTGNNITVIHAKLTASDPAQAIVEVWDTITETKLGEFNWHSATPSFG

NRSAVTFPWGKYRVQLRTVGPIAQLRFEGFEVTQRIQARNIGVSGSGTMSWLPGSANMNNVAPEDEFVTVMLGTNDRGNNSLPLNYAR

TKANIKTIVNHLRSLGKTVIVMCANVAVGTAEYPNSPYRYSMSTVARALRESTQELNVSFVDHYAPTRKAYLDGEVIFSNGDYLHPNDLG

HKLINDTLTGRIYETEE*

1182 amino acids = 128,4 kDa

✓ ORF #12 18 797 .. 20 086 1290 bp CDS

/translation = MRPAATALARHGNGCAIGWQLRRIDGHQDPDIGFGGQSDGLDTEGSRDWRLRDFLNGRDQVCRVDDCRGGVIGNLDLLNHPVVSS

RNSVGVAVLEILEAVIHAWLGVDYGNAEDRVKHQAVTWRYRAVAGHRLERHNRPAVQVQAVAASGLQVDARVDDVRIASIRRESSGN

RGSARRALAAVDRKDEFQVRVDDRGQGDGLNAVANSRRRVGVADDILGGVGGGLVVRGCDALDGPAVRRDRIGRVAVDVVADPVVV

AGLGTNHAGIEHELVELGAVGAVDAVAHGAAVRERLSVVDGQRGGNASGVAGDVQRGACVVLVQHERGAGVARLRHAEIFAVGGGGKT

CGSGVVNASGKLGGSGSGLRAFGGAYCWNAGRGALHPVQGAAIAAQAVFPVIGGGQHGVVKTNGVIPSVFGVGGADGVAGVIW*

429 amino acids = 44,2 kDa

✓ ORF #14 24 820 .. 26 400 1581 bp CDS

/translation = MLELLPLGRQPVVAARGLVIDRERPIRRGVRHHALGVAVTADAVLVLHADHLVALRLVRVFLLALELDAKLGVRVDQLALTLFAVPCRDIV

VVPAIVVRARLGRPAISALVAEPVRVLMERLASSPEMGWHGKLFRLPLVVEFGAVDKDAVTGEVGEVPVLVDGVPLVILAQAELVGELALRT

HKISRRAGGATKACLDIRLEDIAIRAVLLKVLRVVEDQHMVFTLVQSQATANDLLQESAGLGLAQDRNDIDVRRIETGRENGDVDQVLEL

LRLEVFDGLLAVGLAGYLGVARDHPGQLWRQRAHDLLSVLDGRGEDHDATLVARLVNDVRDDCGGLAAIAHESPVDLAFDLGLAGAKV

DPGGVVGLLAERANHRRRQVPEVDQLASQDRVDLLHEVRVASLLVRHGLAVLVHAVDIAVTQHVWRAGQAYHANLGVLLADVLNDLAD

GLGHALAFVDDDQAITLANLFRDLDEGLRRGENHRVPQVLFAEAGAVDRRRLAGEQVLHIVLLNQLLRRRNAQGALS*

526 amino acids = 57,0 kDa

✓ ORF #15 26 499 .. 27 506 1008 bp CDS

/translation = MPKLHRSHSADTGEGCNSLFQFPANRGGATILFQVQAWQVLFNDLAVLDRAGGLGPREPTTADENRLVFGKGLELVKDFLFARRVVVDD

QLQLVKLRHQLLHMLAVKRFARRLQVVLVLGLVLVLRIEALKVGHCAIYLALVKLHQLMLGAQHRPLEEDAPRAASKRHFDLHLYGHVRLI

IQRVELAAVGNVALVERQPDKDQARAWVFVGMHHGWVHGQEFMRLLEIALDQCLAELRLECCLCCSAVAVGVLCRSVGNILAWHVVVL

THHFADHVGALAVFVHAEDWCHVAHGDLGMHLARGTLLGCNFLWGVLGHQVFGCSYVGFRHFVKFPW*

335 amino acids = 37,5 kDa

✓ putative phage-type endonuclease 26 550 .. 27 485 936 bp CDS

/translation = MSESDVAAAENLMAQDSPKEVAAKQRAARKVHPKITMGNVAPILGMHKYRKRSDVIREMVRQYHNMPSEYVANAPAEYADRYRAAAEA

AFEAKLGKALIKCDLKKPHKFLTMHPTMVHSDKYPGPGLVFIRLPFHKRDIAHRSEFDSLDDQAHMAIQMQVEMALAGCTWGVFFQWS

VLCTKHELVQLDQGQVDRAMADLERFYAEYKDETKNKDHLEAPRKSLDSEHVQKLMAELDELQLVIDNHTSRKEEILDEFKALAKDKSVFI

CGRRFTRSESSGSVQYSKIVKEHLPSLDLEKYRGAPSVSWKLEK*

311 amino acids = 35,6 kDa

✓ hypothetical protein 5 28 034 .. 28 786 753 bp CDS

/translation = MSLNFWDLGEGQKALEAGKTSIEVEGGGNLDMPIPAGTQVRIIIADAKWETSDGAGTYINLKYQVEAPACYKGRIIFHKLHVRCHEFPAA

RENARLTEEKLANKRVKALRMFAVIDANAGGKLLASGKMPDDVALQTNLSGKTMAMTLDVYEFDTDKDGKKLPNRIDWNRGNWVKKVD

PRTAFVDMTKEQQEAAVEASKREFEKMLNDAGGVRNTPAASGPAGGGGGMPGRPAGGAPAADFDSFDDDIPF*

250 amino acids = 27,0 kDa

✓ DNA primase/helicase 28 857 .. 29 828 972 bp CDS

/translation = MIIEAPKRRPPFITLLGEPGLGKTTLACMFPDPIIIRLEDGIESVPEQFKPSIMPVVTTFAELDAQIRWVFAKRKEHKRKTIIIDSITKAESM

LEQHLIDTDPNKPQSINQACGGYGAGPKALGGLHGYFKKLLDHANKAGDMTIVVIAHAATDTVEPPDGENYSRYVLRLGKHSMAPWVD

DVDLVGFLRLQQTVRGAKEGNAKGIGAKAGKVLSGGVRELVCHTAAANVSKNRFGIRDAIEIPDPMDNPKVPNPLLALIPYYVENGLAVAP

EKPKEVEPEPEPEPEQQHTPDLNTEMADGDDYSDAPSRSDVEPMDDDGPAI*

323 amino acids = 35,2 kDa

✓ ORF #19 29 157 .. 29 924 768 bp CDS

/translation = MTHQLADAARQDLASLGPNALGVAFFRATNGLLQAQEADEVNVVNPRGHGVLAEAQHVAAVVLAIRRFDRIGSGVSDDHDGHIASLVGV

VEQLLEVAMQAAERLWTSTVTAARLVDRLRLVRVGVDQVLFQHGLGLGDRVDDDGFALVFLALGEHPANLRIKLGEGGNHRHDRRLELL

GDGLDTILKADDDRIGEHTGQGGLAQAWLTQQGDEGRAPFRCFDDHGYWVSRGWLSFDRANSTDSDYSRQPLFQNNY*

255 amino acids = 27,9 kDa

✓ putative bifunctional DNA primase/pol… 29 996 .. 32 425 2430 bp CDS

/translation = MSTLSDALNFLDNGYRIFGLYGEKNGECGCSRPGCLAAYKHPTISNWQVVPEWSEEQLEGFEALGHFNTGYGVLVSGLLVIDVDARNGGT

DSYARLVEDLRLDFAASSGLTVLTGSGSGSMHIYYKAPEGVALIQNHKKYPGIDFKSSGFCVGPGSLHASGNRYETLFGSPKEIGVAPDCL

VELLKRPDTFRADRDGMQMDITTQEMARMLTFISPSCDRPTWISIGFALHHATGGSAFELWDNWSSGGDTYPGPQELRKQWDHMGK

KGSPITLGTLFHYAEQGGWKEEEQADVPDFPEGSWMAELAAGRTVAMMEKAEVIEAEVALYAEENGLDEAEKVKETIKRKLGNRPFDIDD

VDLLRPPGFVGEVCKWINGQSRYPRENLAVAGAIQSVGNICGLRYTDDYDGVTANLFTLCVAASSTGKEAVLNAVGTLHRTAGVARAVV

GSIKSEQEIIRNLIDNQAAYYVIDEFGIILKTITTSKEAYHTGVVGTMMAAYSKADSFLQLNGDTKREVRKILVNEQKTVRKMISENEGDR

DQLQRREANLDRAIKSIDNGLERPYLSMLGFTTPVTFESLVTPEQATNGFIGRSIIVTEKDTNPRAKPDFKKAKMSARMEATLMSLYAGLS

YDPDDYRVENYDEREEIPTTAEAKRMLDDVYEWGWQLAESHKEKTGLESIPRRAREMVSKLSLILAAAGRIRTAEHVRWAFAFIERDIRE

KCALAYANELEQTAGDEGVNQAIRARIMTVIDDKHGESQAVLINRCKKWSRAQVITVINMMVDKGQLVKRESIHARNGTKVEKYHRPET

EE*

809 amino acids = 89,9 kDa

✓ putative DNA (cytosine-5)-methyltran… 33 989 .. 34 798 810 bp CDS

/translation = MARTNRKGPSTPMAKVLIGYSCCGNTRAAFEKYGHDVWTCDLLPPRHDSQKHLQMDVWRALEMSWDFAILHPMCTYLTSSAEWAYK

DPDFKRYKEKGGYHQRLKPGTLFGADRRKAREEAVENFKRIMALPFPVVAENPARGALSTLMRGPDQVLHPYQAGDDASKATGLWRNQ

GDIPPLPIDPAAFVKPRMVCNNSTREDPHHSPYGSTQCIKCGSPKMLPRWANQTDSGQNNLSPGDQRWLDRSETYPGIAALLGDTYG

PWLNRKVA*

269 amino acids = 30,3 kDa

✓ DNA binding protein 35 057 .. 36 094 1038 bp CDS

/translation = MKCCALSQSAPPFTSSAFNGALPMTQAKITHAVATAKEIHRNMLKMEPGSVERLGARTYRDRHLTYARDMIDALALEQQPLDQRAEAAI

RTLERLGYTYQGGELWKPPLGVRRPIASAPARRKALHARIEFNPDDYRRQMGQQLASDELRGVFDYDPQPLRHTAQILPDQFARPVSS

ADIRESGFTTAQAMIDCLARAQHRVDLKGPLGYDHKVAACIRFSMQDPHGAFRPGQFISFVRRTDDVGNFVHERCIVLSAGVSGMRIA

NVDTALEWQIDGHTIGMGSSPSFHDRVSAVYPLMPTEWAQTCLDNYKRNWLKEEIRRLDEQSEYSKRRELMVELASVGMR*

345 amino acids = 39,0 kDa

✓ hypothetical protein 6 37 541 .. 38 341 801 bp CDS

/translation = MRGNIKVIGMAGMSENQKAALEQLKTNMDKAFEEQAVLDELLALPQPKIGANSHSAAEISEKIQTGNQACGGEVAGKEFVIHQLNSNDSG

DRPRRYIGRDVTLSWPADAPLPRHLSVQHEGVQVEDGRVVDMGRQVSMSYSMDGETWQEIGALQAKEFAVSWDEARPGDDVTAVQ

YRELPKTSPVLVVGGGRHGQVAALIAHMRHILLCARVTEMATRRGYQHIFSDVPRVDRAFEIETAKNVLPKGFRGVYSSTRSRAGRAAR

WR*

266 amino acids = 29,3 kDa

✓ Lar family restriction alleviation protein 39 216 .. 40 079 864 bp CDS

/translation = MACNHQRSQAFLHGRRAHDQARGLRGREVHMGNNTTGLDQGRVVDSLQNLYEEAYVDGQNAPNGYSCNKKRDDAVAAAMVSACEPG

HAIAGRVILNAEGVKAISFGDEQWASLQVGDVIYSAGMGVGLGHGDPVGEVVAFGKGLHEIAWAAGRMPKLGAKLYTHADPGEVERLAI

LLRQTQVKHSQERDTLRAQLAERVALLREVIDGKTRTQFDGNLMHRILMVLSASAEPSAPVERPVISGTALAEITTIIDEAFVAGQNGPY

YAEDCINWVDRILEQVGKRRDD*

287 amino acids = 31,1 kDa

✓ hypothetical protein 7 41 057 .. 41 878 822 bp CDS

/translation = MATNKLEVTMRGDMDSASLVARLIAQAVNGDLTGGVPLFMGYNINYTGMTVCPRIDLERRTGQDLEQEHEIIKRRLNALRAANRMPPVD

IWKCGMVDSGCAPIHEVLEHQLNALRTEYGLQPLAVSAQGVVLPPEPAPVELVAIKAPFGKIRKAIREVLGHVVEIHKGVKELVHLARDAE

TRRKGQTINVTDDPLHGMEIEVQLEQVRKRDPEYHFHFKGRTFKANTGDSLLNRREALRQAAMTPDCDSDTLAKLVASIRDEEARRAIP

KGRQ*

273 amino acids = 30,5 kDa

✓ hypothetical protein 8 42 994 .. 43 578 585 bp CDS

/translation = MQMKSNIRDYQLEAIADITGNVNLRNRAINEQRLRAAHYGRELGVQPCAYDSLDAIYEHLELTNDRLREAVERGEMAKRFLLDRARVTLS

QMYCERWGRLEAELKTLRRWGLVNAKVAWHQANADQKRYGVMLAYAQTDWVDQSAVLDAHRSLQCARHCRDHRPPRTSADLIGK

YAAIQIQPARNLGKTISVKV*

194 amino acids = 22,4 kDa

✓ N-terminal domain-containing protein 47 793 .. 48 803 1011 bp CDS

/translation = MQECKMIKRTDSGQMIQLKHIYDKTREDGSLWNRRDMESPETKAHIQDIITHLQKGGIVPAIEVQPREGGGVEKVDGHCRTEAYKAID

ASGTGELWVSIVPFKGDTLKALARIKTSNHDRKLTPLENLDLFKSIRQELVDMGEKGSLQQIADEVGCTRQYVDQILKLDKLDDEGKQAL

SEGKINAAQALKVARTGVKEGKEAAKAALKTEVKRSAPKPLTASRALLDDMYVGMTDLFYSVPAEAKTAAAEFLKGDRPATDMVRIPVGEL

AKLMALKAEGDRQIEAAAERQMQKAEKAAQEEMGSDLDPVQKAAEPEPKAEHAEQPEENDEPDLSFL*

336 amino acids = 37,1 kDa

✓ DNA polymerase 49 318 .. 50 085 768 bp CDS

/translation = MAIKDFFGCILDTETTGNDPETCKVIETARLAITGSPLEFMKIPVEDSIMDGQLYSPGDAPFAFGAMAANRITPSMLEGKPKFEGFSYYGKL

VVGHNIDFDQRVTAYNVQHQICTLALSRYLWPELDSHSQSAVLLYIGSITRKGIDWAMDLLKNAHRAQDDVQNCARVLKFIIFTLSRSP

EHKHHVESWEALAALSLDCKVPRHMPFGKHKGLPIEQGGALDQGYVDYLVNNGNTDRYLMSAFRRAGFNVPENL*

255 amino acids = 28,5 kDa

Согласно проведенному анализу бактериофага Ps. syr. phage 7 УЛГАУ — было выявлено 29 белков с молекулярными массами от 18,8 до 138,8 кДа; бактериофага Ps. syr. phage 27 УЛГАУ — было выявлено 34 белка с молекулярными массами от 19,7 до 128,4 кДа. Протеинов, являющихся факторами патогенности или их аналогами (анализ на основе филогенетического родства) в составе данных бактериофагов выявлено не было.

2.2.2 Подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов (разработка количественных и качественных параметров культивирования, подбор методики очистки биопрепарата, контроль стерильности)

Разработка количественных и качественных параметров культивирования. Для определения количественного соотношения для бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ и их индикаторной культуры Pseudomonas syringae №3 было необходимо подобрать оптимальное соотношение для последующего культивирования на МПБ. Для этого была разработана схема постановки эксперимента, отраженная на рисунке 8. Варианты эксперимента – индикаторная культура Pseudomonas syringae №3 вносилась в пробирки с 4,5 мл МПБ в различных объемах: 0,2 мл, 0,4 мл, 0,6 мл, 0,8 мл и 1,0 мл. Объем суспензии каждого фага варьировал в объемах от 0,2 мл до 1,0 мл. Время экспозиции подбиралось визуально, ориентиром служил контроль культуры в МПБ. Температура культивирования была стандартной и составляла при (28±1) ⁰С.

Рисунок 8 – Схема постановки эксперимента по подбору оптимальных количественных соотношений фаговой суспензии и индикаторной культуры

В таблице 8 представлены результаты исследований по подбору количественных соотношений выделенных фагов и индикаторных культур и технологические параметры их культивирования (временной интервал) при концентрации микробных клеток равной nх10⁸(КОЕ/мл) бактериофагов, специфичных для бактерий Pseudomonas syringae. Температура культивирования в условиях термостата при (28±1) ⁰С.

Установлено, что для выделенных нами бактериофагов Pseudomonas syringae — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, было подобрано универсальное оптимальное соотношение фага и культуры для пассирования равное 1:1 (0,2 мл фага: 0,2 мл 18±2 часовой индикаторной культуры при концентрации микробных клеток nх10⁸ КОЕ/мл), временной интервал культивирования в условиях термостата при температуре 28±1 0С находится в пределах 3,5 часов.

Таблица 8 – Подбор количественных соотношений выделенных фагов и индикаторных культур и технологические параметры их культивирования

Подбор методики очистки бактериофагов. Метод очистки бактериофагов от бактериальных клеток мы выбирали из трех методов

— ) трехступенчатой фильтрации, включающей:

1.осветляющую микрофильтрацию через мембраны «Владипор» марки МФАС-ОС-3 с размером пор 0,8 мкм,

2. осветляющую микрофильтрацию через мембраны «Владипор» марки МФАС-ОС-2 с размером пор 0,45 мкм,

3. стерилизующую фильтрацию с применением фильтрующей насадки фирмы «Millipore Millex-GP» с полиэфирсульфоновым наполнителем и диаметром пор 0,22 мкм.

— воздействие температурного фактора в диапазоне 40-60 ⁰С — степень устойчивости бактериофагов к воздействию температуры проводили следующим способом: исследуемые бактериофаги прогревали на водяной бане при определенной температуре в течение 30 минут. По завершении обработки бактериофага определяли количество бляшкообразующих единиц фага методом диффузии в «мягкий агар» — метод агаровых слоев по Грациа;

— обработка трихлорметаном — определение чувствительности бактериофагов к трихлорметану проводили методом обработки фаговой суспензии им в соотношении 1:10 при постоянном перемешивании.

В экспериментах было установлено, что индикаторная культура Pseudomonas syringae № 3 не выдерживает воздействия хлороформа во временном интервале равном 5-85 минут. Установлено, что бактериофаги Pseudomonas syringae — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ — устойчивы к хлороформу.

Ниже представлен протокол исследования:

в пробирки с 4,5 мл МПБ, вносится по 0,2 мл испытываемого бактериофага и 0,2 мл бактериальной культуры, чувствительной к данному фагу (индикаторная культура): пробирки культивировали при температуре 28±1 ⁰С 18 ч;

в каждую пробирку добавляется по 0,5 мл трихлорметана. Время экспозиции с трихлорметаном при непрерывном встряхивании соответственно: 1-я пробирка – 5 мин; 2-я пробирка – 10 мин; 3-я пробирка – 15 мин и так с интервалом в 5 минут до 90 минут; полученную смесь откручивали на центрифуге 30 мин при 5000 об/мин, собирали супернатант;

активность бактериофага определяли по методом Отто (контролем служил стерильный фильтрат фаголизата, полученный с использованием бактериальных фильтров).

Простота и эффективность трехступенчатой мембранной фильтрации стали основополагающими факторами при выборе метода очистки фагового биопрепарата от бактериальных клеток индикаторной культуры и т.п.

Контроль стерильности. Контролируемые по каждому исследуемому бактериофагу микробиологические показатели приведены в ТР ТС 029/2012 и указаны в таблице 9.

Протокол исследований на определение КМАФАнМ

С соблюдением правил асептики готовили разведения исследуемого фагового биопрепарата в стерильной воде 1:10; 1:100; 1:1000.

Из каждого приготовленного разведения делали высевы на девять чашек Петри с МПА (по три на одно разведение). Для этого стерильной пипеткой у пламени горелки отбирали 0,2 см раствора и переносили на поверхность МПА в чашки Петри, тщательно распределяя его по всей поверхности путем мерного покачивания чашки. После этого засеянные чашки Петри помещали в термостат при температуре (37±0,2) °С на 24 и 48 ч. Через 24 ч подсчитывали выросшие бактериальные колонии.

Затем чашки Петри оставляли в термостате еще на 24 ч для выявления медленно растущих бактериальных колоний.

Таблица 9 – Контроль микробиологической чистоты фаголизата

В результате проведенных исследований было установлено, что КМАФАнМ во флаконах с бактериофагами равно 0, то есть рост бактерий через 48 часов на всех девяти чашках Петри с МПА нами зафиксирован не был.

К БГКП относятся факультативно-анаэробные, грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу (глюкозу) с образованием кислоты и газа при (37 + 1)⁰С в течение 24-48 часов, в основном, являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т. е. учитываются цитрат положительные и цитрат отрицательные варианты БГКП). Для выявления БГКП производили посев на среду Кесслера. Через 24 часа инкубирования при (37 + 1)⁰С делали пересев на среду Эндо. Было отмечено отсутствие на среде Эндо колоний, типичных для БГКП (красных и темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых или бледно-розовых).

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в исследуемом объекте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа бактерий рода Salmonella или сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella. Навеску массой 25 мл вносили в забуференную пептонную воду, затем инкубировали при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч. Далее производили посев на среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон). После посева RVS-бульон инкубировали при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч, а МКТ-бульон — при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч. Далее небходимо было провести пересев выделенных культур на две селективные агаризованные среды: ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-arap) и висмут-сульфит агар. Отсутствие роста бактериальных культур на средах предварительного обогащения в неселективной питательной среде и на селективной среде обогащения свидетельствует о том, что бактерий рода Salmonella выделено не было.

При определении количества E. coli в 25 мл фагового биопрепарата делали последовательные разведения и наносили на поверхность агара лактозного с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, разлитого в две параллельные чашки Петри. Для подсчета количества определенных групп или видов микроорганизмов на селективно-диагностических или диагностических средах учитывали колонии характерной морфологии, показавшие характерную цветную реакцию с присутствующим в среде индикатором. Отсутствие роста бактериальных культур свидетельствует о том, что бактерий E. coli в 25 мл фагового биопрепарата выделено не было.

Параметры микробиологической чистоты фагового биопрепарата экспериментально производственных серий фагового биопрепарата соответствовали контрольным значениям приведенным в таблице 9. Результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что в процессе хранения готового фагового биопрепарата при температуре 4±2°С активность обоих бактериофагов не опускалась ниже нормативных значений в течение 6 месяцев (содержание БОЕ в 1 мл бактериофага 10⁹).

