Разработка методических указаний по ранней диагностике и профилактике инфекционных болезней, в т.ч. герпесвирусной болезни осетровых рыб (молоди)

Титульный лист и исполнители

РЕФЕРАТ

Отчет 34 с., 22 рис., 8 табл., 14 источников.

ГЕРПЕСВИРУСНАЯ БОЛЕЗНЬ, ЗАРАЖЕНИЕ, МЕТОДЫ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ, ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, ДЕСКВАМАЦИЯ ЭПИДЕРМИСА, НЕКРОЗЫ В ПЕЧЕНИ И ПОЧКАХ, ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТ, ЭНТЕРИТ

Объектами для экспериментального заражения и лабораторных исследований являлись мальки и сеголетки сибирского и русского осетров.

Цель работы – на основании вирусологических и патоморфологических исследований усовершенствовать методы ранней диагностики герпесвирусной болезни молоди осетровых рыб и разработать методические указания по диагностике и профилактике инфекционных болезней (герпесвирусной болезни) молоди осетровых рыб.

В процессе работы проводили экспериментальное заражение мальков русского и сибирского осетров герпесвирусом SbSHV (изолят SK/1114) и в динамике развития болезни комплексно исследовали рыб с применением вирусологических, клинических и патоморфологических методов.

В результате исследований впервые экспериментально установлена чувствительность к заражению герпесвирусом молоди (мальков) русского и сибирского осетров на ранней стадии развития, что позволяет рекомендовать использовать мальков в качестве тест-объектов для постановки биопроб при диагностике болезни. Получены новые данные об особенностях течения и клинического проявления и патоморфологические изменения при герпесвирусной болезни, которые используются как основа для постановки предварительного диагноза.

При определении патогенности миксобактерий и аэромонад (Aeromonas verоnii) осложняющих течение герпесвирусной болезни, установлено, что заражение интактных сеголеток происходит только аэромонадами и только при внутримышечном способе заражения.

Экспериментально доказана возможность использования витамина С для профилактики герпесвирусной болезни у мальков сибирского осетра.

Разработаны и рекомендованы для внедрения в практику Методические указания «Диагностика и профилактика герпесвирусной болезни и вторичных инфекций молоди осетровых рыб», что обеспечит повышение эффективности индустриального осетроводства за счет своевременной диагностики болезни и проведения профилактических мероприятий.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем отчете о НИР применяются следующие термины и определения:

Аквакультура – выращивание водных организмов в искусственных водоемах

Аэромонады – бактерии рода аэромонас

Бестер – гибрид белуги и стерляди

Гиперплазия – размножение клеток в тканях

Гломерулонефрит – воспаление в клубочках почек

Дистрофия гидропическая – белковая дистрофия, проявляющаяся появлением в цитоплазме клеток вакуолей, заполненных жидкостью

Заражение методом ванн – выдерживание рыб в воде, зараженной вирусом, бактериями

Жучки – это ряды костяных щитков (головные, брюшные, спинные), характерные для рыб осетровых пород

Инкубационный период – время от момента заражения вирусом до появления симптомов болезни

Кариопикноз – сморщивание ядер клеток

Кумулятивная гибель – суммарная гибель рыб в течение эксперимента

Мальки – молодь рыб возрастом до 1 месяца

Миксобактериоз – болезнь, вызываемая слизистыми бактериями (миксобактериями)

Некронефроз – омертвение (некроз) почечных канальцев

Осетры – рыбы семейства Осетровых

Осетры русский, сибирский (син. ленский) – виды осетровых рыб

Сеголетки – молодь рыб возрастом до 1 года

Сапролегниоз – болезнь, вызываемая грибком сапролегния

SbSHV –герпесвирус сибирского осетра

SSO-2 – обозначение культуры клеток, полученной из тканей печени, почек, селезенки сибирского осетра Acipenser baeri

WSS-2 – обозначение культуры клеток, полученной из тканей селезенки белого осетра Acipenser transmontanus

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время осетровых рыб выращивают в аквакультуре по интенсивной технологии – в основном с целью получения пищевой икры и мяса, меньше – для пополнения естественных запасов осетровых. Сейчас в РФ работает более 80 осетровых хозяйств разного профиля. В 2019 г. мировое производство осетровых на мясо составило 93,5 тыс. т, в т.ч. в Китае 83,0 т, РФ 2,5 тыс. т, производство икры – около 200 т, в т.ч. в Китае – 50 т, РФ всего – 20 т.

Болезни осетровых рыб наиболее распространены в аквакультуре и наносят значительный экономический ущерб, составляющий примерно 10% от общих затрат на их выращивание Инфекционные болезни, особенно вирусные, изучены значительно хуже, чем инвазионные, по ним практически отсутствуют нормативные документы. Поэтому, изучение герпесвирусной болезни, появившейся в последние годы, и осложняющих ее бактериозов является актуальным [3,4].

Впервые болезнь выявлена у белого и тупорылого осетра в конце ХХ века в США и Канаде [14]. В России первая вспышка болезни, сопровождавшаяся массовой гибелью молоди сибирского осетра, отмечена весной 2006 г. Однако, эпизоотическая ситуация по данной болезни в РФ окончательно не выяснена, но герпесвирус выделен еще в 2-х хозяйствах РФ и в одном рыбхозе Казахстана. Предполагают, что он был занесен в них с посадочным материалом сибирского осетра, полученным из вышеуказанного неблагополучного хозяйства [12, 13].

Возбудитель болезни – герпесвирус SbSHV группы Acipenserid herpesvirus 2 (AciHV2). В России он выделен от сибирского осетра, генетически близок к канадскому изоляту, изучена его структура и биологические свойства, в т.ч.вирулентные [12,13]. Он относится к семейству Alloherpesviridae, роду Ictalurivirus, обладает тропизмом к эпителиальным тканям, особенно к кожному эпидермису, репродуцируется исключительно в перевиваемых культурах клеток сибирского осетра SSO-2 и белого осетра WSS-2 при температуре 15-17ºС. Основными источниками возбудителя являются больные рыбы и их трупы, а путями передачи инфекции – вода, орудия лова и другие предметы ухода. Не исключена передача вируса от производителей их потомству, хотя этот вопрос пока не изучен.

Нами в 2012-2018 гг. в серии опытов по экспериментальному воспроизведению герпесвирусной болезни и при ее спонтанном течении подробно изучены симптомы и патоморфологические изменения у сеголеток сибирского осетра и его гибрида с русским осетром возрастом 2-6мес. Полученные результаты опубликованы в 7 научных статьях (в т.ч. 3 в изданиях ВАК) и в одной лекции (2018 г.), и вошли в кандидатскую диссертацию (2018 г.) [5,6,7,8,9,10]. В то же время недостаток данных о чувствительности к вирусу основного объекта осетроводства – русского осетра, а также проявлении болезни у ранней молоди (мальков) осетровых сдерживает разработку обоснованных методов диагностики и профилактики болезни.

Цель работы – на основании вирусологических и патоморфологических исследований усовершенствовать метод диагностики инфекционных болезней (герпесвирусной болезни) молоди осетровых рыб на раннем этапе развития и разработать методические указания по диагностике и профилактике заболеваний.

Задачи исследований:

воспроизвести экспериментально герпесвирусную болезнь молоди осетровых рыб;

провести исследования и определить наиболее характерные патоморфологические изменения внутренних органов молоди осетровых рыб с применением гистохимических методов исследования;

разработать методические указания по ранней диагностике и профилактике инфекционных болезней (герпесвирусной болезни) молоди осетровых рыб.

1 Материал и методы исследований

Объектами исследований служили мальки русского (Acipenser gueldenstaedti) и сибирского (Acipenser baeri) осетра массой 5-8 г. возрастом до 1 мес., полученные из производственных рыбопитомников и доставленные автотранспортом. После транспортировки рыб пересаживали в проточные аквариумы емкостью 70 л с артезианской водой, адаптировали к условиям аквариумов в течение 15 дней путем постепенного понижения температуры воды до 15-17°С и достижения устойчивого потребления рыбами комбикорма марки ЛимКорм помола № 1,5 мм. Опыты ставили в 2-3-х кратной повторности в тех же аквариумах на артезианской воде, отвечающей рыбоводным требованиям, при температуре 15 – 17^оС. Формировали опытные и контрольные группы рыб в количестве не менее 10 экз. и рассаживали их в соответствующие аквариумы. Поставлено 2 опыта по экспериментальному заражению герпесвирусом мальков русского (опыт №1) и сибирского (опыт 2) осетра, опыт 3 по определению профилактической эффективности витамина С и опыт 4 по дополнительному заражению сеголеток миксобактериями и аэромонадами (более подробные схемы опытов см. в разделе Результаты исследований). Общим контролем для всех опытов являлись незараженные мальки (сеголетки) русского и сибирского осетров.

Во всех опытах проводили клинические наблюдения и учет гибели рыб, патологоанатомическое вскрытие, гистологические и вирусологические, а также выборочно гематологические и бактериологические исследования рыб общепринятыми методами (Таблица 1). В целом, длительность наблюдений в опытах составила 85 суток.

Для экспериментального заражения рыб использовали герпесвирус SbSHV (изолят SK/1114). Мальков опытных групп заражали методом ванн путем выдерживания рыб в водной суспензии вируссодержащей культуры клеток в течение 1 часа с конечной концентрацией вируса в воде 10⁴ ТЦД₅₀/мл. По ходу опытов периодически осуществляли вирусологические исследования патматериала от здоровых и заболевших рыб. В качестве патматериала в основном использовали отрезанные стерильно кусочки грудных или брюшных плавников. Отбор проб проводили перед заражением вирусом, в период проведения опытов — от свеже погибших и вынужденно убитых рыб с явно выраженными признаками болезни и в конце опытов от оставшихся живых мальков. Погибших рыб исследовали индивидуально, а от вынужденно убитых готовили смешанные пробы минимум от 3-х экз. Для выделения герпесвируса применяли культуры клеток SSO-2 иWSS-2, идентификацию вируса проводили в реакции нейтрализации. Зараженные клеточные линии инкубировали в охлаждающем термостате при температуре 15°С с повышенным содержанием углекислого газа. На вышеуказанных линиях клеток было проведено от одного до трех пассажей каждого материала продолжительностью 9-15 суток. Титр вируса определяли в каждом материале с развитым цитопатическим эффектом и рассчитывали по методу Рида и Менча. Всего исследовано вирусологически 127 экз. сибирского осетра и 76 экз. русского осетра.

Патологоанатомическому вскрытию подвергали контрольных, заболевших и погибших мальков, для гистологических исследований вынужденно убитых и свежепогибших рыб фиксировали целиком в забуференном 10%-ном растворе формалина.

Гематологические исследования проводили в динамике при экспериментальной вирусной инфекции сибирского и русского осетров (опыты1,2) и в опыте 3 по испытанию профилактической эффективности витамина С. Исследования во всех опытах были проведены через 4 дня после заражения рыб (в инкубационный период), а в опыте 1 с русским осетром повторно через 11 дней после заражения (в период клинического проявления болезни).

В каждом случае пробы крови отбирали у 6 экз., всего исследованиям подвергнуты 48 рыб. Кровь исследовали общепринятыми методами [1,2] по следующим показателям:

уровень гемоглобина – цианметгемоглобиновым фотометрическим методом на фотоколориметре КФК-2МП;

число эритроцитов – пробирочным методом с подсчетом в камере Горяева;

расчет содержания гемоглобина в эритроците по формуле Гительсона и Терского;

количество лейкоцитов;

лейкоцитарную формулу;

процентное соотношение незрелых форм эритроцитов на мазках крови;

абсолютное количество лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов.

Опыт 3 по определению профилактической эффективности витамина С поставили в 2-вариантах:

1-й вариант –кормление рыб без применения витамина С:

контроль 1- рыбы не зараженные герпесвирусом (30 экз.)

опыт 1 –рыбы, зараженные герпесвирусом (37 экз.)

2-й вариант – кормление рыб с добавкой витамина С:

контроль 2 – рыбы, не зараженные герпесвирусом (30 экз.);

опыт 2 – рыбы, зараженные герпесвирусом(30экз.).