2.2.3. Разработка технологической схемы наработки экспериментальной партии биопрепарата

2.2.3.1 Требования к производственным штаммам бактерий Pseudomonas syringae

Производственный штамм бактерий Pseudomonas syringae №3 обладает типичными для вида тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами, не продуцирует энтеротоксины и не содержит умеренных бактериофагов. Оценку наличия индуцируемых профагов проводили путем обработки бактерий индукторами (ультрафиолетовым излучением, митомицином C) с последующим контролем появления бляшек лизиса, вызванного активацией умеренных бактериофагов, содержащихся в геноме бактерии. В качестве химического фактора воздействия использовали митомицин С в дозе 0,5 мкг/мл.

Протокол исследования

Исследуемые бактериальные культуры засевали в пробирки с МПБ, содержащим 0,5 мкг/мл митомицина С. После инкубации пробирок в течение 5±1 ч при 28±1 °С содержимое пробирок центрифугировали (3000 об./мин) и пропускали через фильтры «Millipore Millex-GP» с полиэфирсульфоновым наполнителем и диаметром пор 0,22 мкм.

Суспензии индикаторных бактериальных штаммов наносили в объеме 0,1–0,2 мл на поверхность МПА в чашках Петри и втирали досуха шпателем.

Чашка Петри с МПА делили на 3 сектора, на которые наносили по 100 мкл:

содержимого пробирки с физ.раствором с 0,5 мкг/мл митомицина С (отрицательный контроль),

фаголизат бактериофага (положительный контроль),

тестируемую бактериальную культуру (опыт).

После инкубации в течение 18 ч при 28±1 °С чашки исследовали на наличие зон лизиса на бактериальном газоне.

Учет результатов. В месте внесения физ.раствора с 0,5 мкг/мл митомицина С зоны лизиса фиксироваться не должны. В месте нанесения фаголизата бактериофага визуализируется зона лизиса. Наличие зоны лизиса газона на секторе с нанесенным содержимым тестируемой пробирки указывает на лизогенное состояние штамма.

В качестве физического фактора воздействия применялось ультрафиолетовое облучение (УФО) с длинной волны 250 нм. Эксперимент проводили в полузатемненном помещении с целью предохранения облученных бактерий от фотореактивации

Протокол исследования:

Исследуемые культуры в период эксперимента должны были находиться в экспоненциальной фазе роста. Суточная культура бактерий разводилась в соотношении 1:100 в фосфатном буфере с рН 7,6.

Разведение бактериальной культуры в объеме 2 мл помещали в чашку Петри и облучали в течение 20 (25, 30, 35, 40) секунд на расстоянии 40 (45, 50, 55, 60) см.

Затем облученные штаммы бактерий засевались на мясо-пептонный бульон (МПБ) комнатной температуры (20-22 ⁰С) в соотношении 1:100.

Посевы инкубировались при 28±1 ⁰С в течение 6,5-7,0 часов, после чего делается посев методом диффузии в «мягкий агар» — метод агаровых слоев по Грациа.

Накануне опыта по чашкам Петри разливается 1,5 % МПА в ламинарном боксе. Чашки Петри с МПА ставят в термостат для проверки на стерильность на 11±5 часов. Перед применением чашки Петри с МПА дополнительно подсушивают в термостате при (28±1) ⁰С 15-20 минут.

Готовят штатив с 10 пробирками, содержащими по 4,5 мл МПБ; в первую из них добавляют облученную бактериальную культуру в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивают другой пипеткой и в количестве 0,5 мл переносят в следующую пробирку, из второй — 0,5 мл в третью и т.д. В серии пробирок обученная культура разводится 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. до 10-10 (из этой пробирки после перемешивания выливается 0,5 мл разведения с целью соблюдения количественного единства в эксперименте).

Стерильный 0,7% МПА, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляют на водяной бане и остужают до температуры 46±2 ⁰С.

В пробирку с 2,5 мл 0,7% МПА вносят 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл облученной культуры, в которой предполагается выход профага. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивается вращением в ладонях и выливается на поверхность 1,5% МПА.

Дополнительно ставится опыт на контроль бактериальной культуры (в пробирку с 2,5 мл 0,7% МПА вносится 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл стерильного МПБ). Содержимое пробирки тщательно перемешивается вращением в ладонях и выливается на поверхность 1,5% МПА.

Опыт на контроль бактериофага (в пробирку с 2,5 мл 0,7% МПА вносится 0,2 мл облученной культуры, в которой предполагается выход профага и 0,2 мл стерильного МПБ). Содержимое пробирки тщательно перемешивается вращением в ладонях и выливается на поверхность 1,5% МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности МПА.

Чашки Петри оставляют на горизонтальной поверхности стола до полного застывания верхнего слоя МПА, затем посевы инкубируют в термостате при температуре 36±1 ⁰С в течение 18 часов.

Учет результатов. При положительном результате на чашках Петри образуются зоны лизиса, при этом в чашках с контролем бактериальной культуры должен быть зафиксирован ровный газон культуры, а в чашке Петри с облученной культуры, в которой предполагается выход профага, отсутствие роста бактериальной культуры.

При проведении исследований было установлено, что производственный штамм бактерий Pseudomonas syringae №3 не содержит профага. Биологические свойства производственного штамма бактерий Pseudomonas syringae № 3 представлены на рисунке 9 и в таблице 10. В качестве контрольного бактериального штамма используется референс-штамм бактерий Pseudomonas syringae В-10917 из коллекции БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика.

Производственный штамм бактерий Pseudomonas syringae №3 лизируется маточными фагами в титрах по методу Аппельмана и Грациа не менее чем на 1-2 порядка выше показателей специфической активности конечного продукта (бактериофаг Ps.s-7 УлГАУ имеет показатели литической активности — 10^-8 (при определении по методу Аппельмана) и 2,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) (при определении по методу Грациа); бактериофага Ps.s-27 УлГАУ имеет показатели литической активности — 10-8 (по методу Аппельмана) и 1,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (по методу Грациа); полифаговый биопрепарат состоит из двух бактериофагов — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, которые культивировались на индикаторной культуре Pseudomonas syringae Ps.s № 3, показатель литической активности 1,0±0,2х10⁷ БОЕ/мл). При этом стабильность лизиса сохранялась после 48 часов инкубирования при температуре 28 °C.

Рисунок 9 — Культура Pseudomonas syringae №3 на среде CRL.2 после инкубирования при 25℃ в течение 48 ч

Таблица 10 — Биологические свойства производственного штамма бактерий

Примечание – «+» — положительный результат,

«-» — отрицательный результат,

«d» — вариабельный результат.

На средах CRL.2 и CRL Pseudomonas syringae №3 имела белые, матовые, растекающиеся колонии неровной формы, характеризующиеся быстрым агрессивным ростом (рис. 9).

Производственные штаммы бактерий Pseudomonas syringae №3 хранятся в специальных изолированных помещениях в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре 2 — 8 °C в течение 10 лет или в бактериологических пробирках с 0,4 — 0,7 процентной агаризованной питательной средой (на основе МПБ) под стерильным вазелиновым маслом, при температуре 2-6 °C и регулярном пересеве каждые 2-3 месяца.

2.2.3.2 Маточные бактериофаги

Для получения фаговых препаратов мы использовали только вирулентные бактериофаги. Их выделяли из природных, пассируя на штамме целевого вида бактерий — Pseudomonas syringae №3. Маточные бактериофаги включали вирулентные фаги с широким диапазоном действия по отношению к штаммам Pseudomonas syringae, обладали высокой активностью, стабильностью лизиса, специфической направленностью антимикробного действия. Характеристика кандидатных фаговых рас (штаммов) при отборе была дополнена современными молекулярно-биологическими методами (полногеномное секвенирование с последующим биоинформационным анализом). Хранение производственной коллекции бактериофагов осуществляется в жидком состоянии при температуре от 2 до 8 °C в течение 5 лет с ежегодным пересевом на бактериальных штаммах и в лиофилизированном состоянии.

Расширение диапазона действия препаратов в отношении циркулирующих бактериальных возбудителей может быть достигнуто путем подбора фаговых рас из коллекции предприятия или из природных источников. Это обеспечивает возможность выпуска производственных серий бактериофагов целевого назначения. Например, при вспышке или появлении очага инфекции, обусловленной фагоустойчивым возбудителем, передача на производство бактериального штамма – возбудителя инфекции в конкретном случае, позволит адаптировать препарат к конкретным условиям путем подбора к этому бактериальному штамму активных фаговых рас из коллекции производителя и последующего использования их при изготовлении препарата.

Характеристика биологических свойств фаговых штаммов, включенных в состав фагового биопрепарата

Бактериофаги должны иметь строго литический инфекционный цикл. Наиболее полной характеристикой, позволяющей всесторонне оценить наличие генов перехода в лизогенный цикл, факторов вирулентности и токсинов, является определение полной последовательности генома бактериофага.

Экспериментальными признаками такой классификации может служить ПЦР-типирование по наиболее консервативным генам, характерным для данной группы бактериофагов.

Каждый из фаговых штаммов, используемых в препарате:

— демонстрировал высокую специфическую литическую активность, выявляемую путем титрования в жидкой питательной среде по методу Аппельмана;

— имел высокую концентрацию (количество бляшкообразующих единиц в 1 мл), определяемую методом агаровых слоев по Грациа;

— обладал широким диапазоном литического действия на коллекции бактериальных штаммов, музейных и «полевых»;

— был изучен с помощью молекулярно-генетических методов (полногеномного секвенирования) для определения его полной нуклеотидной последовательности ДНК с последующим биоинформационным анализом.

Другими характеристиками, которые должны были определены для каждого фагового штамма, являются:

— частота генерации фагоустойчивых форм;

— длительность латентного периода в ходе инфекции;

— урожайность и величина выхода фаговых частиц из одной инфицированной бактериальной клетки.

Штамм, на котором проводится культивирование бактериофага -Pseudomonas syringae №3 — не содержал легко индуцируемых профагов, загрязняющих препарат. Оценку наличия индуцируемых профагов проводили путем обработки бактерий индукторами (ультрафиолетовым излучением, митомицином C) с последующим контролем появления бляшек лизиса, вызванного активацией умеренных бактериофагов, содержащихся в геноме бактерии.

Характеристика основных биологических фагового биопрепарата

Представленные материалы на препарат в целом, помимо характеристик на отдельные фаги, должны содержать следующую информацию:

— специфическая литическая активность, определяемая по методу Аппельмана с использованием соответствующих бактериальных тест-штаммов (контрольных штаммов), типичных по своим морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, которые не были использованы при изготовлении препарата.

Активность бактериофага, определяемая по методу Аппельмана, выражается отрицательным десятичным логарифмом, указывающим последнее разведение бактериофага в жидкой питательной среде, в которой рост бактериальной культуры визуально не наблюдается;

— диапазон действия изучаемого препарата в отношении соответствующих ему видов бактериальных возбудителей инфекций, выделенных из объектов внешней среды (пораженных растений, воды, почвы), циркулирующих в современных условиях на территории РФ (не менее 3-х регионов);

— стабильность препарата. Активность препаратов бактериофагов сохраняется при регламентированной температуре хранения. Определение стабильности препарата (способности сохранять литическую активность бактериофага) проводится по методу Аппельмана.

При проведении исследования антимикробного действия бактериофагов были обеспечены следующие условия, гарантирующие достоверность результатов:

питательные среды для культивирования бактерий, на которых изучалось антимикробное действие бактериофага, отвечали требованиям стандартности и воспроизводимости результатов;

стандартность бактериальной нагрузки (посевной дозы) штаммов-мишеней для изучаемого бактериофага.

2.2.3.3 Основные этапы производства

Производственный процесс включает в себя:

1. работу с бактериальными возбудителями,
2. подбор к ним вирулентных штаммов бактериофагов,
3. отбор бактерий — продуцентов бактериофагов,
4. получение маточных бактериофагов,
5. культивирование производственных штаммов бактерий — продуцентов и маточных бактериофагов с целью получения биомассы бактериофагов,
6. приготовление препаратов бактериофагов:

6.1 подготовка стартерных культур пары бактериофаг – штамм-хозяин.

Штамм бактерий Pseudomonas syringae №3, используемый для наработки бактериофагов, лиофилизируют, используя сублимационную сушку CoolSafe110 Freeze Dryer. Штаммы бактерий в соотношении 1:1 смешивают с защитной средой (сахароза 20 %, желатин 1 %), разливают во флаконы по 2 мл и высушивают в течение 12 ч при давлении ≤0,03 гПа и при постепенном повышении температуры от -50 до +20°С.

Фенотипически и молекулярно-генетически охарактеризованные штаммы бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ лиофилизируют по схеме, соответствующей изложенной выше в отношении штаммов бактерий, используя следующую защитную среду: сахароза 20 %, желатин 8 %.

6.2 подготовка помещения и оборудования

Перед началом дезинфекции проверяют эффективность вентиляционного оборудования и HEPA фильтров. Боксированное помещение и ламинарный бокс обрабатывают при помощи хлорамина Б. Дезинфекцию оборудования, предназначенного для розлива и укупорки флаконов с фаговым биопрепаратом, а также поддонов для флаконов и емкости для крышек, проводят 70 % раствором спирта.

6.3 приготовление расходных материалов

Перед стерилизацией осуществляют мойку стеклянной посуды. Стерилизацию лабораторной посуды осуществляют по следующему режиму: сухожаровой шкаф – 1 ч при 200 ºС. Стерилизацию емкостей большого объема и частей перистальтического насоса (силиконовый шланг) проводят в автоклаве под давлением пара 1,2 атмосферы и рабочей температуре 121 ºС, время стерилизации – 20 мин. Сухая стерилизация гамма-лучами пластиковых флаконов и крышек производится по контракту по следующей схеме: 18,5 кГр при скорости конвейера 3,0 см/сек.

6.4 приготовление питательных сред

Разливают в литровые матрасы и стерилизуют при следующих режимах: под давлением 1,2 атмосферы и рабочей температуре 121 ºС.

6.5 подготовка фаголизатов бактериофагов

Фаголизаты бактериофагов получали способом, запатентованным в РФ (патент №2525141)– с учетом модификации, приведенной выше, 4,5 мл 18-часовой бактериальной культуры Pseudomonas syringae №3 в титре 109 КОЕ/мл засевают в матрац для культивирования – скошенная плотная питательная среда толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3–3,5 ч при оптимальной температуре – 28 0С, затем на полученный газон культуры Pseudomonas syringae №3 засевают маточный бактериофаг (Ps.s-7 УлГАУ или Ps.s-27 УлГАУ) в титре 106–107 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования. Культивируют в течение 4–5 ч при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0–7,2 в количестве 9–10 мл, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют трихлорметан в количестве 1:10, выдерживают в течение 30 мин при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об./мин, отбирают надосадочную жидкость в стерильные пробирки и проверяют титр по Грациа. Полученные раздельно бактериофаги в титре не менее 10¹¹ БОЕ/мл смешивают в стерильной емкости, в равных объемах.

6.6 стерилизация фаголизата

Полученный коктейль фаголизатов фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм.

6.7 сведение компонентов фагового биопрепарата

Коктейль стерильных фильтратов фаголизатов с учетом конечного титра бактериофагов доводят до объема 100 мл, с помощью уравновешенного буфера (Hyglos) в стерильном флаконе.

6.8 розлив

Асептический розлив и укупорка во флаконы по 100 мл с крышкой, содержащей контроль первого вскрытия.

6.9 маркировка

Маркировка включает следующие сведения о продукте: наименование, указание «не для розничной продажи», наименование и местонахождение изготовителя, объем, дату изготовления и дату упаковывания, срок годности и условия хранения, номер партии.

6.10 определение срока годности фагового биопрепарата

Необходимым этапом при конструировании рецептуры и разработке технологии получения фагового биопрепарата является определение срока годности готовой формы. Для этого образцы из 6 партий продукции хранили в течение 9 месяцев при температуре 4±2°С, периодически отбирая для контроля согласно ОФС.1.1.0004.15 Отбор проб «Государственная фармакопея Российской Федерации», XIII издание, том I, 2015 год. В таблице 11 представлены данные по изучению стабильности специфической литической активности бактериофагов в разные сроки с момента выпуска продукции.

Таблица 11 – Стабильность специфической литической активности бактериофагов (по Грациа) при нормативном хранении фагового биопрепарата

6.11 контроль стерильности (микробиологической чистоты, аномальной токсичности и определение эндотоксина фагового биопрепарата)

Критические контрольные точки на этапах создания фагового биопрепарата.

В процессе производства бактериофагов на разных этапах получали промежуточные продукты, которые должны соответствовать определенному уровню качества.

При подготовке производственных штаммов бактерий контроль посевных культур бактериальных штаммов-продуцентов включал в себя следующие показатели:

— чистота;

— типичность биологических свойств;

— отсутствие легко индуцируемых профагов.

При подготовке маточных бактериофагов контроль маточных бактериофагов включал в себя следующие показатели:

содержание бляшкообразующих единиц в 1 мл — специфическая активность фаголизатов, определяемое методом агаровых слоев по Грациа (табл. 12);

литическая активность, определяемая титрованием в жидкой питательной среде по методу Аппельмана и методу Грациа на Pseudomonas syringae №3;

стабильность лизиса (сохранность полученных результатов лизиса по методу Аппельмана) в течение 48 часов инкубации при температуре 37 ± 1 °C. Температурный режим и время инкубации зависят от специфических особенностей бактерий и их фагов;

микробиологическая чистота фаголизата. Контролируемые по каждой партии фагового биопрепарата микробиологические показатели приведены в ТР ТС 029/2012 и указаны в таблице 9.

Таблица 12 – Контроль специфической активности фаголизатов

Параметры микробиологической чистоты фагового биопрепарата экспериментально производственных серий фагового биопрепарата соответствовали контрольным значениям приведенным в таблице 9. Результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что в процессе хранения готового фагового биопрепарата, состоящего из 2 бактериофагов Pseudomonas syringae (Ps.s-7 УлГАУ или Ps.s-27 УлГАУ) при температуре 4±2°С активность обоих бактериофагов не опускалась ниже нормативных значений в течение 6 месяцев (содержание БОЕ в 1 мл фагового биопрепарата более 10⁹).

Контроль микробиологической чистоты флаконов и крышек для розлива. 5 флаконов из партии отбирали в боксе из двойного пакета. Заливали 10 мл стерильного МПБ. Флаконы закрывали, тщательно встряхивали, ставили в термостат при 37 ºС и 25 ºС на 48 ч. Затем, из каждого флакона, делали высев 0,1 мл на чашки с плотными питательными средами (кровяной агар, Сабуро) методом spot-теста. Инкубировали при 37 ºС 24 часа на кровяном агаре и при 25 ºС – 72 часа на среде Сабуро. После инкубации контролировали наличие или отсутствие роста на чашках. Стерильным пинцетом выбирали 5 крышек из партии, замачивали в емкости с 250 мл стерильной жидкой питательной среды (МПБ). Емкость закрывали, ставили в термостат при 37 ºС и 25 ºС на 48 ч, после чего повторяли методику высева и учета результатов в соответствие с процедурой, приведенной для флаконов.

Контроль фаголизата на аномальную токсичность

Объем 1 мл фаголизата вводили внутрибрюшинно 5 здоровым мышам обоего пола. После введения фаголизата наблюдали за животным в течение 7 суток. Фаговый биопрепарат считался прошедшим испытание, так как в течение вышеназванного срока наблюдения не погибло ни одно из подопытных животных.

Определение эндотоксина в фаговом биопрепарате

Определение уровня эндотоксина после рабочего разведения фагового биопрепарата (до титра каждого бактериофага 109 БОЕ/мл) определяли с помощью реакции гелирования лизата амебоцитов крови мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛтест). Предельные значения уровня эндотоксина составляло не более 50 ЕЭ/мл.

Для получения жидкого препарата после финальной стадии бактериофаг разливали по флаконам и укупоривали.

Для получения других форм препаратов бактериофагов: в концентрированный бактериофаг добавляли стабилизаторы и лиофилизировали; сухую массу бактериофага контролировали в тестах на специфическую активность и микробиологическую чистоту; готовый продукт контролировали по всем показателям, указанным выше.

К специфическим методам исследования, используемым для характеристики бактериофагов, относятся методы Аппельмана и Грациа.

Транспортирование и хранение

Транспортирование осуществляется при температуре от 2 до 8 °C, в пределах 1 месяца — допускается при температуре от 9 до 25 °C.

Хранение в сухом, защищенном от света и недоступном для детей месте при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 — 2 лет. Однако возможно расширение температурного режима хранения до 25 °C при подтверждении активности препарата в течение заявленного срока годности.

2.2.4. Разработка методологии индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции

При подборе оптимального времени экспозиции бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ с исследуемым материалом (в эксперименте использовался стерильный мясо-пептонный бульон) было установлено, что этап «предварительное подращивание» применять в схеме постановки эксперимента нецелесообразно, так как определено, что культивирование системы «бактериофаг — исследуемый материал» при температуре 28 ± 1 0С в течение 3,5 часов позволяет выявить бактерии Pseudomonas syringae при методом РНФ в концентрации 10³ м.к./мл. Увеличение экспозиционного времени не повышает качества реакции. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 12.

Далее эксперименты были направлены на отработку параметров постановки РНФ на тест-объектах (семена огурца, проба почвы, речная вода), которые были контаминированы бактериями Pseudomonas syringae в концентрации 10³ – 10⁷ м.к./мл (г) в лабораторных условиях. Схема эксперимента отражена на рисунке 1. Полученные нами результаты экспериментов представлены в таблицах 13-15.

Таблица 12 – Результаты постановки реакции нарастарния титра фага с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в стерильном мясо-пептонном бульоне

Таблица 13 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ на семенах огурца

Таблица 14 – Результаты экспериментов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в пробе почвы

Таблица 15 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в пробе речной воды

Принимая во внимание полученные нами положительные результаты экспериментов по индикации бактерий Pseudomonas syringae в концентрации 10³ м.к./г (мл) бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ на пробах семян огурца, почвы и речной воды, было принято решение провести исследования на тех же тест-объектах с применением фагового биопрепарата, состоящего из вышеназванных бактериофагов. Применение бактериофагов в составе полифагового биопрепарата позволило бы сократить затраты расходных материалов и трудозатраты на исследования. Таким образом, продолжительность постановки РНФ с бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ составляет 23 часа, включающие этап подготовки реакции 30 минут + 3,5 часа — время термостатирования посевов + этап очистки субстрата трихлорметаном — 30 минут + высев субстрата методом агаровых слоев — 30 минут + 18 часов — время термостатирования посевов = 23 часа. В расчет времени не был включен этап предварительной подготовки бактериофага до концентрации 10³ БОЕ/мл.

Следующий этап исследований – это отработка схемы постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae фаговым биопрепаратом (два бактериофага — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ — культивировались в одном флаконе) на следующих тесмт-объектах: почве, речной воде, семенах огурца, товарных томатах, огурцах и цуккини. Результаты экспериментов отражены в таблицах 16-22.

Результаты постановки РНФ на тест объекте – семенах огурца –показали, что выявленная при помощи фагового биопрепарата концентрация бактерий Pseudomonas syringae составила 10³ м.к./мл, то есть визуально нами было подсчитано, что количество бляшкообразующих единиц бактериофагов на опытных чашках Петри в сравнении с контрольными увеличилось примерно в 8 раз.