В обоих вариантах опыта рыб кормили осетровым комбикормом марки ЛимКорм (помол № 1,5 мм) 2 раза в сутки, дозировали по поедаемости корма рыбами. Во 2-м варианте опыта в корм добавляли витамин С из расчета 1 г витамина на 1 кг комбикорма. В опыте 2 (вариант 2) рыб кормили витаминным кормом в течение 7 дней до заражения вирусом и 3-х дней после заражения, затем скармливали обычный корм. Рыбам в контроле 2 аналогичный корм задавали по той же схеме, но герпесвирусом не заражали. Клинические наблюдения, вирусологические, патоморфоогические и гематологические исследования проводили по той же схеме, что и в опытах 1,2.

Опыт 4 по заражению рыб миксобактериями и аэромонадами проведен на тех жемальках сибирского осетра, подрощенных домассы 15-20 г, в 2-х вариантах. В первом варианте эксперимента провели заражение рыб (20экз.): в одной группе миксобактериями и во второй бактериями Aeromonas veronia методом ванн.

В первом варианте эксперимента провели заражение рыб (20экз.) миксобактериями. В воде опытного аквариума создали концентрацию клеток миксобактерий 10000 КОЕ/мл. Затем в аквариум для заражения посадили 20 мальков осетра, которых выдерживали 2 часа при аэрации воды. После заражения рыб была включена проточность воды и продолжалось ежедневное наблюдение в течение 15 дней. Второй опыт провели таким же методом, но рыб (20экз.) заражали смесью вирулентных аэромонад с зонами деполимеризации ДНК 11,0; 8,0 и 9,0 мм.

Во втором варианте смесь вирулентных штаммов аэромонады вводили рыбам внутримышечно в дозе 0,1 мл. Посевы с паренхиматозных органов зараженных рыб с целью реизоляции использованных в опытах культур проводили на среды: эритритагар для определения уровня общей бактериальной контаминации; Эндо – выявления энтеробактерий, в т.ч. аэромонад, неферментирующих щелочеобразователей (моракселл, ацинетобактера); Сабуро – выявления грибковой флоры и миксобактерий; энтерококкагар – выявления стрептококков.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Excel с определением достоверностей между группами (при уровне достоверности 95%).

Таблица 1 – Объем исследований

Виды рыб и методы исследований	Количество рыб/проб
Количество рыб в опытах:	203
– сибирский осётр	150
– русский осётр	53
Виды исследований:
– клинические	203
– гематологические	48
– патологоанатомические	128
– гистологические	60
– вирусологические	203 (проб)
– бактериологические	20 (проб)

2 Результаты исследований и их обсуждение

2.1 Опыт 1. Заражение герпесвирусом мальков русского осетра

Опыт поставлен на мальках русского осетра (33 экз.) возрастом около 1 месяца средней массой 8 г, доставленных автотранспортом из Краснодарского края (около 1200км).

Течение, симптомы и патологоанатомические изменения у подопытных мальков.

Обобщенные данные о сроках проявления инфекции, динамике развития клинических признаков и гибели рыб представлены в таблицах 2, 3. Из таблицы 2 видно, что инкубационный период длился 8 суток, стадия явного проявления болезни – 10 суток, и общая продолжительность инфекционного процесса составила 18 суток. Гибель рыб началась через 10 дней, постепенно нарастала и достигла 97 % (таблица 3).

Таблица 2 – Динамика развития клинических признаков болезни у мальков русского осетра

Количество дней после заражения	Клинические признаки
8	Вялость, апатия, отказ от корма, энофтальм, бледные пятна на коже
10-12	Геморрагии, некротический распад кончиков плавников, увеличенное брюшко, воспаление прямой кишки
11-18	Нарушение координации движения, адинамия

Таблица 3 – Кумулятивная гибель заболевших мальков, n = 33

Количество дней с момента заражения	8	10-12	13	14	14-18
Кумулятивная гибель, экз/%	–	12/36	14/42	22/67	31/97

Симптомы болезни вначале выражались замедлением движения, апатией, отказом рыб от корма, появлением бледных пятен на кожном покрове. В дальнейшем у части рыб, преимущественно в области хвостового стебля, возникали пятнистые геморрагии, очаги некротического распада кончиков плавников, воспаление и выпячивание прямой кишки, развивался энофтальм (Рисунок 1, 2).

Рисунок 1 – Геморрагии в области хвостового стебля (увеличено)

Рисунок 2 – Воспаление, выпячивание прямой кишки (увеличено)

В терминальной стадии болезни рыбы держались на дне, плавали на боку, периоды неподвижности чередовались с резкими хаотичными движениями. Отдельные особи опускались на дно аквариума и принимали позу «стояния» на грудных плавниках (рисунок 3).

А	Б

Рисунок 3 – Положение вверх брюшком (А), «опора» на грудные плавники (Б), энофтальм.

У рыб контрольных рыб вышеописанные симптомы не проявлялись (рисунок 4).

Рисунок 4 – Малёк русского осетра из контрольной группы (увеличено)

2.1.1 Результаты вирусологических исследований

При вирусологическом исследовании от заболевших рыб выделен исходный вирус. Признаки ЦПД в культурах клеток SSO-2 и WSS-2 выявлялись в 1 пассаже после инокуляции всех проб патологического материала. ЦПД проявлялось округлением и отслоением клеток монослоя.

2.1.2 Результаты гематологического анализа

В инкубационный период у рыб зараженной группы по сравнению с контрольными рыбами выявлено снижение количества эритроцитов на 14,9%. Изменения уровня гемоглобина не отмечены

В лейкоцитарной картине крови рыб опытной группы выявлено снижение общего количества лейкоцитов относительно контрольной группы рыб на 18,7 (с 14,81 до 12,03 тыс./мкл). В лейкоцитарной формуле у подопытных рыб отмечено: незначительное снижение процента нейтрофилов на 14,9% при параллельном повышении процента молодых нейтрофилов (миелоцитов и др.) и лимфоцитов на 18,9%, значительное увеличение моноцитов и эозинофилов (в 2-3 раза), а также появление в крови плазматических клеток (0,67%). Такая же картина прослеживается при пересчете лейкоцитарных клеток в абсолютные значения.

В период явного проявления признаков заболевания у опытной группы рыб (через 11 дней после заражения) показатели красной крови имели аналогичную динамику: снижение количества эритроцитов на 10,0% при увеличении концентрации гемоглобина в эритроцитах на 5% (таблица 4).

Таблица 4 – Гематологические показатели русского осетра при заражении герпесвирусом

Показатели крови	Группы
	Контроль	Опыт
Гемоглобин, г/л	26,80±0,26	26,06 ±1,01
Эритроциты, 1012/л	0,456,25±44,98	0,417,5 ±113,52- 10%
СГЭ, пг	58,98±5,95	62,28±9,43+5,%%
Всего молодых эритроцитов, %	29,66±3,53	26,68 ±4,84
Лейкоциты, тыс./мкл	26,91±7,26	13,85±6,81 -48,5%
Нейтрофилы, %	18,5±8,5	32,5±14,5 +75,6%
Моноциты, %	2,60±2,4	18,5±10,5+ 7 раз
Лимфоциты, %	73,00±7,52	53,67 ±12,0-26,5%

Наиболее значимые изменения выявлены в лейкоцитарном профиле крови. Общее количество лейкоцитов снизилось в среднем на 48,5% с разбросом колебаний снижения от22,6% до 3-х кратного (от 20,83 ±1,40 до 6,73 ±1,30 тыс./мкл). В лейкоцитарной формуле выявлено увеличение общего процента нейтрофилов на 75,6% (при сдвиге формулы влево) и моноцитов – в 7 раз, снижение лимфоцитов на 26,5% и повышение в крови плазматических клеток до 1,67 % (рисунок 5).

В мазках крови также обнаруживали моноциты и макрофаги с фагоцитированными частицами (рисунок 6). В нейтрофилах цитоплазма окрашивалась в голубовато-синеватый цвет с токсической зернистостью, что свидетельствует о дефекте нейтрофилов, связанном с патогенным действием вируса, снижающим их фагоцитарную активность. В целом, картина крови характерна для острого течения инфекционного процесса; появление плазматических клеток свидетельствует об активизации иммунологических реакций и синтеза антител.

А	Б

Рисунок 5 – Нейтрофилы (А) и плазматическая клетка (Б) в крови у зараженных рыб

А	Б

Рисунок 6 – Моноцит (А) и макрофаг (Б) с фагоцитированными частицами

2.1.3 Патоморфологические изменения

Патологоанатомические изменения выражались в следующем: на наружных покровах обнаруживались в основном точечные и пятнистые кровоизлияния в основании жучек, на коже хвостового стебля и брюшка, некротический распад кончиков плавников, покраснение и выпячивание кишечника. При вскрытии печень бледная серо-белого цвета, размягчена, селезенка с бледными пятнами на поверхности, кишечник без кормовых масс, заполнен густой слизью, слизистая оболочка пятнисто гиперемирована (рисунок 7).

Рисунок 7 – Русский осетр. Печень увеличена, бледная, пятнистая (увеличено)

2.1.4. Гистологические изменения

У больных мальков микроструктурные изменения кожи проявлялись в виде некроза и распада слизистых клеток, десквамации эпидермиса в области жучек (рисунок 8).

А	Б

Рисунок 8 – Кожа. Некроз (А) и слущивание эпидермиса (Б). Ок.10, об. х20. Окраска гематоксилин-эозин (Г.Э.)

В печени четко выражена жировая и гидропическая дистрофия, некроз гепатоцитов, проявляющийся в виде маргинации хроматина, кариопикноза, деформации клеток и дискомплексации печёночных балок (рисунок 9, 10). В почках наблюдали экссудативный гломерулонефрит, проявлявшийся скоплением зернистого детрита (экссудата) в капсуле клубочков и в просвете канальцев, в большинстве канальцев – выраженный некротический некроз (некронефроз), выражающийся кариопикнозом и некрозом эпителия, деформацией канальцев,в эпителии отдельных канальцев гиалиново- капельная дистрофия, (рисунок 11,12).

А	Б

Рисунок 9 – Печень: вакуольная дистрофия (А – об. х10) и кариопикноз в гепатоцитах (Б – об. х40) Г.Э.

А	Б

Рисунок 10 – Печень. Некроз гепатоцитов (А – об. х90), Г.-Э. Жировая и гидропическая дистрофия гепатоцитов (Б – об. х40 окраска Судан III).

А	Б

Рисунок 11 – Почки. Экссудативный гломерулонефрит-скопление экссудата в капсуле клубочка и канальцев, некронефроз. А – об. х10; Б – об. х40.Г.Э

А	Б

Рисунок 12 – Почки. Некронефроз: дистрофия и некроз эпителия момевых канальцев, деформация канальцев, скопление детрита в их просвете, некроз эпителия. А – об. х40; Б – об. х100. Г.Э.

В селезёнке отмечалась гиперплазия лимфоидной ткани, повышенная концентрация лимфоидных и ретикуло-гистиоцитарных клеток, что является проявлением плазмоцитарной реакции (рисунок 13).

А	Б

Рисунок 13 – Селезенка. Гиперплазия лимфоидной ткани, очаговая инфильтрация пульпы плазмоцитами и др.лимфоидными клетками. А –об. х10; Б – об. х40. Г.Э.

В заднем отделе кишечника – спиральной кишке выраженный десквамативный катар, сопровождающийся обширной десквамацией и распадом покровного эпителия слизистой оболочки (рисунок 14).

Рисунок 14 – Спиральная кишка: десквамативный катар, распад покровного эпителия. Об. х4. Г.Э.

2.1.5 Заключение по результатам опыта 1.

Полученные нами результаты показывают, что мальки русского осетра обладают довольно высокой чувствительностью к герпесвирусу сибирского осетра. От заболевших рыб исходный герпесвирус выделен в первом пассаже, что свидетельствует о его высокой вирулентности для русского осетра. Это можно объяснить не только видовыми особенностями, но и ослаблением организма подопытных мальков в результате слишком длительной транспортировки – транспортного стресса.