Из материалов таблицы 17 следует, что эффективность РНФ в пробе почвы показала, что обнаруживаемая в пробе почвы концентрация бактерий Pseudomonas syringae — это 10⁴ м.к./г. Согласно вышезаявленным критериям оценки результатов постановки РНФ полученные результаты не являются положительными. Было зафиксировано снижение «чувствительности» реакции, что, по нашему мнению, связано с адаптацией искусственно вносимой бактериальной культуры на тест-объекте, и его структурой, которые, возможно, усложняют адсорбцию бактериофагов на индикаторной культуре.

Таблица 16 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе семян огурца

Таблица 17 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе почвы

С целью повышения эффективности РНФ мы решили снизить исходную концентрацию изучаемого фагового биопрепарата с 10³ БОЕ/мл до 10² БОЕ/мл. Далее мы поставили реакцию по ранее описанному алгоритму. Результаты отражены в таблице 18.

Таблица 18 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе почвы (титр фага 10² БОЕ/мл)

Таблица 19 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе речной воды

Экспериментально было установлено, что снижение исходного титра полифагового биопрепарата до концентрации 10² БОЕ/мл позволило провести индикацию бактерий Pseudomonas syringae в концентрации 10³ мк/г почвы.

Результаты постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae фаговым биопрепаратом в пробе речной воды представлены в таблице 19. В исследованиях пробы воды речной были получены результаты, сходные с данными эксперимента на пробе семян огурца. Концентрация выявленных бактерий Pseudomonas syringae составила 10³ м.к./мл.

Таблица 20 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе томатов

Таблица 21 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе цуккини

Таблица 22 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе огурцов

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, которую можно определить в вышеназванных пробах, используя данный метод составила 10³ м.к./г. Свободный бактериофаг не обнаружен ни в одном из экспериментов.

Таким образом, все проведенные исследования и полученные в ходе них данные принципиально не расходятся с данными аналогичных исследований на иных бактериальных агентах (Г.Р. Садртдинова, 2017; Н.В. Пименов и др., 2019), и позволяют рекомендовать данный алгоритм в качестве метода индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae в пробах почвы, воды, семенном материале и товарных овощах (томатах, огурцах и цуккини). Длительность исследования составляет 23 часа, простота постановки РНФ не требует высокой квалификации исследователя и сложнотехнического оснащения лаборатории.

2.2.5 Изучение эффективности применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства нами были проведены исследования проб семенного материала (семена огурцов некоммерческого (домашние) пробы под номерами 1-4, 10-11 и коммерческого происхождения – пробы № 5-9), проб почвы (ПФО – 1-10, ЮФО – 11-20, ЦФО -21-30), воды (1-5 пробы — р. Волга, 6-9 пробы — р. Свияга, 9 проба р. Гуща, 10 проба – р. Сура, 11 – р. Малый Черемшан, 12 проба – р. Майна, 13 проба – р. Большой Черемшан), растительной продукции (цуккини, томаты, огурцы плоды и семенной материал), приобретенной на продовольственных рынках г. Ульяновска и г. Димитровграда на наличие бактерий вида Pseudomonas syringae с помощью специфических бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ.

Материал для исследований отбирали в соответствии с требованиями, указанными в ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов (с Изменением № 1)

Обнаружение бактерий вида Pseudomonas syringae проводили бактериологическим методом по авторской схеме (рис. 10) и с помощью реакции нарастания титра фага.

При индентификации выделенных штаммов из объектов санитарного надзора мы определяли следующие свойтва бактерий: морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические. Определение тинкториальных свойств (окраска по Грамму, подвижность культуры, образование спор) проводили по стандартной методике.

Для изучения биохимических свойств выделенных штаммов из окружающей среды мы определяли у них наличие оксидазы, каталазную активность, способность использовать источников углерода (глюкозу, лактозу, сахарозу, маннозу, сорбит), использование аргинингидролазы, способность к гидролизу эскулина, желатина и крахмала, а также продукцию сероводорода. Устойчивость штаммов к абиотическим факторам: рост при среде 5 % концентрации NaCl, действие температурного фактора (рост при +41^оС). Определение каталазной активности проводили с применением 3% раствора перекиси водорода. На суточную культуру бактерий, засеянную на МПА (культивирование при температуре 28⁰С в течение 24 часов), наносили 2 капли 3% раствора перикиси водорода. Реакция считалась положительной, если на поверхности МПА образовывались пузырьки.

Высевали суточную культуру на картофельный агар (культивирование при температуре 28⁰С в течение 24 часов), добавляли раствор Люголя для определения гидролиза крахмала.

Тест на оксидазу проводили экспресс методом. Суточные культуры наносили на диски (оксидазные диски HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), результаты оценивали по изменению цвета дисков.

Протеолитическую активность определяли на среде с питательным желатином. К МПБ добавляли 15% желатин, нагревали до полного его набухания, после стерилизации при 0,5 атм разливали в пробирки по 5 мл. На эти пробирки высевали культуры. Результаты смотрели 1-3 суток. Наличие протеолитических ферментов выделяемых в процессе роста культуры наблюдали разжижение столбика.

Суть определения аргинингидралазы состоит в том, что бактерии, обладающие аргинингидралазой, образуют из аргинина NH₃ в анаэробных условиях, что сопровождается защелачиванием среды и изменением цвета индикатора. Обычно этот метод используется для дифференциации псевдомонад.

Индол определяли с помощью реактива Ковача, способность к окислению углеводов определяли в аэробных условиях с помощью цветного ряда Гисса, определяли реакцию на образование сероводорода.

Для определения роста при 41^оС, суточную культуру высевали на МПА и помещали в термостат при 41^оС на 24 часа. Результаты учитывали по росту колонии на чашке. Паралелльно определяли рост в среде с 5% NaCl, культуру засевали на МПА с 5% NaCl и инкубировали в термостате при 28^оС на 24 часа.

Окислительно-ферментативный тест на использование глюкозы (тест ХьюЛейфсона). Для определения анаэробной ферментации (O/F). Готовили среду (пептон ферментативный, NаС1, К2НР04, агар-агар, дистиллированная вода; после автоклавирования при 0,5 атм. вносили бромтимоловый синий), разливали на 2 пробирки и суточные культуры засевали уколом параллельно в 2 пробирки, затем на одну пробирку заливали стерильным вазелином. Результаты регистрировали ежедневно в течение 3 суток. Изменения смотрят по окраске индикатора. Кислота образуется вначале только в верхней части. Если же микроорганизмы не катаболизируют углевод, то кислота не образуется ни в одной из пробирок. Если микроорганизмы образуют кислоту в открытой пробирке (О-реакция) с окислительным типом метаболизма.

Липолитическую активность (ТВИНазную) определяли с помощью Tween-80, лецитиназную активность. Липолитическая (твиназная) активность используют для идентификации бактерий рода Pseudomonas. Твины – это эфиры спиртов (сорбитол, маннитол и др.) и жирные кислоты. Твин 80 является эфиром олеиновой кислоты. Под действием бактериальных липаз жирные кислоты отщепляются, затем осаждаются в виде мыла присутствующими в питательной среде ионами кальция. Весь этот процесс сопровождается помутнением среды. Для выполнения работ готовили среду (дистиллированная вода, пептон, NaCl, СaCl₂·2H2O, агар-агар), после автоклавирования при 1,5 атм к среде добавляли Твин 80 и стерилизовали при 0,5 атм. Затем перемешивали и разливали в чашки Петри. Суточные культуры засевали на поверхность среды медальонами и инкубировали в течение 7 суток. Результаты смотрели по образованию вокруг бляшек замутнения.

Определение лецитиназной активности: готовили яично-желточную плотную среду (300 мл стерильного, охлажденного до 45-50^оС мясопептонного агара добавляли 1 желток куриных яиц. Смесь тщательно перемешивали и разливали в чашки Петри). Затем суточные культуры засевали в чашки, инкубировали в течение 24 часов при 28^оС. Если реакция будет положительной вокруг колонии формируется небольшой ареол, отливающий металлическим блеском. При отрицательной реакции цвет среды вокруг колонии не изменяется.

Образование левана на среде с 5% сахарозой. Тест на продукцию левана используют для установления видовой принадлежности бактерии рода Pseudomonas. Многие бактерии из рода Pseudomonas утилизируют сахарозу в качестве источника углерода и продуцируют из нее леван, это свидетельствует о наличии фермента левансахаразы. Для исследований мы засевали суточные культуры на МПА с 5% сахарозой. Результаты учитывали в течение 1-3 суток. Если на среде с сахарозой культуры образуют белые, мукоидные, тянущиеся колонии, то это свидетельствует продуцирование левана.

Определение гиперчувствительности состоит в том что, если заразить растение фитопатогенными бактериями, не являющимися патогенным для этого вида растений, на месте введения бактерий запускаются быстрые механизмы защитного ответа в виде почернения и усыхания. Для работы суточные культуры на скошенном агаре смывали 3-4 мл физиологическим раствором и 15-20 мкл вводили в мякоть листа с помощью стерильного шприца. В качестве контроля использовали стерильный физиологический раствор. Результаты смотрели через 1-3 суток.

Общее время исследований по схеме занимает 192 часа.

Каждую исследуемую пробу массой/объемом 10 мл вносили в стерильную колбу, содержащую 90 мл стерильного МПА (рН 7,2-7,4) в соотношении 1:10. Содержимое колбы встряхивали в шуттель-аппарате в течение 15 минут с последующим отстаиванием взвеси в течение 10 минут. Далее работали по методике, отраженной на рисунках 10-17.

Рисунок 10 – Бактериологическая схема идентификации бактерий Pseudomonas syringae

Результат реакции нарастания титра фага учитывали путем подсчета бляшкоообразующих единиц фага в опытных и контрольных чашках. Оценку реакции проводили в соответствии с показателями таблицы 23. Положительная реакция характеризовалась увеличением количества бляшкообразующие единиц фага по сравнению с контролем в 5 и более раз.

При исследовании 11 проб семян огурцов бактериологическим методом на наличие в них бактерий Pseudomonas syringae было обнаружено наличие искомых микроорганизмов в пробах № 3 и № 11.

Таблица 23 — Оценка реакции нарастания титра фага (РНФ)

Рисунок 11 – Рост Pseudomonas syringae (полевой штамм, выделенный из пробы семян огурцов № 5) на среде Кинг Б в течение 24 часов при температуре 28°С (под УФ лучами виден флюоресцирующий оттенок)

Рисунок 12 – Реакция на аргинингидролазу у Pseudomonas syringae (первая пробирка с полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 5) — с вазелиновым маслом, вторая пробирка полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 5) — без вазелинового масла, третья пробирка — контроль) (время экспозиции 24 часа при температуре 28⁰С)

Рисунок 13 — O/F тест (определение анаэробной ферментации) слева пробирка контроль, по середине пробирка с вазелиновым маслом (полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 7), справа пробирка без вазелинового масла (полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 7)

Рисунок 14 — Объекты исследований – семена огурцов

Рисунок 15 — Объект исследований — цуккини

Рисунок 16 — Объект исследований – огурцы

Рисунок 17 — Объекты исследований – томаты и огурцы

Реакция нарастания титра фага с использованием фагового биопрепарата, включающего фаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ также дала положительный результат индикации бактерии вида Pseudomonas syringae в исследуемых пробах семян огурцов № 3 и № 11. Результаты исследований представлены в таблице 24. Бактериологическим методом также в данных пробах были выделены и идентифицированы бактерии вида Pseudomonas syringae.

Таблица 24 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах семян огурца

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

При исследовании 12 проб огурцов бактериологическим методом на наличие в них бактерий Pseudomonas syringae было обнаружено наличие искомых микроорганизмов в пробах № 5 и № 7.

Таблица 25 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах огурцов

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Поставив реакцию нарастания титра фага с использованием скунструированного авторами фагового биопрепарата, включающего фаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ мы получили положительные результаты индикации бактерии вида Pseudomonas syringae в исследуемых пробах огурцов № 5 и № 7. Результаты исследований представлены в таблице 26.

Изучение 12 проб цуккини на наличие бактерий Pseudomonas syringae бактериологическим методом показало, что пробы под номерами 6 и 7 кокнтаминированы вышеназванными микроорганизмами.

Таблица 26 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах цуккини

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Используя предлагаемый метод фагоиндикации, авторами в пробах № 6 и № 7 цуккини были также выявлены бактерии Pseudomonas syringae, так как титр фагового биопрепарата увеличился в 5 раз и более.

Дальнейшие исследования проводились на пробах томатов. Применяя авторскую бактериологическую схему выделения и идентификации бактерий Pseudomonas syringae, было установлено обсеменение проб томатов под номерами 3, 8 и 10. Последующие эксперименты по фагоиндикации подтвердили полученные бактериологическим методом результаты (табл. 27).

Таблица 27 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах томатов

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Анализируя данные, полученные при исследовании 13 проб томатов было установлено, что 3 пробы были контаминированы бактериями Pseudomonas syringae, так как титр фагового биопрепарата увеличился в 5 раз и более в опыте по сравнению с контролем.

Изучение речной воды методом постановки РНФ с 13 пробами показало, что в пробах 1, 8 и 11 было установлено увеличение титра фага в опыте по сравнению с контролем, что свидетельствует о наличии в данных пробах бактерий вида Pseudomonas syringae. Использование в исследованиях авторской бактериологической схемы выделения и идентификации бактерий Pseudomonas syringae позволило также в вышеназванных пробах обнаружить бактерии Pseudomonas syringae.

Таблица 28 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах воды речной

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

При исследовании проб почвы различного хозяйственного назначения Приволжского, Южного и Центрального федеральных округов было установлено, что уровень контаминации бактериями вида Pseudomonas syringae составил 20 %, то есть увеличение титра фага было зафиксировано в 5 пробах под номерами 5, 7, 15, 18, 22, 28. В данных пробах также были выделены вышеназванные бактерии бактериологическим методом.

Таблица 29 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах почвы

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Проведенные нами исследования по идентификации выделенных бактериальных культур бактериологическим методом отражены в таблицах 30-31.

Таблица 30 – Биологические свойства выделенных бактериальных культурр из проб объектов санитарного надзора

Примечание: «+» — положительная реакция, «-» — отрицательная реакция.

Таблица 31 – Биологические свойства выделенных бактериальных культурр из проб почвы

Примечание: «+» — положительная реакция, «-» — отрицательная реакция.

Из данных таблиц 30-31 видно, что у выделенных бактериальных культур зафиксированы отрицательные результаты по тестам на оксидазу и аргинингидралазу, определена продукция каталазы. По литературным данным бактерий Pseudomonas syringae гидролизуют желатин вариабельно, по нашим исследованиям оба референс-штамма не разжижают желатин. О/F тест положительный. Липолитическая (твиназная) активность регистрировалась, лецитиназная активность не фиксировалась. Изучаемые бактериальные штаммы образуют леван, индол не выделяют, не растут на МПА при температуре 41ºС. Ферментируют глюкозу, сахарозу, маннозу и сорбит. Тест на мацерацию ткани картофеля через 24 часа – результат отрицателен. Реакция на гиперчувствительность ткани положительная, что соответствует литературным данным.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что выделенные штаммы Pseudomonas syringae обладают типовыми свойствами.

Изучение эффективности применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции показало, что реакция нарастания титра фага не уступает по эффективности бактериологическому методу выделения и идентификации вышеназванных бактерий. Очевидна также экономия расходных материалов и трудозатрат при ее постановке по сравнению с бактериологическим методом. Необходимо также отметить и сокращение времени исследования с 192 часов до 23 часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактериальные фитопатогены значительно снижают урожайность сельскохозяйственных культур и, следовательно, наносят значительный экономический ущерб и представляют угрозу для продовольственного обеспечения растущего мирового населения. В этом контексте бактериофаги исследуются как агенты биоконтроля, позволяющие своевременно провести индикацию специфичного микроорганизма, предотвратить распростронение заболевания и снизить экономический ущерб.

Цель работы – разработать экологически безопасный биологический препарат на основе специфических бактериофагов, который позволит проводить биоконтроль растений на наличие бактерий Pseudomonas syringae на разных стадиях (посевной материал, в период вегетации и при хранении).

Первый этап работы — конструирование фагового биопрепарата на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующихся определенными биологическими свойствами. Для этого были изучены биологические свойства 8 бактериофагов активных в отношении Pseudomonas syringae. Отобраны 2 наиболее производственно-перспективных штамма фагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ с максимально широким спектром литического действия и явно выраженной специфичностью, максимально высоким титром литической активности при хранении, устойчивостью к факторам внешней среды, отсутствием в геноме «локусов патогенности».

Ps.s-7 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10^-8 (при определении по методу Аппельмана) и 2,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) (при определении по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; в исследованиях установлена устойчивость к температуре до 60⁰С в течение 30 минут и трихлорметану в соотношении 1:10 (временная экспозиция 35 минут).

Ps.s-27 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10^-8 (по методу Аппельмана) и 1,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; определено, что бактериофаг устойчив к воздействию температуры до 60⁰С в течение 30 минут и трихлорметана в соотношении 1:10 (время экспозиции составило 35 минут).

Произведен подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов (разработаны количественные и качественные параметры культивирования – соотношение системы фаг/индикаторная культура: 1/1 – 0,2 мл/0,2 мл, подобрана оптимальная методики очистки фагового биопрепарата – многоступенчатая мембранная фильтрация, произведен контроль микробиологической чистоты, аномальной токсичности и определено отсутствие эндотоксина в фаговом биопрепарате).

Разработана пилотная технология получения экспериментального фагового биопрепарата, позволяющая нарабатывать средство для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae с высоким титром фаговых частиц, включающая многоступенчатую схему контрольно-испытательных мероприятий. Таким образом, фаговый биопрепарат Pseudomonas syringae представляет собой прозрачную жидкость от светло-желтого до желтого цвета, розлитую в стеклянные флаконы под резиновую пробку и алюминиевый колпачок объемом 100-500 мл, титр фага не менее 10⁸ БОЕ/мл, условия хранения: 2-4 ⁰С в течение 12 месяцев при относительной влажности воздуха 70-80 %, при транспортировании необходимо учитывать хрупкость упаковки.

Далее при проведении исследований по разработке параметров практического применения фагового биопрепарата Pseudomonas syringae с целью индикации в пробах воды, почвы, в семенном материале и продуктах питания — товарных овощах (томатах, огурцах и цуккини) в реакции нарастания титра фага было определено, что культивирование системы: бактериофаг-проба при температуре 28 ± 1 ⁰С в течение 3,5 часов позволяет выявить в вышеназванных тест-объектах бактерии Pseudomonas syringae методом РНФ в концентрации 10³ м.к./г (мл). Увеличение экспозиционного времени не повышает качества реакции. Бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в монокультуре были использованы в экспериментах в концентрации 10³ БОЕ/мл.

При тестировании в РНФ полифагового биопрепарата на основе вышеназванных бактериофагов было установлено, что в исследованиях пробы воды речной и семенном материале (огурца) были получены результаты, сходные с данными эксперимента на пробах товарных томатов, огурцов и цуккини. Концентрация выявленных бактерий Pseudomonas syringae составила 10³ м.к./мл. Экспериментально было установлено, что снижение исходного титра полифагового биопрепарата до концентрации 10² БОЕ/мл позволяет провести индикацию бактерий Pseudomonas syringae в пробе почы в концентрации 10³ мк/г.

Полученные данные позволят в перспективе использовать реакцию нарастания титра фага в качестве ускоренного и методически простого метода тестирования продуктов питания (товарных овощей), семенного материала, проб почвы и воды на наличие фитопатогенного бактериального агента Pseudomonas syringae. В случае положительного результата разработать систему мероприятий по их санации специфичным и экологически чистым фаговым биопрепаратом.

На основании полученных данных разработана нормативно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Pseudomonas syringae» и «Методические рекомендации по индикации бактерий Pseudomonas syringae».