Герпесвирусная инфекция мальков русского осетра отличается острым течением, высокой летальностью, проявляется тяжелыми патоморфологическими изменениями. Из них наиболее характерны дистрофические и некротические изменения в кожном покрове и печени, экссудативный гломерулонефрит и некроз эпителия почечных канальцев, катаральное воспаление в спиральной кишке, а также четко выраженная гиперплазия лимфоидной ткани в селезенке и изменения лейкограммы в сторону преобладания фагоцитирующих форм – нейтрофилов, моноцитов, плазмобластов, лимфоидных и плазматических клеток. Вышеуказанные результаты: эпизоотологические данные, клинические и патоморфологические изменения следует использовать для установления предварительного диагноза болезни у русского осетра, постановки биопробы и разработки профилактических мероприятий.

2.2 Опыт 2. Заражение герпесвирусом мальков сибирского осетра

Опыт поставлен на мальках сибирского осетра (67 экз., в т.ч. контроль 30 и опыт 37 экз.) возрастом около 1 месяца, средней массой 8 г, доставленных автотранспортом из Вологодской обл., (г. Череповец, около 350 км). Перед постановкой опыта у них обнаружено вирусоносительство: герпесвирус выделен из смешанной пробы органов мальков в 3-м пассаже. Однако, в дальнейшем при исследовании контрольных рыб в данном опыте герпесвирус у них больше не выделялся.

Течение, симптомы и патолого-морфологические изменения у подопытных мальков.

Обобщенные данные о сроках проявления инфекции, динамике развития клинических признаков и гибели рыб представлены в таблице 5,6.

Таблица 5 – Динамика развития клинических признаков болезни у мальков сибирского осетра

Количество дней после заражения	Клинические признаки
11	Вялость, гиподинапмия, отказ от корма, энофтальм, бледные пятна на коже
12 -23	Нарушение координации движения, плавание на боку адинамия, бледные пятна на коже, покраснения в области рострума и ануса
33 -51	Распад кончиков плавников, мелкие язвочки, очаги сапролегниоза, воспаление прямой кишки

Таблица 6 – Кумулятивная гибель заболевших мальков, n = 37

Количество дней с момента заражения	23	27	36	45	51
Кумулятивная гибель, экз/%	1/2,7	6/16,2	22/59,4	29/78,3	37/100

Из таблицы 5 видно, что инкубационный период длился 11 суток: у отдельных рыб появились неспецифические симптомы: угнетение, отказ от корма, ослабление реакций, белые пятна на поверхности тела. Гибель мальков (таблица 6) началась на 23 сутки после заражения, постепенно усиливалась и на 51 сутки достигла 100%. Рыбы погибали с признаками язвенных поражений кожи, осложненных сапролегниозом, очагового некротического распада плавников, энофтальма. У небольшой части подопытных рыб болезнь протекала со слабо выраженными симптомами или бессимптомно.

При вирусологическом исследовании патологического материала, взятого от вынужденно убитых рыб в инкубационном периоде (на 4 сутки, после заражения), вирус был выделен у 30% рыб в титре 10^4,35 ТЦД₅₀/г ткани. В период явного проявления болезни (на 23-51 сутки после заражения), от всех погибших рыб вирус выделялся в более высоких титрах (10^3,85-10^5,1 ТЦД₅₀/г ткани).

2.2.1 Результаты гематологических исследований.

Как видно из таблицы 7, у подопытных рыб относительно контроля, отмечено снижение уровня гемоглобина на 13% и увеличение количества эритроцитов на 25,6%, с параллельным снижением концентрации гемоглобина в эритроцитах (СГЭ).

Таблица 7 – Показатели крови сибирского осетра при заражении герпесвирусом

Показатели крови	Группы
	Контроль	Опыт
Гемоглобин, г/л	21,59±6,55	18,78±3,87
Эритроциты, 1012/л	0,321±97,94	0,402±78,47+25,6%
СГЭ, пг	67,89±9,11	45,41±10,95
Всего молодых эритроцитов, %	28,15±7,57	18,4±6,4-34,6%
Лейкоциты, тыс./мкл	16,34 ±7,78	19,54±1,32+19,6%
Нейтрофилы, %	21,50 ±7,5	28,5±14,5+32,5%
Моноциты, %	4,50±1,5	0,67±0,5-86,2%
Лимфоциты, %	70,0±9,0	70,6±12,4

В лейкоцитарной формуле количество лейкоцитов увеличено на 19,6 %, нейтрофилов – на 32,5% и значительно снижен процент моноцитов. Эти данные указывают на то, что герпесвирус вызывает лейкоцитоз и нейтрофилию, но несколько угнетает фагоцитарную активность свободных макрофагов – моноцитов. Однако при гистологическом исследовании отмечена значительная гиперплазия лимфоидной ткани селезенки, что указывает на активизацию тканевых фагоцитарных элементов ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) – гистиоцитов, лимфоидных клеток и др.

2.2.2 Результаты патоморфологических исследований.

Патологоанатомические изменения проявлялись примерно так же, но менее ярко выражены, чем у русского осетра. На наружных покровах обнаруживались в основном точечные кровоизлияния на коже в основании жучек и на нижней поверхности брюшка, очаговый распад кончиков плавников, покраснение и выпячивание ануса. Печень бледная серо-белого цвета, размягчена, селезенка с бледными пятнами на поверхности, задний отдел кишечника заполнен густой слизью, слизистая оболочка пятнисто гиперемирована.

2.2.3 Гистологические изменения.

Микроструктурные изменения в кожном покрове и во внутренних органах больных мальков по своему характеру были такими же, как у русского осетра, но несколько отличались по глубине и тяжести проявления. На коже они проявлялись в виде очагового некроза и десквамации эпидермиса в области жучек (рисунок 8). В печени четко выражена жировая и гидропическая дистрофия, очаговый некроз гепатоцитов, проявляющиеся сильно выраженной вакуолизацией цитоплазмы гепатоцитов, кариопикнозом, деформацией клеток и дискомплексацией печёночных балок (рисунок 15, 16). В почках наблюдали экссудативный гломерулонефрит, проявлявшийся скоплением экссудата в полости капсулы клубочков ив просвете канальцев, в отдельных канальцах гиалиново капельная дистрофия эпителия, в остальных некротический нефроз-кариопикноз и некроз эпителия (рисунок 17). В селезёнке и эпикарде сердца отмечалась крупноочаговая гиперплазия лимфоидной ткани, повышенная концентрация лимфоидных и ретикуло-гистиоцитарных клеток, что является проявлением плазмоцитарной реакции (рисунок 18). В заднем отделе кишечника – спиральной кишке выраженный десквамативный катар, сопровождающийся обширной десквамацией и распадом покровного эпителия слизистой оболочки, как и в опыте 1 (рисунок 14).