Сельскохозяйственным и перерабатывающим предприятиям предложен новый биопрепарат на основе консорциума 2 бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae, для биоконтроля фитопатогена в объектах внешней среды и объектах растениеводства и разработана методика его применения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Xin X. F., Kvitko B., He S. Y. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen //Nature Reviews Microbiology. – 2018. – Т. 16. – №. 5. – С. 316.
2. Jones J. B. et al. Bacteriophages for plant disease control //Annu. Rev. Phytopathol. – 2007. – Т. 45. – С. 245-262.
3. Stone A., Baker B. Organic management of late blight of potato and tomato with copper products. – 2017. URL: https://eorganic.org/node/573
4. O’Leary B. M. et al. Early changes in apoplast composition associated with defence and disease in interactions between Phaseolus vulgaris and the halo blight pathogen Pseudomonas syringae pv. phaseolicola //Plant, cell & environment. – 2016. – Т. 39. – №. 10. – С. 2172-2184.
5. Moyano L. et al. Bacteriophytochromes from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 modulate the early stages of plant colonization during bacterial speck disease //European Journal of Plant Pathology. – 2020. – Т. 156. – №. 3. – С. 695-712.
6. Hadley J., Radford P. The Use of Copper-based Formulations on Pseudomonas Syringae Pv. Actinidiae //Caribbean Journal of Science. – 2018. – Т. 51. – №. 2. – С. 380-383.
7. Monteil C. L. et al. Population-genomic insights into emergence, crop adaptation and dissemination of Pseudomonas syringae pathogens //Microbial genomics. – 2016. – Т. 2. – №. 10. Doi 10.1099/mgen.0.000089 URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5359406/
8. Durairaj K. et al. Characterization and assessment of two biocontrol bacteria against Pseudomonas syringae wilt in Solanum lycopersicum and its genetic responses //Microbiological research. – 2018. – Т. 206. – С. 43-49.
9. Xin X. F., Kvitko B., He S. Y. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen //Nature Reviews Microbiology. – 2018. – Т. 16. – №. 5. – С. 316.
10. Yoo S. J. et al. Aspergillus terreus JF27 Promotes the Growth of Tomato Plants and Induces Resistance against Pseudomonas syringae pv. tomato //Mycobiology. – 2018. – Т. 46. – №. 2. – С. 147-153.
11. Yu J. G. et al. Isolation and characterization of bacteriophages against Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing bacterial canker disease in kiwifruit //J. Microbiol. Biotechnol. – 2016. – Т. 26. – №. 2. – С. 385-393.
12. Rombouts S. et al. Characterization of novel bacteriophages for biocontrol of bacterial blight in leek caused by Pseudomonas syringae pv. porri //Frontiers in microbiology. – 2016. – Т. 7. – С. 279.
13. Pinheiro L. A. M. et al. Efficiency of Phage φ6 for Biocontrol of Pseudomonas syringae pv. syringae: An in Vitro Preliminary Study //Microorganisms. – 2019. – Т. 7. – №. 9. – С. 286.
14. Yu J. G. et al. Environmental Microbiology/Microbial Diversity: Isolation and Characterization of Bacteriophages Against Pseudomonas syringae pv. actinidiae Causing Bacterial Canker Disease in Kiwifruit //Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2016. – Т. 26. – №. 2. – С. 385-393.
15. Buttimer C. et al. Bacteriophages and bacterial plant diseases //Frontiers in microbiology. – 2017. – Т. 8. – С. 34.
16. Quiñones-Aguilar E. E. et al. Bacteriophages in the biological control of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, causal agent of halo blight in bean //Ecosistemas y Recursos Agropecuarios. – 2018. – Т. 5. – №. 14. – С. 191-202.
17. Jagdale S. et al. Green approach to phytopathogen: Characterization of lytic bacteriophages of Pseudomonas sp., an etiology of the bacterial blight of pomegranate //Microbiological research. – 2019. – Т. 228. – С. 126300.
18. Yin Y. et al. Isolation and characterisation of phages against Pseudomonas syringae pv. actinidiae //Acta Agriculturae Scandinavica, Section B—Soil & Plant Science. – 2019. – Т. 69. – №. 3. – С. 199-208.
19. Rombouts S. Management of the bacterial pathogens Xanthomonas campestris pv. campestris and Pseudomonas syringae pv. porri in cabbage and leek production using novel bacteriophages. – 2017.
20. James S. L. et al. Isolation, Characterisation and Experimental Evolution of Phage that Infect the Horse Chestnut Tree Pathogen, Pseudomonas syringae pv. aesculi //Current Microbiology. – 2020. – С. 1-10.
21. Valin H. et al. The future of food demand: understanding differences in global economic models //Agricultural Economics. – 2014. – Т. 45. – №. 1. – С. 51-67.
22. High Level Panel of Experts. Agroecological and other innovative approaches for sustainable agriculture and food systems that enhance food security and nutrition. – 2019.
23. Buttimer C. et al. Bacteriophages and bacterial plant diseases //Frontiers in microbiology. – 2017. – Т. 8. – С. 34.
24. Lugo A. J. et al. Copper resistance in Xanthomonas campestris pv. campestris affecting crucifers in Trinidad //European journal of plant pathology. – 2013. – Т. 136. – №. 1. – С. 61-70.
25. Bondarczuk K., Piotrowska-Seget Z. Molecular basis of active copper resistance mechanisms in Gram-negative bacteria //Cell biology and toxicology. – 2013. – Т. 29. – №. 6. – С. 397-405.
26. Bosmans L. et al. Efficacy of hydrogen peroxide treatment for control of hairy root disease caused by rhizogenic agrobacteria //Journal of applied microbiology. – 2016. – Т. 121. – №. 2. – С. 519-527.
27. Sundin GW, Wang N: Antibiotic resistance in plant-pathogenic bacteria. In Annual Review of Phytopathology, , vol 56. Edited by Leach JE, Lindow S. 2018:161-180.
28. van Lenteren J. C. et al. Biological control using invertebrates and microorganisms: plenty of new opportunities //BioControl. – 2018. – Т. 63. – №. 1. – С. 39-59.
29. Holtappels D. et al. Protection of phage applications in crop production: A patent landscape //Viruses. – 2019. – Т. 11. – №. 3. – С. 277.
30. Narayanasamy P. Detection and Identification of Viral Biological Control Agents //Biological Management of Diseases of Crops. – Springer, Dordrecht, 2013. – С. 431-469.
31. Vicente J. G., Holub E. B. X anthomonas campestris pv. campestris (cause of black rot of crucifers) in the genomic era is still a worldwide threat to brassica crops //Molecular plant pathology. – 2013. – Т. 14. – №. 1. – С. 2-18.
32. Ansaldi M. et al. Antibacterial applications of bacteriophages //Virologie. – 2020. – Т. 24. – №. 1. – С. 23-36.
33. Sundin G. W. et al. Bacterial disease management: challenges, experience, innovation and future prospects: challenges in bacterial molecular plant pathology //Molecular plant pathology. – 2016. – Т. 17. – №. 9. – С. 1506-1518.
34. Carstens A. B. et al. Unlocking the potential of 46 new bacteriophages for biocontrol of Dickeya solani //Viruses. – 2018. – Т. 10. – №. 11. – С. 621.
35. Zaczek-Moczydłowska M. A. et al. Phage cocktail containing Podoviridae and Myoviridae bacteriophages inhibits the growth of Pectobacterium spp. under in vitro and in vivo conditions //PloS one. – 2020. – Т. 15. – №. 4. – С. e0230842.
36. Carstens A. B. et al. A novel six-phage cocktail reduces Pectobacterium atrosepticum soft rot infection in potato tubers under simulated storage conditions //FEMS microbiology letters. – 2019. – Т. 366. – №. 9. – С. fnz101.
37. Buttimer C. et al. Novel N4-Like bacteriophages of Pectobacterium atrosepticum //Pharmaceuticals. – 2018. – Т. 11. – №. 2. – С. 45.
38. Voronina M. V. et al. Characterization of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum bacteriophage PP16 prospective for biocontrol of potato soft rot //Microbiology. – 2019. – Т. 88. – №. 4. – С. 451-460.
39. Wei C. et al. Developing a bacteriophage cocktail for biocontrol of potato bacterial wilt //Virologica Sinica. – 2017. – Т. 32. – №. 6. – С. 476-484.
40. Wang X. et al. Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato //Nature biotechnology. – 2019. – Т. 37. – №. 12. – С. 1513-1520.
41. Elhalag K. et al. Potential use of soilborne lytic Podoviridae phage as a biocontrol agent against Ralstonia solanacearum //Journal of basic microbiology. – 2018. – Т. 58. – №. 8. – С. 658-669.
42. Rahimi-Midani A., Choi T. J. Transport of Phage in Melon Plants and Inhibition of Progression of Bacterial Fruit Blotch //Viruses. – 2020. – Т. 12. – №. 4. – С. 477.
43. Rahimi-Midani A. et al. Potential use of newly isolated bacteriophage as a biocontrol against Acidovorax citrulli //Archives of microbiology. – 2020. – Т. 202. – №. 2. – С. 377-389.
44. Kimmelshue C., Goggi A. S., Cademartiri R. The use of biological seed coatings based on bacteriophages and polymers against Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis in maize seeds //Scientific reports. – 2019. – Т. 9. – №. 1. – С. 1-11.
45. Holtappels D. et al. Preparing for the KIL: receptor analysis of Pseudomonas syringae pv. porri phages and their impact on bacterial virulence //International journal of molecular sciences. – 2020. – Т. 21. – №. 8. – С. 2930.
46. Ogunyemi S. O. et al. Identification and characterization of five new OP2-related Myoviridae bacteriophages infecting different strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae //Journal of Plant Pathology. – 2019. – Т. 101. – №. 2. – С. 263-273.
47. Pinheiro L. A. M. et al. Use of phage ϕ6 to inactivate Pseudomonas syringae pv. actinidiae in kiwifruit plants: In vitro and ex vivo experiments //Applied microbiology and biotechnology. – 2020. – Т. 104. – №. 3. – С. 1319-1330.
48. Flores O. et al. Characterization of Bacteriophages against Pseudomonas Syringae pv. Actinidiae with Potential Use as Natural Antimicrobials in Kiwifruit Plants //Microorganisms. – 2020. – Т. 8. – №. 7. – С. 974.
49. Rabiey M. et al. Phage biocontrol to combat Pseudomonas syringae pathogens causing disease in cherry //Microbial biotechnology. – 2020. – Т. 13. – №. 5. – С. 1428-1445.
50. Schwarczinger I. et al. Characterization of Myoviridae and Podoviridae family bacteriophages of Erwinia amylovora from Hungary-potential of application in biological control of fire blight //European Journal of Plant Pathology. – 2017. – Т. 149. – №. 3. – С. 639-652.
51. Born Y. et al. Engineering of bacteriophages Y2: dpoL1-C and Y2:: luxAB for efficient control and rapid detection of the fire blight pathogen, Erwinia amylovora //Applied and environmental microbiology. – 2017. – Т. 83. – №. 12.
52. Álvarez B., López M. M., Biosca E. G. Biocontrol of the major plant pathogen Ralstonia solanacearum in irrigation water and host plants by novel waterborne lytic bacteriophages //Frontiers in microbiology. – 2019. – Т. 10. – С. 2813.
53. Ibrahim Y. E., Saleh A. A., Al-Saleh M. A. Management of asiatic citrus canker under field conditions in Saudi Arabia using bacteriophages and acibenzolar-S-methyl //Plant disease. – 2017. – Т. 101. – №. 5. – С. 761-765.
54. Balogh B., Nga N. T. T., Jones J. B. Relative level of bacteriophage multiplication in vitro or in phyllosphere may not predict in planta efficacy for controlling bacterial leaf spot on tomato caused by Xanthomonas perforans //Frontiers in microbiology. – 2018. – Т. 9. – С. 2176.
55. Gašić K. et al. Complete genome of the Xanthomonas euvesicatoria specific bacteriophage KΦ1, its survival and potential in control of pepper bacterial spot //Frontiers in microbiology. – 2018. – Т. 9. – С. 2021.
56. Dong Z. et al. Isolation and characterization of a novel phage Xoo-sp2 that infects Xanthomonas oryzae pv. oryzae //Journal of General Virology. – 2018. – Т. 99. – №. 10. – С. 1453-1462.
57. Mahlein A. K. et al. Hyperspectral sensors and imaging technologies in phytopathology: state of the art //Annual review of phytopathology. – 2018. – Т. 56. – С. 535-558.
58. Abdullah A. S. et al. Host–multi-pathogen warfare: pathogen interactions in co-infected plants //Frontiers in plant science. – 2017. – Т. 8. – С. 1806.
59. Bergsma-Vlami M. et al. Phylogenetic Assignment of Ralstonia pseudosolanacearum (Ralstonia solanacearum Phylotype I) Isolated from Rosa spp //Plant disease. – 2018. – Т. 102. – №. 11. – С. 2258-2267.
60. Quibod I. L. et al. The Green Revolution shaped the population structure of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae //The ISME journal. – 2020. – Т. 14. – №. 2. – С. 492-505.
61. Timilsina S. et al. Xanthomonas diversity, virulence and plant–pathogen interactions //Nature Reviews Microbiology. – 2020. – Т. 18. – №. 8. – С. 415-427.
62. Ross A., Ward S., Hyman P. More is better: selecting for broad host range bacteriophages //Frontiers in microbiology. – 2016. – Т. 7. – С. 1352.
63. Hyman P. Phages for phage therapy: isolation, characterization, and host range breadth //Pharmaceuticals. – 2019. – Т. 12. – №. 1. – С. 35.
64. Svircev A., Roach D., Castle A. Framing the future with bacteriophages in agriculture //Viruses. – 2018. – Т. 10. – №. 5. – С. 218.
65. Labrie S. J., Samson J. E., Moineau S. Bacteriophage resistance mechanisms //Nature Reviews Microbiology. – 2010. – Т. 8. – №. 5. – С. 317-327.
66. Azam A. H., Tanji Y. Bacteriophage-host arm race: an update on the mechanism of phage resistance in bacteria and revenge of the phage with the perspective for phage therapy //Applied microbiology and biotechnology. – 2019. – Т. 103. – №. 5. – С. 2121-2131.
67. Gómez P. et al. The impact of resource availability on bacterial resistance to phages in soil //PLoS One. – 2015. – Т. 10. – №. 4. – С. e0123752.
68. De Sordi L., Lourenço M., Debarbieux L. “I will survive”: a tale of bacteriophage-bacteria coevolution in the gut //Gut microbes. – 2019. – Т. 10. – №. 1. – С. 92-99.
69. Wright R. C. T. et al. Resistance evolution against phage combinations depends on the timing and order of exposure //MBio. – 2019. – Т. 10. – №. 5.
70. Hernandez C. A., Koskella B. Phage resistance evolution in vitro is not reflective of in vivo outcome in a plant‐bacteria‐phage system //Evolution. – 2019. – Т. 73. – №. 12. – С. 2461-2475.
71. Meaden S., Paszkiewicz K., Koskella B. The cost of phage resistance in a plant pathogenic bacterium is context‐dependent //Evolution. – 2015. – Т. 69. – №. 5. – С. 1321-1328.
72. Born Y. et al. Protection of Erwinia amylovora bacteriophage Y2 from UV-induced damage by natural compounds //Bacteriophage. – 2015. – Т. 5. – №. 4. – С. e1074330.
73. Boulé J. et al. Isolation and characterization of eight bacteriophages infecting Erwinia amylovora and their potential as biological control agents in British Columbia, Canada //Canadian journal of plant pathology. – 2011. – Т. 33. – №. 3. – С. 308-317.
74. Parcey M. et al. Molecular profile of phage infection: A novel approach for the characterization of Erwinia phages through qPCR //International journal of molecular sciences. – 2020. – Т. 21. – №. 2. – С. 553.
75. Gitaitis R., Walcott R. The epidemiology and management of seedborne bacterial diseases //Annu. Rev. Phytopathol. – 2007. – Т. 45. – С. 371-397.
76. Nagy J. K. et al. Penetration and translocation of Erwinia amylovora-specific bacteriophages in apple-a possibility of enhanced control of fire blight //European Journal of Plant Pathology. – 2015. – Т. 142. – №. 4. – С. 815-827.
77. Iriarte F. B. et al. Soil-based systemic delivery and phyllosphere in vivo propagation of bacteriophages: two possible strategies for improving bacteriophage persistence for plant disease control //Bacteriophage. – 2012. – Т. 2. – №. 4. – С. e23530.
78. Ward R. L., Mahler R. J. Uptake of bacteriophage f2 through plant roots //Applied and Environmental Microbiology. – 1982. – Т. 43. – №. 5. – С. 1098-1103.
79. Thomas S. et al. Benefits of hyperspectral imaging for plant disease detection and plant protection: a technical perspective //Journal of Plant Diseases and Protection. – 2018. – Т. 125. – №. 1. – С. 5-20.
80. Pineda M., Pérez-Bueno M. L., Barón M. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data //Frontiers in plant science. – 2018. – Т. 9. – С. 164.
81. Simko I., Jimenez-Berni J. A., Sirault X. R. R. Phenomic approaches and tools for phytopathologists //Phytopathology. – 2017. – Т. 107. – №. 1. – С. 6-17.
82. Mommaerts V., Smagghe G. Entomovectoring in plant protection //Arthropod-Plant Interactions. – 2011. – Т. 5. – №. 2. – С. 81-95.
83. Abdulridha J., Batuman O., Ampatzidis Y. UAV-based remote sensing technique to detect citrus canker disease utilizing hyperspectral imaging and machine learning //Remote Sensing. – 2019. – Т. 11. – №. 11. – С. 1373.
84. De Smet J. et al. Pseudomonas predators: understanding and exploiting phage–host interactions //Nature Reviews Microbiology. – 2017. – Т. 15. – №. 9. – С. 517.
85. Morella N. M. et al. The impact of bacteriophages on phyllosphere bacterial abundance and composition //Molecular ecology. – 2018. – Т. 27. – №. 8. – С. 2025-2038.

РЕФЕРАТ

Отчет 235 с., 57 рис., 93 табл., 73 источн., 11 прил.

Занятость, формы и виды занятости населения, альтернативная занятость, факторы занятости, сельбские территьории, политика занятости, государственное регулирование занятости

Цель исследований: Разработка теоретических и методологических положений оценки альтернативной занятости на сельских территориях.

Предметом исследования являются старосты сельских поселений, выпускники высших учебных заведений Ульяновской области. Объектом исследования выступает альтернативная занятость и факторы её определяющие.

Определены тенденции занятости в целом, несельскохозяйственной и неформальной занятости по субъектам ПФО. Проведена оценка взаимосвязи социально-экономического развития территории и занятости населения по материалам Ульяновской области и субъектов ПФО. Определена эффективность региональной политики занятости в Ульяновской области и субъектах ПФО.

Дана оценка занятости сельского населения Ульяновской области и выявлены проблемы занятости населения муниципальных районов Ульяновской области.

Проведен сравнительный анализ теоретических и методологических разработок отечественных и зарубежных ученых по вопросам оценки альтернативной занятости сельского населения. Дана оценка направлений и мер государственного регулирования и поддержки альтернативной занятости.

Проведено анкетирование выпускников вузов Ульяновской области на предмет возможного трудоустройства и самозанятости в сельской местности. Проведен экспертный опрос сельских старост по проблемам занятости и доходности сельских территорий региона. Результаты анкетирования и экспертного опроса представлены в Агентство по развитию сельских территорий Ульяновской области.

Разработана методика оценки альтернативной занятости по данным официальной статистики: определен алгоритм и этапы оценки альтернативной занятости сельского населения, предложены интегральные показатели оценки альтернативной занятости на сельских территориях. Методика адаптирована для применения в целях сравнительного анализа развития альтернативной занятости в сельской местности региона.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем отчете о НИР применяют следующие термины с соответствующими определениями.

Занятость населения – деятельность граждан, связанная с удовлетворением личных и общественных потребностей, которые не противоречат законодательству Российской Федерации, и способную приносить трудовой заработок и трудовые доходы.

Стандартная (формальная) занятость – форма занятости, при которой работник полностью находится в правовом поле и все его взаимоотношения с работодателем регулируются соответствующими законами государства.

Альтернативная занятость – занятость сельского населения в трудоспособном возрасте несельскохозяйственной деятельностью.

Самозанятость – самостоятельный поиск трудового занятия и создание рабочего места за свой счет.

Временная (сезонная) занятость – в пределах оговоренного срока либо ограниченная объемом работы.

Частичная занятость – неполный рабочий день, неполная рабочая неделя.

Надомничество – работа на дому индивидуальная или с помощью членов семьи).

Вторичная занятость – выполнение другой оплачиваемой работы за пределами рабочего времени основной работы.

Дистанционная занятость – выполнение определенной трудовым договором функции вне места нахождения работодателя, его филиала, представительства, иного обособленного структурного подразделения (включая расположенные в другой местности), вне стационарного рабочего объекта).

Фриланс – занятость работника на себя, не привязанная к месту работы.

Заемный труд – лизинг персонала, аутстаффинг, аутсорсинг.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследований. Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013 – 2020 годы, разработанная в соответствии со статьей 8 Федерального закона «О развитии сельского хозяйства» рассматривала развитие занятости (альтернативной занятости) как один из приоритетов федеральной политики наряду с повышением благосостояния, уровня жизни, устойчивого развития сельских территорий, сохранение территориальной целостности и обеспечение национальной безопасности Российской Федерации. Вместе с тем, её реализация в основном способствовала развитию сельскохозяйственного производства и переработки сельскохозяйственной продукции и не привела к радикальному изменению обстановки внутри российского села.

Продолжается миграция сельского населения в города и другие крупные экономические центры, где уровень жизни выше, а возможностей для самореализации больше. Доля сельского населения в общей численности населения страны составляет 26%. Иными словами, четверть российских граждан находится в заведомо худших жизненных условиях, чем все остальные^[1].

Государственная программа «Комплексное развитие сельских территорий» (2019г.) ставит задачи снижения уровня сельской бедности; содействия в повышении уровня занятости сельского населения, гарантирующей повышение доходов, включая альтернативные сельскому хозяйству виды деятельности (туризм, удалённая занятость и др.); создания комфортных и экологически-благоприятных условий проживания на сельских территориях; обеспечения транспортной доступности сельских населённых пунктов; доведения до современного уровня инженерной, социальной инфраструктуры сельских территорий; повышение доступности государственных услуг; вторичное освоение сельских территорий (т.е. заселение заброшенных населенных пунктов), в том числе, предполагающее создание привлекательных условий для переселения горожан, а также соотечественников из-за рубежа. Поэтому альтернативная занятость сельского населения является факторов развития сельских территорий.

Основная цель исследования – разработка теоретических и методологических положений оценки альтернативной занятости на сельских территориях.

Задачи исследования:

1. определить роль альтернативной занятости сельского населения в обеспечении повышения уровня благосостояния, направления ее развития;
2. обозначить специфику оценки альтернативной занятости на сельских территориях;
3. разработать методику оценки альтернативной занятости сельского населения.

Научная новизна. На основании полученных данных разработана методика оценки альтернативной занятости на сельских территориях, позволяющая проводить сравнительный анализ деятельности отдельных субъектов.

Теоретическая и практическая значимость. Разработка эффективной модели развития альтернативной занятости в сельской местности является действенным механизмом ее поддержки и характеризуется многоаспектностью направлений, механизмов и параметров, обеспечивающих повышение занятости, будет вносить свой вклад в успешную реализацию государственной программы, направленной на комплексное развитие сельских территорий.

Прикладная значимость исследования заключается в возможности использования результатов исследования для развития альтернативной занятости на сельских территориях.

Результаты исследования предназначены для использования представителями органов власти различных уровней при прогнозировании и определении приоритетных направлений развития сельских территорий, а также для системы повышения квалификации в области занятости населения.

Степень разработанности темы исследования. Экономическую категорию занятость рассматривают Костин, Зущина, Султанова, Алиев, Горелов, Ильина, Волгин, Буланов, Бреев. Нестандартной занятости населения посвещены работы Гимпельсон, Капелюшникова, Комаровой, Никифоровой, Соловченкова, Котлярова. Современные структурные преобразования занятости рассматривают Сарычева, Строева, Горелова, Ольховский,

Основные российские исследования, посвящённые изучению сельской занятости (Копач, Широкалова, Богдановский, Калугина, Дульзон, Десятко, Починова, Молчаненко), рассматривали структуру доходов сельского населения, направлений несельскохозяйственной занятости, например, доход от предпринимательства, сельского туризма, продажи дикоросов, сдачи имущества в аренду, продажи кустарных изделий. Изучению рынка труда, социальных отношений и трансформационных процессов в сельской экономике посвящены также работы Гимпельсона, Заславской, Капелюшникова, Нефёдовой, Овчинцевой, Пациорковского, Петрикова, Родионовой, Серовой.

В России альтернативная (несельскохозяйственная) занятость в селе развивается спонтанно, без поддержки государства. Факторам альтернативной занятости в сельской местности посвящены исследования Серовой, Звягинцева, Тихоновой, Карловой, Шик, Мокшиной, Войтюк.

Данное исследование является продолжением исследований по вопросам занятости в сельской занятости, но углубляет представление в вопросах, связанных со степенью распространения альтернативной занятости, факторах развития альтернативной занятости и связью с социально-демографическими характеристиками сельского населения.

Уровень значимости исследования для региона. На материалах Ульяновской области в разные годы проводились исследования вторичной занятости в личном подсобном хозяйстве (Егорова, Валовая), кадрового обеспечения аграрной экономики региона в условиях кризиса (Брыкина), оценки трудового потенциала (Смирнова, Александрова, Постнова), оценки производительности труда в аграрных формированиях (Смирнова), социальной ответственности агробизнеса (Александрова, Лапшина). Исследование альтернативной занятости сельского населения на материалах Ульяновской области проводится впервые.

В работе дана оценка развития альтернативной занятости населения сельских районов Ульяновской области, определены факторы её развития. Выявлены мотивы возможного трудоустройства и самозанятости в сельской местности выпускников региональных вузов. Все муниципальные образования Ульяновской области могут использовать результаты исследования в разработке своих программ комплексного развития.

Объекты, материалы и методы исследования. Предметом исследования являются старосты сельских поселений, выпускники высших учебных заведений Ульяновской области. Объектом исследования выступает альтернативная занятость и факторы её определяющие.

Подходы к оценке альтернативной занятости выстраивались с учетом ее определения: альтернативная занятость — как занятость сельского населения в трудоспособном возрасте несельскохозяйственными видами экономической деятельности, за исключением социальных услуг и государственного и муниципального управления.

Оценка альтернативной занятости производилась на официальных статистических данных Федеральной службы статистики и Территориального органа государственной статистики по Ульяновской области. Для анализа видов занятости использовались результаты выборочных обследований рабочей силы, социально-экономические показатели регионов России. Для оценки альтернативной занятости данные статистического ежегодника Ульяновской области, социально — экономические показатели муниципальных районов Ульяновской области, а также итоги сплошного наблюдения за деятельностью субъектов малого и среднего предпринимательства в 2015 году по регионам Российской Федерации в разрезе муниципальных образований.