А	Б

Рисунок15 – Печень малька контрольной группы: А – об. х10 Б – об. х40. Г.Э.

А	Б

Рисунок16 – Печень заболевших рыб: очаговая гидропическая дистрофия и некроз печеночных клеток, деструкция паренхимы. А об. х10, Б об. х40. Г.Э.

А	Б

Рисунок17 – Почки: экссудативнй гломерулонефрит (А) и некронефроз канальцев (А, Б). Об. х40. Г.Э.

А	Б

Рисунок 18 – селезенка (А): очаговая гиперплазия лимфоидной ткани, сердце (Б): гиперплазия и частичное запустение лимфоидных узелков в эпикарде. Об. х10. Г.Э.

2.2.4 Заключение по опыту 2

По результатам опыта видно, что мальки сибирского осетра оказались более устойчивыми к заражению герпесвирусом, чем мальки русского осетра: инкубационный период был более длительный, симптомы болезни и гибель появились позже (через 11-23 дня) и продолжались намного дольше (с 23 по 51 день, а в опыте 1- с 8 по 18 день). У русского осетра болезнь проявлялась более выраженными некротическими изменениями в печени и почках, а также снижением количества лейкоцитов и существенными изменениями в лейкограмме, указывающими на усиление фагоцитарной активности клеток крови и РЭС. Это свидетельствует о более тяжелом течении болезни у русского осетра, которое может быть связано, с одной стороны, с ослаблением резистентности организма рыб в результате более длительной транспортировки (на расстояние около 1100 км) по сравнению с перевозкой сибирского осетра на расстояние 350 км., и другой – сего видовыми особенностями. Отсюда вытекает вывод о том, что для профилактики болезни следует избегать длительные перевозки молоди осетров на дальние расстояния.

2.3 Опыт 3. определение профилактической эффективности витамина C

Опыт поставлен на мальках сибирского осетра массой 6-7 г из того же хозяйства. Для оценки профилактической эффективности витамина С сопоставлены результаты опытов, поставленных в двух вариантах -в опыте без применения витамина С (1 вариант) и в специальном опыте с добавлением в корм Витамина С (2 вариант), которые обозначены в таблице 8 следующим образом:

1-ый вариант – кормление рыб без применения витамина С:

контроль 1 – рыбы не зараженные герпесвирусом;

опыт 1 – рыбы, зараженные герпесвирусом.

2-ой вариант – кормление рыб с добавлением витамина С:

контроль 2 – рыбы, не зараженные герпесвирусом (30 экз.);

опыт 2 – рыбы, зараженные герпесвирусом (30 экз.).

В обоих вариантах опыта рыб кормили осетровым комбикормом марки Лимкорм (помол № 1,5 мм) два раза в сутки, дозировали по поедаемости корма рыбами. Дозу витамина С для второго варианта эксперимента брали из расчета 1 г витамина на 1 кг корма. Необходимое количество витамина С растворяли в небольшом объеме воды и опрыскивали этим раствором навеску корма, рассчитанную на одни сутки. Затем подсушивали при комнатной температуре и скармливали рыбам. Каждый день готовили свежую порцию корма с витамином.

Витаминным кормом рыб кормили в течение 7 дней до заражения и 3-х дней после заражения герпесвирусом, затем скармливали обычный корм. Таким образом, курс кормления витамином С составил 10 дней. Рыбам в контроле 2 аналогичный корм задавали по той же схеме, но герпесвирусом не заражали.

Каждая группа рыб размещалась в отдельном аквариуме объемом 70 л. Опыт ставили на проточной артезианской воде при температуре 15-17^оС. Для заражения рыб использовали изолят герпесвируса SK/1114. Рыб заражали методом ванн в течение 1 часа с конечной концентрацией вируса в воде 10⁴ ТЦД₅₀/мл. В течение всего опыта длительностью 60 дней вели ежедневные клинические наблюдения и учёт гибели рыб.

Патологический материал для вирусологических и гистологических исследований отбирали на 4-е сутки после заражения, а также в период явного проявления болезни от погибающих и свежее погибших рыб.

Гематологические исследования во всех группах проведены через 4 дня после заражения рыб.

При сравнении результатов 1 и 2 вариантов опыта установлено, что витамин С оказал определенный профилактический эффект – способствовал повышению устойчивости рыб к заражению герпесвирусом.

Так, в опыте 1 (1-ый вариант) гибель зараженных герпесвирусом мальков, не получавших витамин C, началась на 23 сутки после заражения и на 51 сутки достигла 100%. При вирусологическом исследовании патологического материала в конце опыта (23-51 сутки) герпесвирус выделен от всех рыб в высоких титрах 10^3,85-10^5,1 ТЦД₅₀/г ткани.

В опыте 2 (2-ой вариант) у мальков сибирского осетра, получавших с кормом витамин С и потом зараженных герпесвирусом, на 29 сутки после заражения погибло 2 малька, что составило 6,6%. При вирусологическом исследовании от обеих погибших рыб выделен исходный вирус в титрах 10^5,8-10^6,1 ТЦД₅₀/г ткани. Через 11 суток после заражения у части подопытных рыб отмечали признаки угнетения и снижение аппетита, впоследствии у них появились бледные пятна на поверхности тела и плавниках, однако данные симптомы проявлялись в меньшей степени, чем у рыб, не получавших витамин С.

Спустя 34 – 35 суток после заражения у подопытных мальков было отмечено улучшение аппетита, они стали более подвижными, бледных пятен стало меньше и на 60 сутки после заражения они остались только у 5 рыб (16,6%). Однако больные рыбы данной группы сильно отставали в росте по сравнению с рыбами контрольных групп. На 60 сутки после заражения средняя масса мальков в опыте (2 вариант) была в 2 раза меньше средней массы рыб контрольных групп.