Для оценки альтернативной занятости использование официальной статистики имеет серьезные ограничения.

1.Официальная статистика представляет в целом по области среднегодовую численность занятых в экономике по основному виду экономической деятельности (ОКВЭД 2), в том числе в отрасли сельское, лесное хозяйство, охота, рыболовство и рыбоводство. Но в официальной статистике отсутствуют данные о занятости в отрасли в разрезе муниципальных районов и организационно – правовых форм. При расчете этих показателей можно использовать данные сводных годовых отчетов муниципальных районов области в разрезе сельскохозяйственных предприятий, крестьянско – фермерских хозяйств, потребительских кооперативов (формы отчетности о финансово-экономическом состоянии товаропроизводителей агропромышленного комплекса).

2. Официальная статистика не дает возможности распределение занятых в личном подсобном хозяйстве в разрезе муниципальных районов.

3. Мониторинг численности занятых по крупным и средним предприятиях Ульяновской области по видам экономической деятельности в разрезе муниципальных районов ведется без учета сельского и городского населения.

4. Численность занятых в малом бизнесе в разрезе муниципальных районов также ведется без учета сельского и городского населения.

Основным сбором данных для анализа являлись выборочные обследования и монографические описания. Также собирались данные официальной статистики и нормативные акты региональной и муниципальной политики в сфере занятости и развития территорий. В ходе работы использовались методы сравнительного анализа, статистические методы, группировки данных, корреляционно – регрессионный анализ, а также табличные и графические приемы визуализации данных, информационные технологии, позволившие изучить исследуемые проблемы.

Раздел 1. Теоретические и институциональные основы альтернативной занятости населения сельского населения

1.1 Сущность и значение категории «альтернативная» занятость населения»

Теоретический фундамент учения о занятости был заложен представи­телями классической школы в экономической науке. Так, основой учения шотландского экономиста Адама Смита (1723–1790) был тезис о свободной конкуренции как условии оптимального использования материальных, фи­нансовых, людских ресурсов^[2]. Он доказывал, что объем занятости населения в экономике страны определяется величиной средней ставки заработной платы одного работника. Если средняя ставка заработной платы возрастает, то уменьшается возможность обеспечения занятости.

Другой представитель классической школы – английский экономист Давид Рикардо (1772–1823) обосновал положение о зависимости размеров заработной платы от предложения труда^[3]. Зависимость проявляется в том, что увеличение заработной платы выше минимального уровня, необходимого для нормального воспроизводства населения.

Согласно теории Д. М. Кейнса, все приспособления экономики проис­ходят за счет динамики показателей выпуска и занятости. В силу абсолютной жесткости номинальной заработной платы возникает недостаточность сово­купного спроса на товары и услуги, вследствие чего при падении спроса со­кращаются объем производства и занятость, а номинальные ставки заработ­ной платы остаются неизмененными. Рост занятости, по Кейнсу, зависит от «психологического закона склонности людей к потреблению и сбережению: люди по мере роста их доходов склонны увеличивать потребление, но не в таком размере, в каком растут их доходы, а несколько меньше»^[4].

В соответствии с теорией монетаризма рациональный уровень занято­сти определяется с помощью ценового механизма, который формируется на основе свободы предпринимательства и рыночных отношений.

Теория рациональных ожиданий основывается на тезисе о рациональ­ном поведении людей. Обладая необходимой для оценки функционирования экономики страны информацией, они принимают такие решения, которые максимизируют их благосостояние. Вторая предпосылка заключается в том, что рынки являются высококонкурентными, а цены и ставки заработной платы – гибкими, как в сторону повышения, так и в сторону понижения. От­сюда делается вывод о том, что получение населением новой информации быстро находит отражение в объемах спроса и предложения, поэтому равно­весные цены и объемы производства своевременно приспосабливаются к но­вой ситуации, рыночным потрясениям или к изменениям в государственной поли-тике.

Все указанные теории занятости (табл. 1.1), рассматривают категорию занятости как экономическую. «Занятость, как экономическая категория ак­кумулирует в себе экономические, демографические и социальные характе­ристики. Экономическое содержание занятости выражается в возможности своим трудом обеспечить себе и своей семье достойное существование и способствовать росту эффективности общественного производства; социаль­ное – в формировании и развитии личности работника; демографическое от­ражает взаимодействие занятости с возрастно-половыми характеристиками работников, их численностью»^[5].

Как всеобщую экономическую категорию рассматривают занятость Л.А. Костин, Г.М. Зущина, Р.М. Султанова, И.М. Алиев, Н.А. Горелов, Л.О. Ильина, Н.А. Волгин и В.С. Буланов: занятость есть «совокупность отноше­ний на рынке труда по поводу участия населения в трудовой деятельности; она выражает меру его включенности в труд, степень удовлетворения обще­ственных потребностей в работниках и личных потребностей людей в опла­чиваемых рабочих местах и получении дохода».

Таблица 1.1

Содержательные характеристики занятости

в различных экономических школах

О.С. Белокрылова и О.А. Матвеева считают, что занятость необходимо рассматривать как социально-экономическую категорию: «Социальный ха­рактер занятости отражает потребность людей не только в доходах, но и са­мовыражении через общественно полезную деятельность, а также степень удовлетворения этой потребности при определенном уровне социально-эко­номического развития общества»^[6].

Близок в указанной точки зрения Б.Д. Бреев, который под занятостью понимает «сложное социально-экономическое явление, которое выступает важной составной частью общественного производства в части обеспечения населения не просто рабочими местами (с позиции производства и накопле­ния), но и обеспечения человека необходимыми средствами существования (т.е. с формированием и использованием фонда потребления)^[7].

С.С. Худякова предлагает рассматривать данную категорию в широком смысле как «любую социально значимую деятельность независимо от ее формы и преследуемых целей»^[8]. К данной формулировке можно отнести во­лонтерство, уход за детьми, службу в армии по призыву и прочее. В узком смысле она предлагает определить данную категорию, как осуществление профессиональной деятельности в понимании трудового законодательства, то есть как общественные отношения по реализации своих знаний, умений и навыков в профессиональной или творческой деятельности, в соответствии с действующими нормами законодательства и получающих трудовой доход.

С.А. Аронова считает, что «однозначную трактовку занятости дать не­возможно. Занятость может быть определена и как параметр состояния рынка труда, и как процесс деятельности людей, и как результат взаимодей­ствия субъектов рынка труда и дает собственное определение категории за­нятости. «Занятость – это ряд правил, которые выполняют функцию ограни­чений поведения различных экономических агентов на рынке труда (госу­дарства, работников, работодателей, общественных организаций, специали­зированных учреждений) и упорядочивают взаимодействие между ними по поводу параметров и характера использования ресурса труда в процессе про­изводства, а также соответствующие механизмы контроля за соблюдением этих правил, действующие в рамках конкретного общества на определенном этапе развития»^[9].

Рисунок 1.1 – Занятость населения как институциональное явление

Е.Л. Лаврова отмечает, что экономические исследования наиболее ча­сто раскрывают сущность таких видов занятости, как оптимальная, полная, эффективная, встречается анализ категорий продуктивной, социально-полез­ной и сверхзанятости, а также многих других видов, характеризующих в своей массе тот или иной параметр рынка труда^[10].

В рамках каждого вида занятости труд людей организуется с помощью разнообразных организационно-правовых форм. Все формы занятости условно можно разделить на стандартные (формальные) и нестандартные (неформальные).

Форму занятости, при которой работник полностью находится в право­вом поле и все его взаимоотношения с работодателем регулируются соответ­ствующими законами государства Международная организация труда (МОТ) относит к стандартной (формальной) занятости. Большинство авторов к при­знакам стандартной занятости относят работу у одного работодателя; нали­чие бессрочного документально оформленного трудового договора; стан­дартную рабочую нагрузка в течение дня, недели, месяца, года; наличие обо­рудованного рабочего места в помещении работодателя^[11].

Таблица 1.2

Основные виды занятости населения

Закон Российской Федерации от 19 апреля 1991г. № 1032-1 «О занято­сти населения в Российской Федерации» термин «занятость населения» трак­тует как «деятельность граждан, связанная с удовлетворением личных и об­щественных потребностей, которые не противоречат законодательству Рос­сийской Федерации, и способную приносить трудовой заработок и трудовые доходы»^[12].

В России все другие формы занятости рассматриваются как нестан­дартные. Авторы придерживаются позиции И.Д. Котлярова, определяющего нестандартные формы занятости как зонтичный термин, объединяющий раз­нородные по своей природе формы взаимодействия работника и работода­теля^[13]. Обязательным условием нестандартной занятости является её легаль­ность. К основным формам нестандартной занятости следует отнести:

— самозанятость (самостоятельный поиск трудового занятия и создание рабочего места за свой счет);

— временную (сезонную) работу (в пределах оговоренного срока либо ограниченную объемом работы);

— частичную (неполный рабочий день, неполная рабочая неделя);

— надомничество (работа на дому индивидуальная или с помощью чле­нов семьи);

— совместительство (выполнение другой оплачиваемой работы за пре­делами рабочего времени основной работы – вторичная занятость);

— дистанционную занятость (выполнение определенной трудовым дого­вором функции вне места нахождения работодателя, его филиала, представи­тельства, иного обособленного структурного подразделения (включая распо­ложенные в другой местности), вне стационарного рабочего объекта, прямо или косвенно находящихся под контролем работодателя, при условии ис­пользования для выполнения данной трудовой функции и для осуществления взаимодействия между работодателем и работником по вопросам, связанным с ее выполнением, информационно-телекоммуникационных сетей общего использования, в том числе сети «Интернет»^[14];

— фриланс (занятость работника на себя, не привязанная к месту ра­боты);

— заемный труд (лизинг персонала, аутстаффинг, аутсорсинг).

Стандартная и нестандартная формы занятости могут быть неформаль­ными (незарегистрированными)^[15].

А.Ю. Рожкова приравнивает нестандартные формы занятости к сети альтернативных форм занятости, рассматривая особенности правового регу­лирования норм трудового и гражданского права^[16].

Аналогичный подход к применению термина «альтернативная заня­тость» демонстрируют Д.Н. Десятко, В.Б. Рапгоф и А.Ю. Лушкин. «Форми­рование глобальной цифровой инфраструктуры создало возможности для по­явления нового типа взаимоотношений между работником и работодателем, что нашло выражение в более развитых формах альтернативной занятости, таких как контрагенты, внешние совместители и независимые работники, ра­ботники, нанятые на электронных платформах»^[17].

Нестандартные формы занятости населения широкое распространение получили в сельской местности в форме альтернативной занятости, кото­рую отдельные авторы трактуют как занятость сельского населения в трудо­способном возрасте несельскохозяйственными видами экономической дея­тельности за исключением социальных услуг и государственного и муници­пального управления, а также нишевыми видами сельскохозяйственной заня­тости»^[18].

Данное утверждение авторов по существу, по мнению И.В. Калининой и С.А. Соловченковой не точно: альтернативная занятость, «есть не что иное, как мелкая самозанятость, которая формировалась либо с целью поиска аль­тернативы сельскохозяйственной занятости, либо как дополнение к ней»^[19]. В данном случае произошло смешение двух разных понятий: видов и форм за­нятости. Виды занятости – это распределение активной части трудовых ре­сурсов по сферам и отраслям народного хозяйства. Формы занятости – это организационно-правовые способы и условия использования труда.

Рисунок 1.2 – Формы занятости, получившие развитие к началу XXI века^[20]

В данном исследовании альтернативная занятость рассматривается как занятость сельского населения в трудоспособном возрасте несельскохозяй­ственной деятельностью. Она может выступать как стандартная и нестан­дартная. Используем подход к описанию основных форм занятости С.В. Дульзон^[21] (табл. 1.3).

Таблица 1.3

Основные формы альтернативной (несельскохозяйственной) занятости сельского населения

Для повышения производительности аграрного производства при под­держании занятости и росте общих доходов в сельской местности важна по­стоянная и формальная альтернативная занятость^[22].

Организации несельскохозяйственной деятельности в сельской местно­сти связана с особенностями сельскохозяйственного труда, которые опреде­ляются многообразием видов хозяйствования и форм собственности, проти­воречивостью и неоднозначностью развития крестьянского труда и произ­водства, влиянием на результаты труда естественных биологических факто-ров^[23].

В сельском хозяйстве занятость имеет формы проявления, выражаю­щиеся в том, что соотношение рабочих мест и рабочей силы должно быть строго определенным в различное время года. Существенными моментами занятости в сельском хозяйстве являются:

• региональные особенности сельского расселения;
• сезонность производства и труда;
• наличие личного подсобного хозяйства;
• непосредственная связь условий труда и быта с результатами хозяй­ственной деятельности;
• миграция сельского населения в города и обратная миграция;
• высвобождение рабочей силы из сельского хозяйства в другие от­расли^[24].

Рост производительности, внедрение новых технологий, отказ от руч­ного труда, ликвидация многих сельскохозяйственных предприятий вслед­ствие кризисных явлений в экономике приводят к высвобождению рабочей силы в сельской местности, что в свою очередь приводит к росту безрабо­тицы, упадку российской деревни ^[25].

В связи с этим, альтернативные виды занятости сельских жителей при­обретают все большее значение и как фактор выживания и как фактор роста доходов. В свое время, многие авторы как фактор роста дохода и как фактор выживания рассматривали неформальную занятость, включая вторичную за­нятость сельских жителей в личном подсобном хозяйстве (ЛПХ)^[26].

Среди факторов, способствующих росту занятости в личном подсоб­ном хозяйстве назывались: неудовлетворенность заработной платой на пер­вой работе, размер семейного дохода, семейное положение, количество чле­нов семьи^[27].

Потребность в развитии альтернативной занятости формируется фак­торами позитивного характера, в литературе их определяют как факторы «спроса» и факторами негативного характера, соответственно, факторы «нужды»^[28].

По мнению Д.В. Звягинцева, факторы спроса описывает ситуацию, ко­гда для занятых в сельском хозяйстве появляется выгодная возможность за­нятости в несельскохозяйственном секторе. Фактор нужды описывает ситуа­цию, когда недостаточные доходы в сельском хозяйстве заставляют искать другой дополнительный низко оплачиваемый источник в несельскохозяй­ственном секторе^[29].

Рисунок 1.3 – Факторы формирования альтернативной занятости^[30]

К альтернативным видам занятости относятся:

заготовка древесины и деревообработка, производство строительных материалов и строительство;

промысла и ремёсла;

бытовое и социально-культурное обслуживание населения;

заготовка и переработка дикорастущих плодов и ягод, лекарственных растений и другого природного сырья;

сельский туризм;

торговля;

дополнительное образование детей и взрослых;

транспортное сообщение;

социальные услуги для людей с ограниченными возможностями здоро­вья;

вывоз твердых бытовых отходов;

водоснабжение^[31].

Такое многообразие подходов к выделению видов и форм занятости говорит о сложности в исследованиях занятости как экономического явления и требует, однозначно, определения направлений её регулирования.

1.2 Политика развития сельских территорий и альтернативная занятость населения

В 90-х годах 20 века доминирующие позиции в экономической поли­тике развитых стран заняла концепция устойчивого развития сельских тер­риторий, предусматривающая достижение равных возможностей для всех субъектов рынка, одинаковых условий жизни населения в городе и селе, уменьшение зависимости периферийных регионов от центра, улучшение возможностей для региональных предпринимателей.

В период 2007-2013 гг. Европейская политика развития сельских райо­нов (ERDP) продолжена и была сосредоточена на повышении качества жизни и диверсификации сельской экономики. Это включало такие меры, как ди­версификация несельскохозяйственной деятельности, поддержка создания и развития бизнеса, поощрение туристической деятельности и предоставление основных услуг сельскому населению.

Европейскую политику, направленную на развитие сельскохозяйствен­ной и альтернативной занятости сельского населения, наглядно можно рас-смотреть на примере Польши. Вступление Польши в Европейский Союз от­крыло новые возможности не только для сельского хозяйства, но также для роста предпринимательства в сельской местности ^[32].

Первые проекты развития, ориентированные на сельские районы в Польше, были начаты еще в 2002 году в рамках программы помощи перед вступлением SAPARD. Схема привела к реализации 4071 проект по продви­жению альтернативных источников дохода на общую сумму 342,3 млн. зло­тых. Наибольшее количество проектов было инициировано с целью создания новых рабочих мест в сельских регионах (2154), в основном в сфере мелко­товарного производства, транспортных и туристических услуг, что дало начало 1646 постоянным рабочим местам. Несколько меньше проектов было запущено с цель создания дополнительных источников дохода для фермеров (1490) в сфере туризма, включая агротуризм, сельскохозяйственные и транс­портные услуги.

В 2004–2006 гг. многофункциональному развитию села способство­вали: действие Отраслевой операционной программы: «Диверсификация сельскохозяйственных, а также деятельность, связанная с фермерством, для создания дополнительных источников дохода».

Программа предлагала финансовую помощь проектам в сфере услуг для сельского населения (40,1%), услуги в сельском и лесном хозяйстве (24,2%) и агротуризм (20,7%).

В период действия Программы развития села на 2007-2013 гг. мно­гофункциональное развитие сельских территорий получает поддержку в рам­ках следующих мероприятий: «Диверсификация сельского хозяйства в под­держку несельскохозяйственной деятельности» и «Создание и развитие мик­ропредприятий».

Эти действия поддерживают следующие категории проектов: услуги для сельского хозяйства и промышленности; услуги для сельских жителей, оптовая и розничная продажа, декоративно-прикладное искусство, строи­тельство и монтаж услуги, транспортные услуги, коммунальные услуги, пе­реработка сельскохозяйственной и лесной продукции, хранение и складиро­вание, заводы по переработке биомассы, бухгалтерские услуги, консалтинго­вые услуги, ИТ-услуги.

Тема альтернативной занятости сельского населения в последние 20 лет имеет устойчивый интерес исследователей практически всех стран, не за­висимо от уровня экономического развития. Остановимся не некоторых из них.

Определение факторов, препятствующих приобретению ЕС средств, и оценка потребностей потенциальных бенефициаров стало целью опроса фер­меров в 2011г. в районе Вармии Мазур. Опрошенные респонденты ранее имели опыт работы с проектами, финансируемые ЕС. В исследовании при­няли участие 92 фермера, которые были клиентами консультации Agroplus (центр Ассоциации консультантов по развитию села в Ольштыне).

Опрошенные фермеры ранее полагались на финансовую помощь, предоставленную в рамках Сельской программы развития, и большинство из них разработали стратегии ведения своей фермы. В общей сложности 39,5% респондентов, потенциальных бенефициаров Программы развития сельских районов 2007-2013 гг. Польши, на момент исследования участвовали в реали­зации инвестиционного проекта. Они инициировали такие мероприятия без финансовой помощи ЕС, опасаясь, что не смогут получить такую помощь. Фермеры также неохотно брали банковские ссуды из-за опасений экономи­ческой нестабильности. 29% опрошенных взяли банковские кредиты, тогда как только 8,3% фермеров сдали в аренду свои средства производства.

Несмотря на растущую обеспокоенность экономической нестабильно­стью и финансовыми рисками, опрошенные фермеры были готовы присту­пить к новым инвестициям при условии, чтобы у них был доступ к финансо­вой помощи. В своих попытках подать заявку на гранты ЕС респонденты были наиболее ограничены из-за чрезмерной бюрократии, которая заставила многих бенефициаров искать поддержки профессиональных консультантов. Неопределенность правовых норм также представляет собой серьезную про­блему, поскольку нечеткие положения часто интерпретируются в ущерб за­явителю.

Несомненно, что реализация Программы развития села на 2007-2013 гг. внесла значительный вклад в развитие сельского хозяйства и сельских райо­нов путем содействия реструктуризации и модернизации ферм и стимулиро­вание роста сельского предпринимательства.

Программа развития села на 2007-2013 гг. создала возможность для новых рабочих мест в Польше. Первая группа мер касается диверсификации экономической деятельности. В Польше такие меры дали большие шансы сельскому населению, во многом благодаря большой кадровой базе и высо­кому уровню безработицы. К наиболее важным задачам программы можно отнести увеличение добавленной стоимости продуктов, путем стимулирова­ния рынка местной и региональной продукции, развития туризма, торговли, консультационных и других услуг. В этом контексте приоритетом стало обеспечение занятости и дохода за счет развития несельскохозяйственной деятельности^[33].

К этой группе мер относится поддержка развития малых городов, напрямую связанных с процессами реструктуризации в сельской местности, в том числе в сфере здравоохранения, образования, развитие малых предприя­тий в несельскохозяйственных отраслях, туризма.

Во вторую группу входят инструменты, направленные на повышение качества жизни. Они касаются обновления сельских районов и улучшения культурного и природного наследия. Примеры поддержки Программы раз­вития села на 2007-2013 гг. Помощь предоставляется организациям, начина­ющим или развивающим:

1) услуги для аграрных или лесных хозяйств;

2) услуги населению;

3) оптом и в розницу;

4) ремесло и ремесла;

5) строительно-монтажные работы и услуги;

6) услуги для туристов, связанные со спортом и отдыхом;

7) транспортные услуги;

8) коммунальные услуги;

9) переработку сельскохозяйственной продукции и пищевых продуктов леса;

10) складирование и хранение продукции;

11) производство энергетических продуктов из биомассы;

12) бухгалтерские, консультационные или ИТ-услуги.

Помощь имеет форму возмещения части приемлемых затрат по про­екту. Максимальная сумма помощи, предоставленной одному бенефициару в агрохолдинге в течение периода реализации Программы не может превышать 100 тысяч злотых (25616,1 евро). Эквивалент в евро носит ориентировочный характер.

Помощь создания и развития микропредприятий имеет форму возме­щения части приемлемых затрат. Размер предоставленной помощи выполне­ние операции не может превышать:

1) 100000 злотых (25616,1 евро) – если бизнес-план предусматривает создание от 1 до 2 рабочих места (выражается среднегодовой занятостью с полной занятостью), что обосновано материальными объемами операции;

2) 200000 злотых (51232,1 евро) – если бизнес-план предусматривает создание более от 2 до 5 рабочих мест (выраженных среднегодовой занято­стью с полной занятостью), что оправдано зависит от материального мас­штаба операции;

3) 300000 злотых (76848,2 евро) – если бизнес-план предусматривает создание не менее 5 рабочих мест (выражается в среднегодовой полной заня­тости), что обосновано материальным объемом операции.

Максимальная сумма помощи, предоставляемой одному получателю, не может превышать 300000 злотых (76848,2 евро) в период реализации Про­граммы. В случае сельскохозяйственной продукции и переработки пищевых лесных продуктов, максимальная сумма помощи, предоставляемой одному получателю, не может превышать 100000 злотых (евро 25616,1) в период ре­ализации Программы.

Членство Польши в Европейском союзе также открыло новые возмож­ности для агротуристов в рамках Программы развития села на 2007-2013гг. Мероприятие 3.1 Развитие девелопмент и диверсификация экономической деятельности, обеспечивающая альтернативный доход. Фермы имеют право на субсидию до 100000 злотых, включая 50% затрат. Эти средства могли ис­пользоваться для строительства, расширения и реконструкции туристических объектов в сельской местности^[34].

В 2003 г. Польский парламент принял Закон о формировании сельско­хозяйственной системы образования. В законе подчеркивается важность квалификации фермеров в процессе приобретения, использования сельскохо­зяйственных угодий, при подачи заявлений на получение пособий ЕС.

П. Боравски и А. Павлевич в 2011г. провели исследование 169 ферм Польши с альтернативными источниками дохода (страусиные фермы, олене­водческие хозяйства, козьи фермы и фермы с различными видами деятельно­сти, приносящими доход, где каждая деятельность приносит менее 30% про­даж). Фермеры, которые увеличивают свой доход за счет альтернативных ви­дов деятельности, могут извлечь выгоду из навыков по планированию и управлению. Поиск альтернативных возможностей получения дохода требует эффективного сотрудничества, обмена информацией с аналогичными пред-приятиями, общих схем продвижения на региональный уровень и доступ к льготным кредитам^[35].

Исследование взаимосвязи между диверсификацией производства и развитием фермерских хозяйств (2010г., 65 ферм г. Ольштынский район Польши). Основными мотивами, побуждающими фермеров начать альтерна­тивный бизнес, являются желание получать дополнительный доход (27,4%), желание членов семьи (16,6%), потеря работы (13,7%). Частный бизнес дает владельцу гарантию долгосрочного бизнеса, трудоустройство без риска по­тери работы. 20% опрошенных ферм имело 60% своего дохода от альтерна­тивной деятельности, 24,6% ферм, соответственно – 50%, 30,7% ферм – 10% дохода от несельскохозяйственной деятельности.

Таблица 1.4

Мероприятия, предпринятые для увеличения доходов

фермерских хозяйств

Несельскохозяйственная деятельность (20,0%) рассматривалась как наиболее эффективный способ улучшения сельского хозяйства^[36].

Основная цель исследования – выяснить условия работы сельского ту­ризма, важный элемент устойчивого развития территорий Natura 2000, рас-положенных в Подлянском воеводстве Польши. Часто упоминаемой причи­ной создания агротуристических ферм было желание увеличить доход (50% респондентов) и отсутствие работы (21%). Интересно, что среди таких боль­шое количество респондентов, указавших в качестве причины безработицу, только один человек продемонстрировал готовность создать возможность работы для другого человека.

Остальные позиции в иерархии значимости занимали особенности ландшафта и использование жилой площади – 13% и 15% респондентов со­ответственно. Прибыль от сельского хозяйства незначительна по сравнению с доходами, получаемыми от агротуризма. Только четыре респондента за­явили, что их основным источником дохода был скот, молоко, консервы, ре­месла, услуги сельского хозяйства и продажа зерновых. Товары, произведен­ные на фермах, продаются в основном туристам (54,7% от всех ответов) и клиентам – физическим лицам (34%). Очень немногие из исследуемых субъ­ектов продают свою продукцию на рынок (8%) или производят их строго для собственного потребления (3%). В целом ясно, что сельскохозяйственные производство в основном зависит от туристического бизнеса^[37].

П. Ланжу и Г. Федер (2001г.) в результате исследования несельскохо­зяйственной деятельности и развития сельских районов развивающихся гос­ударств Азии вывели некоторые закономерности. Стратегия продвижения несельскохозяйственной экономики не может принимать форму универсаль­ного набора рекомендаций. Несельскохозяйственные виды деятельности весьма неоднородны, и ограничения на расширение несельскохозяйственного сектора будет отличаться от страны к стране и по регионам внутри страны.

Одним из важных следствий этой неоднородности является то, что важно очертить границы различные обязанности органов власти разных уровней в отношении продвижения не фермерского хозяйства. Другой за­ключается в том, что границы, определяющие компетенции и обязанности разные ветви власти (например, разные министерства, ответственные за сель­ское хозяйство, инфраструктуры, образования и т. д.), возможно, потребуется пересмотреть, чтобы лучше удовлетворять потребности «сектора», который традиционно выходит за рамки их компетенции.

Продвижение несельскохозяйственного сектора в целом ориентировано на бедных, продвижение некоторых видов несельскохозяйственной деятель­ности напрямую влияет на бедность. Низкопроизводительная деятельность преобладает в отдаленных районах, где наблюдается тенденция к бедности, где инфраструктурные услуги скудны и где агропотенциал также низок. Вы­сокопроизводительные виды деятельности обычно сосредоточиваются в бо­лее обеспеченных регионах. Но какая-то комбинация двух типов деятельно­сти наблюдаются почти везде.

Низкопродуктивная несельскохозяйственная деятельность действует как своего рода частичная подстраховка в сельской местности. Высокая – с другой стороны, продуктивная деятельность, часто не предназначенная для бедных, как правило, требует дополнительных активов, таких как образова­ние, доступ к кредитам, богатство, сети контактов и т.д. Однако воздействие на бедных остается возможным, поскольку данные свидетельствуют о том, что расширение производительной деятельности сужает сельские рынки тру-да в целом, что приводит к повышению заработной платы и ставки участия для всех.

Поощрение несельскохозяйственной деятельности, вероятно, повлияет на распределение доходов в сельской местности, но направление изменений неоднозначно. Рост высокопроизводительных видов деятельности обычно приводит к увеличению неравенства в сельской местности, в то время как низкопродуктивная деятельность вне фермерских хозяйств в сельской мест­ности может фактически сократить неравенство в сельской местности.

Диверсификация доходов в сельской местности также снижает подвер­женность сельских домохозяйств неопределенности и может помочь сель­ским домохозяйствам сгладить потребление. В конце концов, снижение сте­пени колебания доходов в сельской местности, вызванные этой диверсифи­кацией, влияют на функционирование таких учреждений, как сельские фи­нансовые учреждения.

Политика продвижения несельскохозяйственной деятельности должна быть основана на доказательствах того, что рынки, так или иначе не приносят социально желаемых результатов.

Ключевым элементом стратегии нефермерского развития является ин­фраструктура. Опыт указывает на важность экономической инфраструктуры в поддержке расширения несельскохозяйственной экономики (как и сель­ского хозяйства), но данные также свидетельствуют о том, что сельские до­мохозяйства гораздо хуже обслуживаются, чем городские домохозяйства в развивающихся странах. Более высокая стоимость инфраструктуры в сель­ской местности на душу населения в сочетании с более низкой платежеспо­собностью сельских домохозяйств означает, что инициативы по привлече­нию частного сектора по обеспечению инфраструктуры труднее применить в сельской местности, чем в городской области.

Социальная инфраструктура, особенно образование, также имеет ре­шающее значение. Усилия по повышение уровня образования в сельской местности будут по-прежнему иметь важное значение для трудоустройства по высокопроизводительным профессиям. Поскольку бедные обычно наиме­нее образованы, такая политика будет прогрессивной.

Сельские общественные работы предлагают средства прямого вовлече­ния крайне бедных в несельскохозяйственную работу, в то же время, укрепляют инфраструктуру. Необходимо усилить инвестиционное обеспечение обще­ственных работ.

Ключевым инструментом стимулирования деятельности частного сек­тора в несельскохозяйственной экономике является улучшение оказание фи­нансовых услуг в сельской местности. За последние годы накоплен значи­тельный опыт кредитования микропредприятий, смоделированным на при-мере Grameen Банк в Бангладеш, воплощающий такие особенности, как местное размещение, групповое кредитование, выдача выдачи ссуд в шах-матном порядке и взимания рыночных процентных ставок.

Следует проявлять осторожность при разработке мероприятий, направ­ленных конкретно на несельскохозяйственную экономику. Промышленные комплексы, направленные на предоставление полного пакета услуг предпри­ятиям, как правило, отдают предпочтение средним и крупным сельским предприятиям и, таким образом, обходят стороной бедных. Такие усадьбы редко функционируют как «полюса роста» в отсталых регионах в первую очередь из-за их склонности к расположению в относительно более развитых регионах, но даже в отсталых районах они имеют ограниченные связи с местной экономикой. Опыт Индии с резервированием производства также предостерегает от особого подхода к продвижению несельскохозяйственной экономики. Исследования показывают, что политика серьезно подорвала долгосрочные перспективы роста текстильной и сахарной промышленности Индии в угоду временного роста занятости в краткосрочной перспективе.

Наконец, стратегия нефермерского развития должна учитывать связи между нефермерскими видами деятельности и сельским хозяйством.

Опыт показывает, что мультипликативные связи между сельским хо­зяйством и несельскохозяйственной деятельностью обычно сильнее и более многочисленны, когда сельские районы обслуживаются адекватно инфра-структурой, хорошо функционирующей финансовой системой и нормативно-правовой средой, которые способствуют, а не сдерживают связи. На сего­дняшний день данные свидетельствуют о том, что политика, продвигающая как сельскохозяйственную, так и не сельскохозяйственную деятельность, та­кая как инвестиции в экономическую и социальную инфраструктуру (напри-мер, образование), как правило, более эффективны в стимулировании несель­скохозяйственной деятельности, чем ориентированы исключительно на не-сельскохозяйственную экономику. Даже если импульс исходит от несельско­хозяйственной стороны, например, когда туристическая деятельность расши­ряется в отсталых в сельскохозяйственном отношении районах, вмешатель­ство с целью укрепления связей между местным фермерским сектором и не-сельскохозяйственной деятельностью, вероятно, обеспечит наиболее широкое распределение выгод^[38].

Масштабное исследование несельскохозяйственной занятости в 2013г. было проведено в Китае (18948 домохозяйств в 15 провинциях, 126 городах и 234 округах). В ходе исследования рассмотрены несельскохозяйственный до-ход фермеров, численность занятых несельскохозяйственными видами дея­тельности, несельскохозяйственными операционные активы, площадь земли, образование фермеров. Низкий уровень доходов от сельскохозяйственной деятельности учеными Китая назван основной причиной роста несельскохо­зяйственной занятости в сельской местности, передачи сельскохозяйствен­ных земель в аренду. Профессиональная подготовка сельской рабочей силы также является фактором стабильного роста несельскохозяйственной занято­сти и одновременно способствует обороту сельских земель, особенно в Цен-тральном и Западном Китае^[39].

С. Костер, А.Э. Брауэр и Э.С. Ван Леувен выявили неоднозначность в утверждения положительного влияния диверсификации занятости на разви­тие сельских территорий Нидерландов (2013г.). Анализ 76 сельских, 58 го­родских и 274 промежуточных муниципальных образований показал, что между муниципалитетами и прилегающими к ним территориями существуют значительные взаимосвязи. Все муниципалитеты получают прибыль от эко­номически разнообразных соседей, причем города наиболее сильно выигры­вают от диверсифицированных ресурсов соседних сельских муниципалите­тов. Вместе с тем, сельские и промежуточные муниципалитеты сталкиваются с негативными конкурентными эффектами соседних специализированных муниципалитетов. Сильно развитые специализированные кластеры деятель­ности действуют как магнит для экономических ресурсов, тормозя развитие занятости в сельских районах. Диверсификации деятельности в сельской местности противостоит общий позитивный эффект доступа к урбанизиро­ванным районам, который может осуществляться за счет неконкурентоспо­собных ресурсов как для производства, так и для потребления.

Таким образом, результаты исследования позволили авторам утверждать, что стратегия диверсификации представляется эффективной только в том случае, если она реализуется в масштабе функционального региона, то есть через комбинации сельских муниципалитетов в сочетании с городским центром. Положительные эффекты разнообразия регистрируются только на более высоких пространственных уровнях. Особое влияние оказывает ситуация с занятостью в сельских муниципальных образованиях по характеристикам и динамике окружающего региона. Это имеет два следствия. Во-первых, муниципальный уровень слишком мал для эффективного управления экономическим развитием в сельской местности. Однако муниципалитеты по-прежнему в значительной степени отвечают за свои собственные стратегии экономического развития. Сотрудничество между группами муниципалитетов представляется необходимым для успешной координации политики экономического развития. Во-вторых, влияние окружающих муниципалитетов предполагает созда­ние хорошей связи с другими центрами, включая общественный транспорт, дорожное сообщение и предоставление широкополосной связи, что является важнейшим элементом любой жизнеспособной стратегии развития сельских районов^[40].

Общенациональное перекрестное исследование 29 материковых про­винций и муниципалитетов Китая по данным 2014 г. позволило определить влияние развития сельской территории на занятость жителей и возвращаю­щихся мигрантов. Заброшенность земель отражает спад в развитии аграрной экономики в сельской местности, способствует развитию несельскохозяй­ственной деятельности, а именно мелкой промышленности. Тенденции воз-врата мигрантов, не занимающихся сельским хозяйством в этих областях, связаны с низкой добавочной стоимостью сельского хозяйства. Следова­тельно, во-первых, экономическое развитие сельских районов должно быть более диверсифицированным. Развитие вторичной и третичной промышлен­ности в сельских районах Китая может обеспечить больше возможностей для трудоустройства сельских жителей и возвращающихся мигрантов.

Во-вторых, с корректировкой экономической структуры Китая все больше сельских мигрантов возвращается в сельскую местность, обеспечивая благоприятные условия для развития сельских районов. Местные органы власти Китая должны в полной мере использовать навыки и капитал, привне­сенные этими возвращающимися мигрантами, необходимо создать для сель­ской элиты площадку для проявления своих амбиций.

В-третьих, необходимо создать точки роста в развитии сельских терри­торий с отсталым экономическим развитием^[41].

Исследование доходов сельского населения, проведенное на основе анализа данных статистического бюро Пакистана, позволило выделить и оценить значимость следующих факторов диверсификации: физического ка­питала (включая сельскохозяйственные земли, коммерческие земли и живот­новодческие помещения), человеческого капитала (образование и участие женщин), социального капитала (связь) и институционального капитала (включая доступ к дорогам, транспорту и кредитам).

Проведенный анализ свидетельствует о нарастающей тенденции дивер­сификации доходов сельского сектора. Социально-экономический статус до­мохозяйства имеет воздействие на диверсификацию его доходов. Отсутствие физического капитала приводит членов домохозяйства к несельскохозяй­ственной работе, а более высокий доход из одного источника также приводит к выбору диверсификации для повышения уровня жизни. Сельскохозяй­ственные ресурсы, включая землевладение и животноводческие активы, спо­собствуют специализации фермерских хозяйств. Человеческий капитал сти­мулирует диверсификацию занятости, которая обеспечивает устойчивый до­ход домашних хозяйств.

Таблица 1.5

Оценка диверсификации доходов сельских жителей Пакистана

Создание благоприятных условий для большинства уязвимых слоев сельского населения, испытывающих недостаток в физическом, социальном и человеческом капитале имеет решающее значение для роста несельскохо­зяйственной занятости. Улучшение несельскохозяйственного сектора путем размещения ресурсов может привести к диверсификации, что обеспечит рост качества жизни в сельских районах Пакистана^[42].

Экономический прогресс повышает доходы и уровень жизни людей. Прогресс в сельском хозяйстве и транспорте драматичен и коренным образом изменяет сельскую местность и деревни в ней. Механизация сельского хо­зяйства способствует росту производительности труда. Число фермерских хозяйств неуклонно сокращается, поскольку труд замещается капиталом. В 1930 г. 21,5% рабочей силы США было занято в сельском хозяйстве. В 2000г. 1,9% рабочей силы было занято в сельском хозяйстве. В настоящее время менее 1% населения непосредственно вовлечено в коммерческую деятель­ность сельского хозяйства. При этом США крупный экспортер кукурузы, пшеницы, сои, хлопка, мясо птицы, свинины, фруктов. Там, где развито сельское хозяйство, растет протяженность и качество дорог. Сельские жи­тели могут легче и дешевле путешествовать. Боле широкий ассортимент то­варов в крупных магазинах с большим многообразием изменили потреби­тельские привычки. Интернет-торговля сделала тоже самое. Последствия изменений в сельской местности практически во всех странах одинаковые: сокращение занятых в отраслях сельского хозяйства и переработке сельско­хозяйственной продукции и рост других источников дохода жителей в сель­ской местности^[43].

В 1975 г. в США был введен федеральный налоговый кредит на зарабо­танный доход (EITC) для компенсации налога на социальное обеспечение малообеспеченных семей с детьми. EITC можно было использовать в каче­стве вознаграждения, погашения налоговой задолженности налогоплатель­щиков, а если платеж превышает долг, возврат будет отдан за «переплату». Отдельные семьи имели право на EITC даже если они не должны платить налоги, в результате весь кредит возвращался. Введение EITC также давало повышенный стимул налогоплательщикам к работе. К 2007 г. государством было потрачено 48 млрд. долларов на 24 млн. имеющих на это право работа­ющих семей. Благодаря успеху федерального EITC, 23 штата и округ Ко­лумбия также ввели в действие государственные программы EITC. В 1999-2000г. в США были опрошены 314 матерей, в 2000-2001г. 147 матерей про­живающих в сельской местности. Исследование выявило основные модели потребления налогового кредита: оплата счетов и ссуд (44%опрошенных), приобретение (ремонт) транспортных средств (24%), создание сбережения и увеличение капитала (18%), покупка потребительских товаров разового пользования (20%), покупка потребительских товаров длительного пользо­вания (11%), получение непредвиденного дохода (11%), вложение в челове­ческий капитал (3%). Таким образом, EITC для сельских жителей стал мощ­ным импульсом роста благосостояния семей не только за счет поощрения за­нятости, но и за счет увеличения потребления^[44].

Люди, проживающие в сельской местности, проводят больше времени в самозанятости, чем люди, которые живут в городской местности (анализ данных The Understanding Society за 2009-2019г.). Исследование выявило значительные различия во времени, которое мужчины и женщины выделяют на самозанятость между сельскими и городскими районами в зависимости от их карьерной возрастной группы. В то время как мужчины и женщины, как правило, выделяют больше времени на самозанятость в своем старшем карь­ерном возрасте, когда они живут в городских районах, время, которое они выделяют на самозанятость между сельскими и городскими районами в ран­нем и среднем карьерном возрасте, заметно различается. Существенные раз­личия существуют не только между жителями сельских и городских районов, но и между жителями этих районов и мигрантами в эти районы. Женщины старшего карьерного возраста, мигрирующие в сельскую местность, больше времени выделяют на самозанятость. Напротив, мужчины, которые переез­жают из сельской местности в город, на ранних этапах карьеры, уделяют зна­чительно больше времени самостоятельной занятости. Однако ограниченное подключение к Интернету и ограниченная скорость по-прежнему являются фактором, препятствующим предпринимательству в сельской местности. Улучшение коммуникационной и транспортной инфраструктуры может уменьшить расстояние между в сельской и городской местностью, что позво­ляет предпринимателям вести свой бизнес из сельской местности без необхо­димости жить в большом городе. Самостоятельная занятость может быть вызвана разными причинами для молодых или пожилых мужчин и женщин, которые живут в сельской местности, но, тем не менее, самостоятельная за­нятость дает возможность создавать рабочие места для самозанятых и других лиц в районе их проживания^[45].

Исследование уровня жизни 36756 домохозяйств сельской местности Вьетнама в 2010 г. показало, что несельскохозяйственная занятость оказы­вает положительный и статистически значимый эффект на сокращение про­довольственной бедности домохозяйств. В частности, участие в несельскохо­зяйственной занятости снижает вероятность попадания в продовольственную бедность в будущем примерно на 19%.

31% непродовольственных бедных домохозяйств в сельской местности страдали от продовольственной бедно­сти, что указывает на их высокую вероятность попадания в продовольствен­ную бедность в будущем. Исследование также выявило определяющие факторы роста несельскохозяйственной занятости: доступность для бедных об­разования; инвестирование в ремонт и строительство асфальтированных дорог в селах, открытие и расширение внутри- и межселенных рынков, более широкое распространение рыночной информации посредством Интернет, телевидения и радио, реализация кредитных программ поддержки потенциальных предпринимателей в открытии новых предприятий. Финансовая поддержка малых и средних предприятий особенно важна в несельскохозяйственной экономике сельских районов, поскольку эти фирмы будут двигателями создания большинства несельскохозяйственных рабочих мест в сельской местности^[46].

Анализ уровней занятости и валовой добавленной стоимости (ВДС) в отраслях экономики Европейского Союза в 2000 г. и 2018 г., а также взаимосвязи между занятостью и ВДС, оценка ВДС на 1 чел. занятых в ис-следованных секторах и его изменения за анализируемые года, и шкалы оценки избыточной занятости в сельском хозяйстве при условии, что ВДС в расчете на 1 человека, занятого в этом секторе должна быть равным сред­нему уровню, достигнутому в промышленности и сфере услуг.

Предложен новый показатель «цели» сокращения занятости в сельском хозяйстве, связанный с измерением расстояния между сельским хозяйством и другими секторами с точки зрения ВДС, генерируемого на 1 занятого. Исследование было основано на данных ЕВРОСТАТА за 2000 и 2018 гг. Процесс изменения отраслевой структуры занятости, вероятно, будет определяться темпами роста спроса на услуги, структурной перестройкой, связанной с приведением характеристик сельского населения в соответствие со спросом на рабочую силу в сфере услуг и темпами структурных преобразований в сельской местности. Рационализация уровня занятости в сельском хозяйстве способствует повышению его экономической и социальной устойчивости.

Инструменты, основанные на финансовых трансфертах из несельскохозяйственных секторов в сельское хозяйство, играют второстепенную роль, поскольку они являются бременем для более эффективных секторов и в долгосрочной перспективе могут препятствовать сокращению занятости в сельском хозяйстве. Однако, из-за неизбежных различий в производительности труда, наблюдаемых между сельским хозяйством и несельскохозяйственными секторами, при технологически, экономически, экологически и социально оправданном уровне занятости в сельском хозяйстве происходит перенос излишков, образующихся во вторичном и третичном секторах. Необходимо, по крайней мере, уменьшить, если не устранить, экономические последствия этих различий.

Зарубежный опыт говорит, что нет одинаковых рецептов решения проблем занятости сельского населения. Она зависит от особенностей соци­ально-экономического, политического устройства, культурных традиций, модифицируются с изменением ситуации в экономике и на рынке труда. Вместе с тем, следует отметить, что практически все страны используют ак­тивную политику занятости, то есть воздействуют на уровень занятости путем стимулирования предпринимательской инициативы, создания необходимых условий для роста несельскохозяйственной занятости.