При вирусологическом исследовании патологического материала, отобранного у рыб спустя 60 суток после заражения, вирус был выделен только у рыб с клиническими проявлениями болезни (16,6%) в титре10^4,35-10^4,85 ТЦД₅₀/г ткани. У остальных рыб вирус не был выделен на протяжении 4-х слепых пассажей, что говорит либо о носительстве вируса ниже порога детектирования (титр менее 10^2,6 ТЦД₅₀/г ткани), либо о его полной элиминации из организма.

Результаты гематологических исследований подопытных и контрольных рыб представлены в таблице 8.

Таблица 8 – Гематологические показатели у мальков сибирского осетра при применению витамина С

Показатели крови	Вариант 1		Вариант 2 (с витамином С)
	Контроль 1	Опыт 1 (зараженные)	Контроль 2	Опыт 2 (зараженные)
Гемоглобин, г/л	21,59±6,55	18,78±3,87	23,57±4,27	19,88±4,98
Эритроциты, 1012/л	0,321±0,097	0,402±0,078	0,367±0,068	0,411±0,039
СГЭ, пг	67,89±9,11	45,41±10,95	64,40±4,15	49,10±13,79
Всего молодых эритроцитов, %	28,15±7,57	18,4±6,4	31,55±0,92	27,4±4,2
Лейкоциты, тыс./мкл	16,34±7,78	19,5±1,32	11,77±0,11	33,09±6,05*Н
Нейтрофилы, %	21,50±6,5	26,67 ±14,5	23,00±2,83	39,50±12,5+71,1%
Моноциты, %	4,50±1,5	0,67 ±0,5	1,0 ±0,8	3,0 ±2,0
Лимфоциты, %	70,0±9,0	70,67 ±12,4	74,5±2,12	62,00 ±9,0

В опыте 1 (1-ый вариант), относительно контроля 1, отмечено снижение уровня гемоглобина на 13% и увеличение количества эритроцитов на 9,5%, с параллельным снижением концентрации гемоглобина в эритроцитах (СГЭ). В лейкоцитарной формуле количество лейкоцитов увеличено на 20 %, нейтрофилов – на 24%

Во втором варианте опытов у мальков сибирского осетра, которым скармливали витамин С, показатели количества эритроцитов и гемоглобина сходны с таковыми рыб, получавших корм без витамина С. В лейкоцитарной формуле у заражённых рыб (опыт 2) в сравнении с контролем 2 выявлено значительное увеличение общего количества лейкоцитов (в 3 раза), нейтрофилов на 69,8 %, моноцитов в 3 раза. Это указывает на значительную активизацию гемопоэза и фагоцитарной активности разных групп лейкоцитов.

Заключение по опыту 3

Результаты исследований показали, что витамин С в испытанной дозировке оказал профилактический эффект против герпесвирусной болезни.

Профилактический эффект выражался ослаблением клинического течения и низкой смертностью рыб, а также повышением общей резистентности и иммунологической реактивности организма подопытных рыб, о чём свидетельствует активная выработка фагоцитирующих клеток крови (моноцитов, нейтрофилов) у зараженных рыб.

Полученные результаты могут быть использованы для обоснования практического использования витамина С для профилактики герпесвирусной болезни осетровых рыб, а также для разработки методов его применения.

2.4 Опыт 4. Определение патогенности миксобактерий и аэромонад для сеголеток осетровых рыб

Опыт проведен на тех же мальках сибирского осетра, подрощенных до средней массы 15г (сеголетки), в 2-х вариантах.

В первом варианте эксперимента провели заражение рыб: в одной группе миксобактериямии во второй аэромонадами методом ванн.

В первой группе заражение рыб проводили музейными культурами миксобактерий (флексибактерий), выделенных ранее из воды стоячего водоема. Культуру для заражения выращивали на среде Сабуро из 3-х колоний. В воде опытного аквариума с температурой 17°С создали концентрацию клеток миксобактерий 10000 КОЕ/мл. Затем в аквариум для заражения посадили 20 сеголеток сибирского осетра, которых выдерживали 2 часа при аэрации воды. После процедуры заражения рыб аквариум заполнен чистой водой, включена проточность воды и продолжалось ежедневное наблюдение в течение 15 дней. В течение этого срока у подопытных рыб не обнаружено признаков заболевания и отсутствовала гибель.

Во второй группе при проведении аналогичного опыта с использованием аэромонад (A. veronia) подопытные рыбы также не заболели. Полученные результаты обеих биопроб показали, что испытанные культуры миксобактерий и аэромонад при перкутанном заражении рыб через воду оказались авирулентными и не вызвали заболевание молоди сибирского осетра.

Во втором варианте подопытных рыб заражали вирулентным штаммом аэромонад (A. veronia) внутримышечно в дозе 0,1 мл. В данном случае через 2-3 дня после заражения все подопытные рыбы заболели и погибли. При бактериологическом исследовании от них выделена исходная культура аэромонад. По результатам патогистологических исследований у них установлены характерные признаки септицемии: обширные дистрофические и некротические изменения: в печени тотальная гидропическая дистрофия и некроз гепатоцитов; в почках экссудативнй гломерулонефрит, некротический нефроз и распад гемопоэтической ткани; в селезенке – гиперплазия лимфоидной ткани, массивная инфильтрация паренхимы лейкоцитами, их распад; воспалительные поражения жабр, скелетной мускулатуры и др. (рисунок 19, 20, 21, 22).

А	Б

Рисунок 19 – Печень: тотальная гидропическая дистрофия и некроз паренхимы. А – об. х10, Б – об. х40. Г.Э.

А	Б

Рисунок 20 – Почки: экссудативный гломерулонефрит, некронефроз, резкое уменьшение гемопоэтической ткани (А – об. х10); некронефроз канальцев, распад клеток гемопоэтической ткани (Б – об. х40). Г.Э.

А	Б

Рисунок 21 – Почки: слабее выражены гломерулонефрит и дистрофия эпителия мочевых канальцев, резкое уменьшение гемопоэтической ткани. А – об. х10, Б – об. х40. Г.Э.