1.3 Институциональный аспект содействия занятости сельского населения в России

Основой государственной политики занятости в России является совокупность общественно-политических отношений и свод законов Конститу­ции Российской Федерации. В ней статьями закреплены пути развития внут­ренней политики государства, определяемые Президентом Российской Феде­рации. В соответствии с Законом «О занятости населения в Российской Фе­дерации»^[47] занятыми считаются граждане:

работающие по трудовому договору, в том числе выполняющие работу за вознаграждение на условиях полного либо неполного рабочего времени, а также имеющие иную оплачиваемую работу (службу), включая сезонные, временные работы, за исключением общественных работ (кроме граждан, участвующих в общественных работах) и осуществления полномочий членов избирательных комиссий, комиссий референдума с правом решающего го­лоса не на постоянной (штатной) основе;

зарегистрированные в установленном порядке в качестве индивидуальных предпринимателей, а также нотариусы, занимающиеся частной практикой, адвокаты, учредившие адвокатские кабинеты, и иные лица, чья профессиональная деятельность в соответствии с федеральными законами подлежит государственной регистрации и (или) лицензированию;

занятые в подсобных промыслах и реализующие продукцию по договорам;

выполняющие работы по договорам гражданско-правового характера, предметами которых являются выполнение работ и оказание услуг, автор­ским договорам, а также являющиеся членами производственных кооперати­вов (артелей);

избранные, назначенные или утвержденные на оплачиваемую должность;

проходящие военную службу, альтернативную гражданскую службу, а также службу в органах внутренних дел, Государственной противопожарной службе, учреждениях и органах уголовно-исполнительной системы, органах принудительного исполнения Российской Федерации;

обучающиеся по очной форме обучения в организациях, осуществляющих образовательную деятельность, включая обучение по направлению государственной службы занятости населения (далее – органы службы занятости);

временно отсутствующие на рабочем месте в связи с нетрудоспособностью, отпуском, переподготовкой, повышением квалификации, приостанов­кой производства, вызванной забастовкой, призывом на военные сборы, привлечением к мероприятиям, связанным с подготовкой к военной службе (альтернативной гражданской службе), исполнением других государственных обязанностей или иными уважительными причинами;

являющиеся учредителями (участниками) организаций, за исключе­нием учредителей (участников) некоммерческих организаций, организаци­онно-правовая форма которых не предполагает права учредителей (участни­ков) на получение дохода от деятельности этих организаций, включая членов товариществ собственников жилья, а также членов жилищных, жилищно-строительных, гаражных кооперативов и иных специализированных потребительских кооперативов, создаваемых в целях удовлетворения потребно­стей граждан, которые не получают доход от их деятельности;

являющиеся членами крестьянского (фермерского) хозяйства.

Федеральная программа развития занятости населения своей целью определяет создание правовых, экономических и институциональных условий, способствующих эффективному развитию рынка труда не зависимо от пространственного фактора^[48].

Ана­лиз региональных программ содействия занятости субъектов Приволжского федерального округа показал, что аналогичная цель содействия занятости населения поставлена в програм­мах Нижегородской, Оренбургской, Самарской, Саратовской областей, Пермского края и Республики Чувашия. Не во всех региональных про­граммах прописаны задачи, указанные в государственной программе РФ «Со­действие занятости населения». Если задачи по обеспечению реализации права граждан на защиту от безработицы и повышению эффективности и регулирования процессов использования трудовых ресурсов и обеспечения защиты трудовых прав граждан в разном толковании указаны во всех региональных программах субъектов Приволжского федерального округа, то третья задача – внедрение культуры безопасного труда только в 9-и регионах. В государственной программе РФ «Содействие занятости населения» все мероприятия представлены в рамках пяти подпрограмм:

активная политика занятости населения и социальная поддержка безработных граждан;

внешняя трудовая миграция;

развитие институтов рынка труда;

оказание содействия добровольному переселению в Российскую Феде-рацию соотечественников, проживающих за рубежом;

безопасный труд.

Не все заявленные в Государственной программе РФ подпрограммы представлены в региональных программах, что объясняется наличием различий в социально-экономическом развитии регионов. Так, в Республике Башкортостан реализуется подпрограмма «Занятость молодежи», в Татарстане – подпрограмма «Популяризация рабочих и инженерных профессий», в Мордовии вовсе нет выделения подпрограмм. Большинство регионов Приволжского федерального округа выделяют необходимость реализации активной политики занятости и социальной поддержки безработных граждан, содействия добровольному переселению соотечественников, проживающих за рубежом, мероприятий направленных на создание безопасных условий труда, трудоустройству инвалидов молодого возраста. Следует отметить, что занятость сельского населения, как проблема, требующего особого решения, не выделяется как в федеральных, так в региональных государственных программах занятости населения.

Можно предположить, что регулирующее воздействие государства на развитие занятости в сельской местности в Российской Федерации оказы­вают нормативно-правовые документы, отражающие государственную поли­тику развития сельских территорий. К ним относятся федеральные целевые программы «Социальное развитие села до 2013 года»^[49], «Устойчивое разви­тие сельских территорий на 2014-2017 годы и на период до 2020 года»^[50], «Ком­плексное развитие сельских территорий»^[51].

Федеральная целевая программа «Социальное развитие села» была направлена на развитие соци­альной и инженерной инфраструктуры в сельской местности, что косвенно должно было повлиять на занятость сельского населения.

Целью реализации программы «Устойчивое развитие сельских терри­торий на 2014-2017 годы и на период до 2020 года было создание комфорт­ных условий жизнедеятельности в сельской местности; стимулирование ин­вестиционной активности в агропромышленном комплексе путем создания благоприятных инфраструктурных условий в сельской местности; содей­ствие созданию высокотехнологичных рабочих мест на селе; активизация участия граждан, проживающих в сельской местности, в реализации обще­ственно значимых проектов; формирование позитивного отношения к сель­ской местности и сельскому образу жизни. Реализованные, в рамках про­граммы инвестиционные проекты стали локальными точками роста в первую очередь сельскохозяйственного производства, способствовали созданию вы­сокотехнологичных рабочих мест и привели к дальнейшему сокращению за­нятых в сельскохозяйственном производстве.

Современная программа «Комплексное развитие сельских территорий» предусматривает мероприятия, направленные не только на создание условий для обеспечения доступным и комфортным жильем сельского населения, развития жилищного строительства на сельских территориях и повышения уровня благоустройства домовладений, создания и развития инженерной, транспортной инфраструктуры на сельских территориях, благоустройства сельских территорий, но и развития рынка труда (кадрового потенциала) на сельских территориях, содействия занятости сельского населения.

Целями государственной политики в области обеспечения устойчивого развития сельских территорий на период до 2030 года являются: создание благоприятных социально-экономических условий для выполнения сель­скими территориями их общенациональных функций и решения задач терри­ториального развития; обеспечение стабилизации численности сельского населения и создание условий для его роста за счет снижения смертности, увеличения ожидаемой продолжительности жизни, уменьшения миграцион­ного оттока населения; обеспечение занятости, повышение уровня и качества жизни сельского населения с учетом современных требований и стандартов; повышение эффективности сельского хозяйства и вклада сельских террито­рий в социально-экономическое развитие страны. Однако и в этой программе содействие занятости сельского населения направлено на поддержку сель­скохозяйственных товаропроизводителей, осуществляющих деятельность на сельских территориях, в обеспечении специалистами и не рассматривается напрямую развитие несельскохозяйственной занятости на сельских террито­риях.

Вместе с тем, до утверждения Федеральной целевой программы «Комплексное развитие сельских территорий» в 2015 г. распоряжением Правительства РФ была утверждена Стратегия устойчивого развития сельских территорий Российской Федерации на период до 2030 года^[52], в которой отмечено, что «… развитие несельскохозяйственных видов деятельности является важным источником занятости и доходов сельского населения, значение которого было существенным всегда в силу сезонности аграрного труда и невозможности обеспечить интенсивную круглогодичную занятость сельского населения в сельскохозяйственном производстве».

Стратегия устойчивого развития сельских территорий Российской Фе­дерации обозначила разработки и внедрения программ профессионального образования и обучения, направленных на подготовку кадров для несельско­хозяйственных видов деятельности.

В тексте Стратегии подчеркивается, что происходящие в результате модернизации сельскохозяйственного производства структурные сдвиги в занятости сельского населения обусловливают необходимость принятия до­полнительных мер по диверсификации сельской экономики, поддержке ма­лого и среднего бизнеса, кооперации и стимулированию развития несельско­хозяйственных видов деятельности в сельской местности. В качестве основ­ных несельскохозяйственных видов деятельности называются:

заготовка древесины и деревообработка, производство строительных материалов и строительство;

промыслы и ремесла;

бытовое и социально-культурное обслуживание населения;

заготовка и переработка дикорастущих плодов и ягод, лекарственных растений и другого природного сырья;

сельский туризм;

торговля.

Приоритетными мерами в области повышения занятости населения и регулирования рынка труда на селе являются:

восстановление и поддержание занятости населения, а также создание новых рабочих мест в сельскохозяйственных организациях, обеспечивающих переход агропромышленного производства на модернизированные трудосбе­регающие инновационные технологии и индустриальные формы ведения хо­зяйства;

поддержка эффективной занятости в сфере малого и среднего сельско­хозяйственного предпринимательства и потребительской кооперации, вклю­чая крестьянские (фермерские) хозяйства и товарные личные подсобные хо­зяйства;

наращивание и модернизация рабочих мест в социальной сфере, на объектах инфраструктуры агропродовольственного рынка (хранение, транс­портировка, сбыт сельскохозяйственной продукции), в сельском строитель­стве и жилищно-коммунальном хозяйстве, а также на объектах транспортной и энергетической инфраструктуры;

стимулирование увеличения рабочих мест в несельскохозяйственных сферах деятельности во всех возможных организационных формах, особенно в сфере рекреационной и природоохранной деятельности, агро- и экологиче­ском туризме, сельском гостиничном бизнесе, подсобных промышленных организациях и народных промыслах, лесопромышленном, водохозяйствен­ном и строительном комплексах, а также в производстве местных строитель­ных материалов;

повышение эффективности самозанятости и использования форм се­мейной занятости в личных подсобных хозяйствах особенно в районах, где сельскохозяйственные организации прекратили свою деятельность, путем их кооперирования, в том числе с крестьянскими (фермерскими) хозяйствами, перерабатывающими и обслуживающими производствами.

В рамках государственной политики в области поддержки малого и среднего предпринимательства для стимулирования развития малого бизнеса на селе, в том числе потребительской кооперации, предусматривается рас­ширение доступа субъектов малого предпринимательства к субсидируемому кредиту, в том числе предпринимателей, желающих организовать альтерна­тивный несельскохозяйственный вид деятельности^[53].

При сравнении двух значимых документов по решению проблемы за­нятости сельского населения, очевидно, что Федеральная целевая программа «Комплексное развитие сельских территорий» реализует две задачи:

первую, повышение доступности для сельских жителей профессио­нального обучения и дополнительного профессионального образования (подпрограмма «Развитие рынка труда (кадрового потенциала) на сельских территориях»);

вторую, создание условий для привлечения и закрепления квалифици­рованных молодых специалистов в сельской местности (подпрограммы «Со­здание условий для обеспечения доступным и комфортным жильем сель­ского населения», «Создание и развитие инфраструктуры на сельских терри­ториях»).

Сущность подпрограммы «Развитие рынка труда (кадрового потенци­ала) на сельских территориях заключается в утверждении правил предостав­ления и распределения субсидий из федерального бюджета бюджетам субъ­ектов Российской Федерации на реализацию мероприятий, направленных на оказание содействия сельскохозяйственным товаропроизводителям в обеспе­чении квалифицированными специалистами», то есть речь не идет о несель­скохозяйственной занятости.

Детальное рассмотрение содержания региональных программ по ком­плексному развитию сельских территорий позволяет утверждать, что в них также не отражена необходимость развития несельскохозяйственной занято­сти. Исключение составляет подпрограмма «Современный облик села», которая предусматривает «… предоставление субсидий муниципальным образованиям на обеспечение комплексного развития сельских территорий путем реализации инициативных проектов, включающих комплекс мероприятий, реализуемых на сельских территориях (сельских агломерациях), предусматривающих: создание, реконструкцию (модернизацию), капитальный ремонт объектов социальной и культурной сферы (в том числе дошкольных образовательных и общеобразовательных организаций, объектов в сфере культуры, спортивных сооружений), объектов социального назначения, центров культурного развития и развития традиционных промыслов и ремесел (строительство центров народно-художественных промыслов, ремесленной деятельности, сельского туризма, организаций народных художественных промыслов, входящих в перечень организаций народных художественных промыслов», поддержка которых осуществляется за счет средств федерального бюджета, утвержденного в соответствии со статьей 4 Федерального закона от 6 января 1999 г. № 7-ФЗ «О народных художественных промыслах»^[54])». Указанные мероприятия обозначены в программах комплексного развития сельских территорий в Республики Мордовия, Самарской и Оренбургской областей. Народно-художественные промыслы, ремесленная деятельность, сельский туризм позволяет сельским жителям, не занятым в сельскохозяйственном производстве, получать доход или дополнительный доход остальным.

Развитие несельскохозяйственной занятости как приоритетное направ­ление национальной политики РФ нашло свое отражение в Государственной программе развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохо­зяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2008-2012 годы. Про­грамма предусматривала государственную поддержку посредством предо­ставления субсидий за счет средств федерального бюджета бюджетам субъ­ектов РФ на возмещение части затрат на уплату процентов по кредитам, по­лученным личными подсобными хозяйствами, крестьянскими (фермерскими) хозяйствами и потребительскими сельскохозяйственными кооперативами в российских кредитных организациях, и займам, полученным в сельскохозяй­ственных кредитных потребительских кооперативах, на срок до 5 лет на раз­витие несельскохозяйственной деятельности в сельской местности (сельский туризм, сельская торговля, народные промыслы и ремесла, бытовое и соци­ально-культурное обслуживание сельского населения, заготовка и перера­ботка дикорастущих плодов и ягод, лекарственных растений и другого не древесного сырья) в размере 95% ставки рефинансирования (учетной ставки) Центрального банка РФ, действующей на дату заключения договора кредита (займа), но не более фактических затрат на уплату процентов по кредиту (займу)^[55].

Финансирование мероприятий Программы за счет средств федераль­ного бюджета предполагалось осуществлять на условиях их финансирова­ния из средств бюджетов субъектов Российской Федерации в размере не менее 5 % ставки рефинансирования (учетной ставки) Центрального банка Российской Федерации, действующей на дату заключения договора кредита (займа).

Не все субъекты Приволжского федерального округа в своих региональных программах развития сельского хозяйства выделили развитие несельскохозяйственной деятельности на сельских территориях как значимую проблему, требующую решения. Так, в Государственной программе «Развитие сельского хозяйства и регулирование рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия в Республике Татарстан на 2013 — 2025 годы» устойчивое развитие сельских территорий и развитие несельскохозяйственной деятельности рассматривается в качестве условия сохранения и привлечения трудовых ресурсов^[56]. Целью подпрограммы «Поддержка малых форм хозяйствования» является поддержание и дальнейшее развитие сельскохозяйственной и несельскохозяйственной деятельности малых форм хозяйствования и улучшение качества жизни в сельской местности, а также развитие садоводческих и огороднических некоммерческих товариществ.

Повышение занятости сельского населения, доходов и качества жизни сельского населения – цель государственной программы «Развитие сель­ского хозяйства и устойчивое развитие сельских территорий в Пермском крае»^[57]. Развитие альтернативных видов занятости сельского населения является одной из задач реализации данной программы

В Ульяновской области с 01.01.2020 г. реализуется Государственная программа Ульяновской области «Содействие занятости населения и разви­тие трудовых ресурсов в Ульяновской области». Целями государственной программы являются:

— обеспечение эффективной занятости населения;

— содействие социально-экономическому развитию Ульяновской обла­сти в части компенсации естественной убыли населения Ульяновской обла­сти и обеспечение потребности экономики в притоке трудовых ресурсов за счёт привлечения соотечественников, проживающих за рубежом (далее – со­отечественники), в Ульяновскую область на постоянное место жительства;

— осуществление системы мер, направленных на обеспечение реализа­ции государственной программы «Содействие занятости населения и разви­тие трудовых ресурсов Ульяновской области»^[58]. В составе программы реализуются два проекта: региональный проект «Старшее поколение»; реги­ональный проект «Содействие занятости женщин и создание условий до­школьного образования для детей в возрасте до трёх лет».

Вместе с тем, для Ульяновской области может быть актуальным разра­ботка и реализация проекта по молодежной занятости, так как демографи­ческая ситуация в регионе подвела к проблеме старения населения и актив­ной миграции молодежи в другие регионы.

В настоящее время одно из направлений несельскохозяйственной заня­тости получило весьма значительную поддержку в рамках реализации Наци­онального проекта «Туризм и индустрия гостеприимства», предусматриваю­щего развитие туристической инфраструктуры и создание качественных тур­продуктов. Постановлением Правительства РФ от 07.12.2019 №1619 «Об утверждении Правил предоставления субсидий из федерального бюджета на грантовую поддержку общественных и предпринимательских инициатив, направленных на развитие внутреннего и въездного туризма» на 2020-2021 годы на грантовую поддержку общественных и предпринимательских ини­циатив, направленных на развитие внутреннего и въездного туризма в феде­ральном бюджете заложено 1,2 млрд. руб.^[59]

Для сельских территорий (внутреннего туризма) гранты можно полу­чить на размещение туристов, организацию общественного питания, расши­рение сети розничных продаж, оздоровление, здоровый образ жизни, цели­тельная сила природы, развлечение, спорт, активный отдых и досуг, куль­турно-этнографический, краеведческий, историко-архитектурный компонент индустрии туризма, событийный туризм и другие виды туризма. Развитие сельского туризма является приоритетным направлением содействия заня­тости практически во всех субъектах Приволжского федерального округа (табл. 1.6).

Таблица 1.6

Перечень основных нормативно-правовых документов регионов

Приволжского федерального округа, направленных на содействие

занятости сельского населения

Таким образом, можно констатировать, что в Российской Федерации, включая субъекты Приволжского федерального округа, создана институцио­нальная основа развития альтернативной занятости сельского населения.

Раздел 2. Оценка уровня занятости населения и подходы к характеристике альтернативной занятости сельских территорий

2.1 Основные тенденции занятости населения Приволжского федерального округа

Приволжский федеральный округ занимает 6,1% территории России. Здесь проживает 21,3% от общего числа граждан страны: это второй по чис­ленности населения федеральный округ после Центрального. Доля округа в общероссийском ВВП превышает 15%. Особенностью округа является нали­чие значительного производственного потенциала. Здесь сосредоточена чет­верть всего промышленного производства России, 85% российского авто­прома, 65% авиастроения, 40% нефтехимии, 30% судостроения, 30% произ­водства оборонно-промышленного комплекса^[60]. Вместе с тем, обеспече­ние устойчивых темпов экономического роста определяются не только эко­номическим и природно-ресурсным потенциалом, но и развитием человече­ского потенциала и наличием необходимых условий для его качественного роста.

Современный период характеризуется устойчивой тенденцией сокра­щения участия рабочей силы в хозяйственной деятельности, как в целом по РФ, в Федеральных округах, так и в отдельных регионах. Общая численность рабочей силы в России в 2019 году составила 75,4 млн. человек, которая сни­зилась за анализируемый период на 278,2 тыс. человек или на 0,4%.

Численность рабочей силы Приволжского федерального округа (ПФО) продолжает сокращаться более высокими темпами. В 2019 году в округе она составила 14772,6 тыс. чел., что ниже 2012 года на 145,7 тыс. чел. (6%). Со­кращение рабочей силы характерно для всех субъектов ПФО, более значи­тельно уменьшилась рабочая сила в Оренбургской (10,6%) и Ульяновской (10,1%) областях. Более постоянна рабочая сила в Республике Татарстан (табл. 2.1).

Таблица 2.1

Динамика численности рабочей силы в ПФО, тыс. чел.

Доля рабочей силы ПФО в Российской Федерации в 2019 году соста­вила 19,6% против 20,8% в 2012 году. По доли численности рабочей силы в ПФО лидирует Республика Татарстан, где сосредоточено 15% экономически активного населения округа и Республика Башкортостан – 14% (рис. 2.1).

В Ульяновской области сосредоточено 4% рабочей силы ПФО, как и в Чувашской Республике, Кировской и Пензенской областях.

Рисунок 2.1 – Доля численности рабочей силы в ПФО, %

Уровень экономической активности населения в ПФО к 2019 г. снизился на 7,9 п.п., для сравнения в Российской Федерации на 6,4 п.п. (табл. 2.2). Наиболее высокие показатели снижения уровня участия в составе рабочей силы населе­ния, превышающие средний уровень Приволжского федерального округа, отме­чаются в семи регионах (Республиках Башкортостан и Марий Эл, Удмуртская и Чувашская Республика, Пермский край, Оренбургская и Ульяновская об­ласть). В Пермском крае самое значительное снижение экономической ак­тивности населения – на 9,9 п.п.

Рисунок 2.2 – Изменение уровня рабочей силы
Ульяновской области и Российской Федерации, %

Уровень участия в составе рабочей силы населения в Приволжском фе­деральном округе составляет 60,7%, что ниже среднего значения по РФ (62,3%) и в динамике этот разрыв увеличивается. В Ульяновской области значение показа­теля 58%, что ниже значения по ПФО на 2,7 п.п. и по РФ на 4,3 п.п. (таб. 2.2).

Таблица 2.2

Уровень участия в составе рабочей силы населения, %

Группировка регионов ПФО по уровню участия в составе рабочей силы населения показала, что наиболее высокий показатель в Нижегородской обла­сти (64,6%), а самый низкий в Республике Башкортостан и Пермском крае (57,8%).

Таблица 2.3

Группировка регионов ПФО по уровню участия в составе

рабочей силы населения, %

Ульяновская область входит в первую группу с наименьшим уровнем эко­номически активного населения, в которую входит 5 регионов или 35,7% сово­купности. Наиболее высокие показатели уровня участия в составе рабочей силы населения, превышающие средний уровень РФ и округа, наблюдаем в 5 регионах (Республиках Татарстан, Удмуртия и Мордовия, Самарская и Нижегородская область).

В таблице 2.4 представлен уровень занятости по Приволжскому феде­ральному округу. Следует отметить, что до 2016 года включительно
Росстат публиковал показатели занятости в расчете на население в возрасте от 15 до 72 лет, а с 2017 года – от 15 лет и старше.

В целом по Российской Федерации отмечается положительная дина­мика увеличения численности занятых, к 2019 году рост составил 387,7 тыс. чел. или 0,5% по сравнению с 2012 годом. По Приволжскому федеральному округу наблюдается обратная тенденция, численность занятых уменьшилась на 730,6 тыс. чел. или на 4,9%. Среди регионов Приволжского федерального округа наибольший спад численности занятых наблюдается в Оренбургской области – на 9,7%, Пермском края – на 8,7% и Ульяновской области – на 8,4%. Небольшой рост занятости отмечаем в Республике Татарстан.

Таблица 2.4

Динамика численности занятых в ПФО, тыс. чел.

При снижении численности занятого населения просматривается и сокра­щение уровня занятости в ПФО, к 2019 году он снизился на 6,8 п.п., в Российской Федерации на 5,5 п.п. (табл. 2.5), но данное изменение ниже, чем снижение уровня участия в рабочей силе. Самое высокое сокращение уровня занятости населе­ния в 2019 году среди регионов Приволжского федерального округа наблю­далось в Пермском крае – на 8,7 п.п., в Оренбургской области – на 8,5 п.п. и в Ульяновской области – на 8 п.п.

Таблица 2.5

Уровень занятости населения в ПФО, %

Средний уровень занятости населения в ПФО в отчетном году сло­жился на уровне 58,1%. По показателю уровня занятых необходимо отме­тить, что самый высокий показатель в 2019 году среди регионов Приволж­ского федерального округа наблюдался в Нижегородской области — 61,6%, самый низкий – в Пермском крае 54,8%.

Группировка регионов ПФО выявила самую многочисленную группу с низким уровнем занятости населения (до 56%), в которую входит и Ульянов­ская область. Уровень занятости в регионе варьирует от 64,5% до 55,9% в 2019 году.

Таблица 2.6

Группировка регионов ПФО по уровню занятости населения, %

Наиболее высокие показатели уровня занятости, превышающие средний уровень РФ и ПФО, наблюдаем в 5 регионах (Республиках Татарстан, Удмуртия и Мордовия, Самарская и Нижегородская область).

При характеристике занятого населения отметим структурные изменения по возрасту и образованию. В структуре занятого населения РФ по возрасту наиболее многочисленную возрастную группу составляют лица в возрасте 30-39 лет, на долю которой приходится 29,3% общей численности занятых, несколько ниже доля возрастной группы 40-49 лет – 24,8% (табл. 2.7). Самый низкий процент занятых – молодежь до 19 лет и пожилые люди в возрасте 70 лет и старше (0,5%). Представленная возрастная структура характерна для всех регионов и Приволжского федерального округа, так как это возраст наивысшей трудовой активности. В Ульяновской области 75,3% занятого населения имеют возраст от 30 до 59 лет.

Особенностью изменения возрастной структуры занятых в течение по­следних лет является уменьшение занятой молодёжи в возрасте от 20 до 29 лет, что можно объяснить предположительно ростом востребованности среди молодежи получения профессионального образования, либо не желания ра­ботать, наличие иждивенческой модели поведения молодежи.

Таблица 2.7

Структура занятых по возрастным группам в 2019 году, %

Средний возраст занятого населения в Приволжском федеральном округе в отчетном году 41 год, в Ульяновской области – 41,6 лет.

Отмечается связь между занятостью и уровнем образования. Почти 80% занятых в РФ имеют высшее или среднее профессиональное образова­ние. Исходя из этих данных, можно сказать о том, что подавляющее количе­ство людей понимают важность образования и стремятся его получить.

В Приволжском федеральном округе доля занятого населения с выс­шим образованием несколько ниже – 31,8%, а со средне — профессиональным выше – 47,4%. Высоким уровнем занятого населения с высшим образованием отличается Самарская область (36,3%), Республика Татарстан (35,8%), Рес­публика Мордовия (34,8%). Ульяновская область делит 8 — 9 позицию с Рес­публикой Башкортостан по доле занятого населения с высшим образованием (29,9%). Уступает область и по весу занятого населения со средне — профес­сиональным образованием, так как в регионе самый высокий уровень заня­тых со средним общим образованием (26%).

Таблица 2.8

Структура занятых по уровню образования в ПФО в 2019 г., %

В динамике прослеживается тенденция увеличения количества заня­того населения, имеющего высшее и среднее образование. Однако структура занятых по уровню образования показывает сокращение доли занятых со средним профессиональным образованием, доли квалифицированных рабо­чих и служащий, среднего общего, основного общего образования. За по­следние пять лет наблюдается значительный рост доли занятых с высшим образованием.

Анализ численности занятого населения по месту основной работы по­казал, что подавляющее большинство предпочитают трудоустраиваться на предприятии, в организации со статусом юридического лица: в РФ это 80,7% занятых, в ПФО – 79,6%, в Ульяновской области – 81,9%. Меньше всего доля таких занятых в Саратовской области (70,6%), наибольшая – в Респуб­лике Татарстан (83,7).

Таблица 2.9

Численность занятых по месту основной работы в ПФО в 2019 году, тыс. чел.

В настоящее время растет занятость населения в сфере предприниматель­ской деятельности, но уровень занятости в этой сфере оста­ется довольно низкий: в РФ – 5%, в ПФО – 4,4%, в Ульяновской области – 4,2%. Группировка регионов ПФО показала, что в большинстве субъектов доля занятости населения в сфере предпринимательской деятельности без образования юридического лица ниже, чем в среднем по округу, таких реги­онов 8 или 57,1%. Более высокая предпринимательская активность в трех ре­гионах (Кировская область, Чувашская Республика, Оренбургская область), в которых показатель выше средне российского значения.

Таблица 2.10

Группировка регионов ПФО по доле занятости населения в сфере

предпринимательской деятельности без образования юридического лица, %

Увеличивается и занятость по найму у физических лиц, индивидуаль­ных предпринимателей, в фермерском хозяйстве. В регионах Приволжского федерального округа уровень этой занятости изменяется от 10,5% в Респуб­лике Татарстан до 18,6% в Пензенской области. В Ульяновской области по найму у индивидуальных предпринимателей и в фермерских хозяйствах за­нято 73,5 тыс. чел. или 12,5% всех занятых.

Незначительная доля занятых трудится в собственном домашнем хо­зяйстве по производству продукции сельского, лесного хозяйства, охоты и рыболовства для продажи или обмена. В ПФО в 2019 году это 169,4 тыс. чел. или 1,2%. В Ульяновской области данной деятельностью занято 8,2 тыс. чел. или 1,4%. В пяти регионах доля занятых в домашнем хозяйстве менее 1%, в трех регионах – более 3%.

Таблица 2.11

Группировка регионов ПФО по доле занятости населения в собственном

домашнем хозяйстве по производству продукции сельского, лесного

хозяйства, охоты и рыболовства для продажи или обмена, %

Особенностью занятости населения в собственном домашнем хозяй­стве по производству продукции сельского, лесного хозяйства, охоты и ры­боловства является по то, что продукция может быть предназначена для про­дажи или для собственного конечного потребления. Доля занятых в домаш­них хозяйствах, производящих продукцию для товарного производства невы­сокая – 8,2% в РФ, 6% в ПФО. Их них заняты только этой деятельностью 65,2% (РФ), 55,9% (ПФО), т.е. для них это основное место работы и един­ственный источник дохода.

В Ульяновской области доля занятых в домашних хозяйствах, произво­дящих продукцию для продажи выше, чем в среднем по Приволжскому фе­деральному округу – 8% и выше процент занятых для которых это основное место работы – 56%.

В основном, занятые в домашнем хозяйстве, производят продукцию для удовлетворения собственных потребностей. Из них 45,3% (ПФО) заняты только этой деятельностью, из них 2,8% являются безработными. Остальные занятые имеют помимо этой деятельности другое доходное занятие (заняты другими видами экономической деятельности).

Таблица 2.12

Занятость населения производством продукции в домашнем хозяйстве в ПФО в 2019 году, тыс. чел.

В Ульяновской области 167,7 тыс. чел. или 92% занятых в личных под­собных хозяйствах производят продукцию для собственного потребления. Для 76,1 тыс. чел. это деятельность является единственной, из них 5,5 тыс. чел. имеют статус безработных, т. е. хотели бы заниматься общественно — по­лезной деятельностью.

Структура занятого населения на основной и дополнительной работе по ви­дам экономической деятельности значительно различается. По данным обследо­вания, в 2019 году среди занятого населения в ПФО 13751,2 тыс. человек имели одну работу и только 401,4 тыс. человек (2,8%) имели дополнительную работу. По ответам респондентов 322,3 тыс. человек занятого населения (2,3%) хотели бы иметь дополнительную работу и активно ее искали.

Таблица 2.13

Численность занятых по наличию дополнительной работы и готовности к дополнительной занятости в ПФО в 2019 году

В регионах ПФО доля занятого населения, работающих на двух работах и более, колеблется от 1,5% в Республике Башкортостан до 5,7% в Кировской области. В Ульяновской области только 12,8 тыс. чел. или 2,2% занятого населения имело дополнительную работу и 13,3 тыс. чел. или 2,3% хотели бы ее иметь.

На фоне сокращения уровня занятости в округе и его субъектах проис­ходит практически повсеместное сокращение уровня общего коэффициента безработицы (табл. 2.14)

Таблица 2.14

Уровень безработицы населения в ПФО, %

Уровень безработицы по методологии МОТ (Международная органи­зация труда) остается низким – он сократился с 5,5% до 4,6% в 2019 году. В целом по Российской Федерации наблюдается снижение общего коэффици­ента безработицы на 0,9 п.п., по Приволжскому федеральному округу – на 1,1 п.п. Региональная дифференциация также устойчива и обусловлена сочета­нием демографических и экономических факторов. Из всех субъектов ПФО Ульяновская область показала самое значительное снижение уровня безрабо­тицы (на 1,8 п.п.). Стоит отметить, что показатель уровня безработицы в Ульяновской области (3,8) один из лучших в ПФО (2 место), меньше уровень только в Республике Татарстан (3,3). В девяти регионах (64,3%) уровень без­работицы выше среднего значения Приволжского федерального округа, в трех регионах он выше среднего значения по РФ.

Региональные различия в занятости населения субъектов Приволж­ского федерального округа показали существование некоторых закономерно­стей: высокий уровень занятости, как правило, характерен в регионах с более высоким уровнем развития территории, низкой социальной напряженности, высоким уровнем благосостояния населения.

Обобщив представленные данные по занятости населения, можно сде­лать вывод, что Ульяновская область за последние пять лет характеризуется более низким уровнем участия рабочей силы в экономической деятельности региона и более высоким темпом ее снижения (табл. 2.15). В области уровень занятости населения также ниже значений по РФ и ПФО. Как положитель­ную тенденцию отмечаем за весь анализируемый период более низкий уро­вень безработицы и высокий темп его снижения.

Отличается Ульяновская область более высоким удельным весом заня­того населения в возрасте 50-69 лет, и низким – вовлечением в трудовую дея­тельность молодежи в возрасте до 19 лет. Уступает область многим регионам ПФО по уровню занятого населения с высшим и со средне — профессиональ­ным образованием. В Ульяновской области занятость населения в сфере предпринимательской деятельности ниже среднего значения по ПФО, но в области выше доля занятых в домашних хозяйствах, производящих продук­цию для продажи.

Таблица 2.15

Обобщающая характеристика занятости населения в Ульяновской области

Рисунок 2.3 – Занятость населения ПФО в сельском, лесном хозяйстве, охоте, рыболовстве и рыбоводстве, 2010 г., %

Структура занятости в субъектах Приволжского федерального округа по видам деятельности отличается «Аграрная занятость» характерна была в 2010 году для Республики Марий Эл (9,9%) и Кировской области (8,4%) (рис. 2.3).

В 2018 году занятость в отраслях сельского хозяйства возросла, так, в Республике Марий Эл до 19,8%, Оренбургской области до 14,6% и Пензен­ской области до 11,3%. Резкое сокращение занятых в сфере сельского хозяй­ства в 2018 году произошло в Пермском крае до 4,2% и Нижегородской об­ласти до 4,1% (рис. 2.4).

Рисунок 2.4 – Занятость населения ПФО в сельском, лесном хозяйстве,

охоте, рыболовстве и рыбоводстве, 2018г., %

В обрабатывающих отраслях занятость по регионам ПФО примерно на одинаковом уровне от 23% до 34%, в 2010 году и в 2018 году Резкое сокра­щение занятых в отраслях обрабатывающей промышленности показала Рес­публика Чувашия – с 30,5% до 23%.

Лидирует по доли занятых сфера услуг по всем субъектам ПФО. Необ­ходимо отметить, что изменения в занятости коснулись и этой сферы. Если в 2010 году региональные различия были весьма значительны, от 52,9% в Рес­публики Марий Эл до 63,3% в Нижегородской области.

То уже в 2018 году практически все субъекты подтянулись до уровня 60% занятых в сфере услуг. Только три субъекта — Нижегородская область, Ульяновская область и Республика Мордовия имели занятость населения в сфере услуг ниже медианы: 35,3%, 40,4% и 53,2% соответственно. При этом Мордовия незначительно, но все же, увеличила занятость в сфере услуг (на 0,3%), то Нижегородская область в два раза, Ульяновская область на 13,4% её сократили. Сфера услуг наиболее динамично развивающийся сектор эко­номики. Можно предположить, что как минимум в двух регионах округа экономика сферы услуг стагнирует.

Рисунок 2.5–Занятость населения ПФО в обрабатывающих отраслях,2010г.,%

Рисунок 2.6 – Занятость населения ПФО в обрабатывающих отраслях,

2018г., %

Рисунок 2.7 – Занятость населения ПФО в сфере услуг, 2010г., %

Рисунок 2.8 – Занятость населения ПФО в сфере услуг, 2018г., %

Для выявления отраслей с высоким потенциалом повышения уровня занятости был проведен структурный анализ экономики с позиции занятости. В основе анализа использован метод сдвиг – составляющих, применяемых для анализа причин изменений в структуре занятости. Применение метода сдвиг — составляющей позволяет разграничить суммарный прирост на три доли и выявить значение влияния региональной, отраслевой и областной со­ставляющей.

Региональная составляющая (NS) отражает тенденции развития эконо­мики на региональном уровне и определяется следующим образом:

,

где Qi – численность занятых в 2010 г.;

T – темп роста занятых в федеральном округе за 2010 – 2019 гг.

Отраслевая составляющая (IM), отражающая тенденции развития от­дельной отрасли экономики, вычисляется по формуле:

,

где T_j – темп роста занятых в отрасли федерального округа за 2010 – 2019 гг.

Областная составляющая (LF) отражает влияние региональных факто­ров:

,

где T_i – темп роста занятых в отрасли занятых.

R – общее изменение региональной занятости определяется по фор­муле:

R = NS + IM + LF.

Оценка влияния сдвигов на изменение численности занятых в субъек­тах Российской Федерации за 2010 – 2019 гг. представлена в Приложении 1.

Группировка субъектов Российской Федерации по степени влияния ре­гионального фактора на изменение численности занятых позволила выделить пять регионов. Положительное влияние регионального фактора на изменение численности занятых в экономике субъектов с 2010 по 2019 гг. наблюдается в 29 регионах, в том числе в 4-х регионах данное влияние проявилось в росте числа занятых более чем на 100 тыс. человек – Краснодарский край, Ростов­ская область, Волгоградская область, г. Москва, еще в 4-х регионах – на 50 – 100 тыс. человек – Ставропольский край, Астраханская область, Республика Дагестан, Московская область.

Таблица 2.16

Группировка субъектов Российской Федерации по степени влияния

регионального фактора на изменение численности занятых

В 49-и субъектах Российской Федерации изменение в федеральных округах отрицательно сказалось на численности занятых в экономике, в большей степени в Нижегородской и Самарской областях, в Республиках Башкортостан и Татарстан, где сокращение численности занятых превысило 100 тыс. человек. Еще в 9-и субъектах (Пензенская область, Кемеровская об­ласть, Новосибирская область, Красноярский край, Удмуртская Республика, Оренбургская область, г. Санкт-Петербург, Саратовская область, Пермский край) сокращение числа занятых составило от 50 до 100 тыс. человек.

Ранжирование субъектов Российской Федерации по степени влияния отраслевого фактора на изменение численности занятых за 2010 – 2019 гг. показало существенное влияние данного фактора на рост числа занятых в г. Москва (рост численности занятых 208,9 тыс. человек). Еще в 4-х субъектах Российской Федерации рост численности занятых за счет отраслевых сдвигов достиг величины от 20 до 50 тыс. человек – г. Санкт-Петербург, Тюменская область, Самарская область, Краснодарский край. Положительное влияние изменение отраслевой экономики сказалось на 34-х субъектах Российской Федерации. В 46-и субъектах Российской Федерации отраслевые изменения отра­зились в виде сокращения численности занятых, в том числе в пяти субъек­тах более чем на 20 тыс. человек (Республика Башкортостан, Челябинская, Белгородская, Тамбовская и Воронежская области).

Влияние третьего фактора, характеризующего эффективность внутри­региональной политики, также позволило определить пять групп. В первую группу вошли г. Москва, г. Санкт-Петербург, Республика Татарстан, Чеченская Республика. Данные регионы характеризуются высокоэффективной региональной политикой, способствующей росту численности занятых в экономике за 2010 – 2019 гг. более чем на 100,0 тыс. человек. Еще в трех регионах (Челябинская область, Новосибирская область, Тюменская область) рост числа занятых за счет проведения внутрирегиональной экономики составил от 50 до 100 тыс. человек. В целом эффективность внутрирегиональной политики подтверждена для 22-х субъектов Российской Федерации.

Таблица 2.17

Группировка субъектов Российской Федерации по степени влияния

отраслевого фактора на изменение численности занятых

Таблица 2.18

Группировка субъектов Российской Федерации по степени влияния

внутрирегионального фактора на изменение численности занятых

В 58-и субъектах Российской Федерации внутрирегиональная политика занятости оказалась неэффективной, в большей степени – в Астраханской, Свердловской, Волгоградской и Ростовская областях, Краснодарском крае, где сокращение численности занятых под влиянием данного фактора соста­вило более 100 тыс. человек. В 10-и регионах данное снижение достигло ве­личины от 50 до 100 тыс. человек. Это Республика Коми, Республика Север­ная Осетия – Алания, Курганская область, Вологодская область, Ставрополь­ский край, Тульская область, Кемеровская область, Брянская область, Смо­ленская область, Тверская область.

Для 16-и субъектов Российской Федерации (Республика Алтай, Каре­лия, Коми, Бурятия, Чувашская Республика, Курганская, Псковская, Новго­родская, Архангельская, Вологодская, Ленинградская, Омская, Свердловская, Ульяновская и Кировская области, Забайкальский и Алтайский края) данное снижение не превысило 20 тыс. чел.

В целом, следует отметить, что только в 3-х субъектах Российской Фе­дерации все три фактора оказали положительное влияние на изменение чис­ленности занятых в экономике – г. Москва, Московская область, Республика Ингушетия.

Исследование сдвиг — составляющих в разрезе федеральных округов Российской Федерации показало, что первый фактор оказал положительное влияние только на изменение численности занятых в экономике Централь­ного, Южного и Северо-Кавказского федеральных округов. Отраслевой фак­тор в целом не оказывает существенного влияния, незначительное снижение численности занятых за счет отраслевой составляющей произошло только в Приволжском и Сибирском федеральных округах. Внутрирегиональный фак­тор имеет положительное влияние также для Центрального, Южного и Се­веро — Кавказского федеральных округов, при этом наибольший рост числен­ности занятых наблюдается в Южном федеральном округе (на 938,7 тыс. чел.).

2.2 Комплексный анализ неформальной занятости

Развитие нестандартной занятости имеет актуальное значение в совре­менных условиях. Распространение той или иной формы нестандартной за­нятости обусловлено демографическим кризисом, сопровождающимся ста­рением населения, ростом студенческой занятости, массовым участием жен­щин на рынке труда, развитием малого предпринимательства и т. д. Одной из ключевых причин распространения нестандартных форм занятости является потребность в увеличении гибкости трудовых отношений для участников рынка труда. Одной из форм нестандартной занятости является неформаль­ная занятость.

К занятым в неформальном секторе относятся лица, которые в течение обследуемого периода были заняты, по меньшей мере, в одной из производ­ственных единиц неформального сектора независимо от их статуса занятости и от того, являлась ли данная работа для них основной или дополнительной.

В качестве критерия определения единиц неформального сектора при­нят критерий отсутствия государственной регистрации в качестве юридиче­ского лица. К занятым в неформальном секторе относятся:

— индивидуальные предприниматели;

— лица, работающие по найму у индивидуальных предпринимателей и физических лиц;

— помогающие члены семьи в собственном деле, принадлежащем кому-либо из родственников;

— работающие на индивидуальной основе, без регистрации в качестве индивидуального предпринимателя;

— занятые в собственном домашнем хозяйстве по производству продук­ции сельского, лесного хозяйства, охоты и рыболовства для продажи или об­мена.

В динамике 2010 – 2019 гг. общее число занятых в неформальном сек­торе РФ возросло с 11482 до 14800 тыс. чел. или на 28,9%. По мнению экс­пертов, данный рост обусловлен сокращением малого бизнеса и миграцией предпринимателей в ИП или самозанятых.

В разрезе возрастных групп наблюдается существенное сокращение численности занятых в неформальном секторе в возрасте 15-24 лет, в том числе в возрасте 15-19 лет с 273 до 168 тыс. чел. или на 38,46%, в возрасте 20-24 лет с 1264 до 955 тыс. чел. или на 24,45%. По остальным возрастным группам численность занятых возросла. Наиболее высокие темпы роста чис­ленности занятых в неформальном секторе сложились по возрастной группе 65-69 лет – 97,66%. Существенный рост занятых наблюдается для занятых в возрасте 60-64 лет и 55-59 лет – 86,80 и 67,52% соответственно. Средний возраст занятых в неформальном секторе за 2010 – 2019 гг. повысился с 39 до 40,4 лет.

Таблица 2.19

Численность занятых в неформальном секторе Российской Федерации по возрастным группам

Наибольшая доля в структуре неформальной занятости приходится на возрастную группу 30-34 лет (15,6%). Вторую и третью позицию в данной структуре занимают занятые в возрасте 35-39 лет и 25-29 лет, что составляет соответственно 14,3 и 13,4% соответственно (Приложение 2).

В структуре численности занятых в неформальном секторе наблюда­ется существенное снижение доли возрастной группы 20-24 лет с 11,0 до 6,5% или на 4,6 п.п. На 2,0 п.п. сократилась доля занятых, находящихся в возрасте от 45 до 49 лет, составив в 2019 г. 11,2%. Снижение доли в струк­туре численности занятых в неформальном секторе наблюдается также по группам 15-19 лет (на 1,2 п.п.), 25-29 лет (на 0,1 п.п.), 50-54 лет (на 0,9 п.п.).

Рисунок 2.9 – Структура занятых в неформальном секторе

Российской Федерации по возрасту, %

Анализ занятых в неформальном секторе по половому признаку пока­зал рост численности мужчин с 6424 до 8181 тыс. чел. или на 27,35%, жен­щин – с 5058 до 6619 тыс. чел. или на 30,86%. Доля неформально занятых среди мужчин выше, чем среди женщин.

В структуре занятых по половому признаку на долю мужчин прихо­дится 55,3%. Женщины формируют 44,7% численности занятых в нефор­мальном секторе. За 2010 – 2019 гг. структура неформальной занятости по полу существенно не изменилась.

Таблица 2.20

Численность и структура занятых в неформальном секторе

Российской Федерации по полу

Таблица 2.21

Доля занятых в неформальном секторе в общей численности занятых по возрастным группам, %

Исследование доли занятых в неформальном секторе в общей числен­ности занятых по возрастным группам показало, что за 2010 – 2019 гг. сте­пень вовлеченности в неформальный сектор возросла с 16,4 до 20,6% или на 4,2 п.п. В наибольшей степени в неформальный сектор вовлечены занятые в возрасте 15-19 лет, при этом их доля в общей численности занятых возросла на 9,1 п.п., с 38,9% в 2010 г. до 48,0% в 2019г. Высокая степень вовлеченно­сти в неформальную занятость характерна и для возрастной группы 70 лет и старше – 39,3%. В меньшей степени в неформальный сектор вовлечены заня­тые в возрасте 55-59 лет и 60-64 лет – 17,4 и 17,9% соответственно.

Рисунок 2.10 – Доля занятых в неформальном секторе в общей численности

занятых по возрастным группам, %

За последние 10 лет существенно возросла вовлеченность в нефор­мальный сектор и занятых в возрасте 20-24 лет (на 7,1 п.п.), 25-29 лет (на 5,1 п.п.), 50-54 лет (на 4,9 п.п.), 55-59 лет (на 4,6 п.п.), 30-34 лет (на 4,5 п.п.).

Анализ занятых в неформальном секторе Российской Федерации по уровню образования показал рост численности занятых с высшим образова­нием на 64,84%, со средним профессиональным образованием – на 34,62%, со средним общим образованием – на 9,66%, с основным общим образова­нием – на 15,73%. Численность занятых в неформальном секторе, не имею­щих основного общего образования, за 2010 – 2019 гг. уменьшилась на 23,26%.

Таблица 2.22

Численность занятых в неформальном секторе Российской Федерации по уровню образования