А	Б

Рисунок 22 – Селезенка. Гиперплазия лимфоидной ткани, тотальная инфильтрация пульпы лейкоцитами, лимфоидными клетками, плазмоцитами и другими элементами РЭС. (А – об. х10), клетки инфильтрата: эозинофильные гранулоциты, лимфоциты, гистиоциты, многие из них в состоянии распада (Б – об. х40). Г.Э.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований получены новые данные о возрастной восприимчивости к заражению герпесвирусом осетров на ранней стадии развития, подробно изучены особенности течения и проявления герпесвирусной болезни, выявлены наиболее характерные клинические признаки, гематологические показатели и патолого-морфологические изменения, рекомендуемые для использования при диагностике заболевания. На основе комплексного анализа вышеуказанных результатов и материалов предыдущих исследований нами сделаны следующие выводы.

1. Впервые установлено, что мальки русского и сибирского осетра возрастом до 1-го месяца массой 5-6 г, как и сеголетки 2-6-и месячного возраста, чувствительны к герпесвирусной болезни, их можно использовать в качестве тест — объектов для постановки биопроб при диагностике заболевания.

2. Мальки русского осетра оказались чувствительны к заражению герпесвирусом, заболевание у них протекало тяжело и сопровождалось гибелью в короткие сроки. Это можно объяснить не только видовыми особенностями, но и ослаблением организма подопытных мальков в результате более длительной транспортировки – транспортного стресса.

3. Заболевание проявлялось комплексом клинических признаков и патолого-морфологических изменений. Из них наиболее выражены: точечные или пятнистые кровоизлияния, очаговый некроз эпидермиса на разных участках кожного покрова; дистрофические и некротические поражения в паренхиме печени; экссудативный гломерулонефрит и некротический нефроз в почках; катаральный энтерит в спиральной кишке; гиперплазия лимфоидной ткани в селезенке и сердце, а также изменения лейкограммы в сторону увеличения процента нейтрофилов, моноцитов, лимфоидных и плазматических клеток.

4. В целом проведённые исследования показывают, что клинико-анатомическая картина при герпесвирусной болезни достаточно характерна. Она вызывает существенные патологические изменения не только в кожных покровах, но и во внутренних органах, то есть имеет генерализованный характер, что подтверждается данными вирусологических исследований.

5. В связи с частым осложнением флексибактериозом, сапролегниозоми другими инфекциями (аэромонозом, псевдомонозом) герпесвирусная болезнь может затушевываться симптомами данных заболеваний [3]. В поставленном нами опыте 4 установлены возможные условия и пути заражения рыб этими бактериями и проявление аэромоноза у молоди осетровых. Отрицательные результаты заражения рыб этими бактериями перкутанно через воду и острое проявление септицемии при внутримышечном заражении аэромонадами косвенно указывает на то, что основной причиной осложнения герпесвирусной болезни этими инфекциями является повреждение вирусом целостности кожного покрова и тем самым открытие ворот для проникновения условно патогенной микрофлоры.

6. Диагностику герпесвирусной болезни следует проводить комплексно на основании анализа эпизоотологических данных, клинических признаков и патолого-морфологических изменений. Окончательный и дифференциальный диагноз должен подтверждаться данными лабораторных исследований (вирусологических, бактериологических и др.). Выделение и идентификацию вируса следует проводить на чувствительных культурах клеток (SSO-2, WSS-2), полученных из тканей осетровых рыб.

7. В опыте 3 по изысканию методов профилактики герпесвирусной болезни показано, что применение витамина С в дозе 1г на кг корма в течение 10 дней снижает заболеваемость и гибель рыб от данной болезни. т.е. оказывает профилактический эффект.

Выводы и практические предложения нашли отражение в научных статьях и изданиях:

1. «Методические указания по диагностике и профилактике герпесвирусной болезни и вторичных инфекций молоди осетровых рыб. (Рассмотрены и одобрены на заседании Научно-технического совета ФГОУ ВО МГАВМиБ – МВА им. К.И. Скрябина 10 декабря 2019 г., протокол № 8)
2. Подготовлена и опубликована лекция для студентов ветеринарного факультета и ИПК: Грищенко Л.И., Елее Э.Л. Герпесвирусные болезни рыб: распространение, течение, диагностика и профилактика // Российский ветеринарный журнал. СХЖ. – 2018.- №1. – С. 22-28
3. Елеев Э.Л., Грищенко Л.И. и др. Патоморфологические изменения у мальков русского осетра при экспериментальной герпесвирусной болезни // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. – 2019. — № 10. – с.16-22.
4. Елеев Э.Л., Грищенко Л.И. и др. Применение витамина С для профилактики герпесвирусной болезни мальков сибирского осетра // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. – 2019.- №12. – с. 6-10.
5. Елеев Э.Л., Грищенко Л.И, Щелкунова Ю.П., Головин П.П. Течение герпесвирусной болезни русского осетра, вызванной герпесвирусом сибирского осетра // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии. Сб. научн. трудов междунар. учебно-методич. и научно-практич. конф., посвященной 100 летию со дня основания ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА им. К.И.Скрябина. – М.: 2019. – С. 110 – 112.
6. Елеев Э.Л., Грищенко Л.И., Жукова К.А. Особенности течения, симптомы и патогистологические изменения, вызванные герпесвирусом сибирского осетра SBSHV, штаммом SR1/0406 и изолятом SIZ6/0311 // Состояние и пути развития аквакультуры в Российской Федерации. Труды IV Национальной научно-практич. конф. – г. Калининград: 2019. – С.88 — 94

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Головин П.П., Головина Н.А., Романова Н.Н., Корабельникова О.В. Испытание в аквакультуре биологически активных препаратов, повышающих иммунофизиологический статус рыб // Рыбное хозяйство. – 2008. — № 4. – С. 63-66.

Головин П.П., Головина Н.А., Романова Н.Н. Кадастр лечебных препаратов, используемых и апробированных в аквакультуре России и за рубежом. – М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2005. – 56с.

Грищенко Л.И., Гончарова М.Н. Эпизоотология и меры борьбы с флексибактериозами рыб с применением препарата антибак //Материалы междунар. учебно-методич. и науч.-практич. конф. конф. – М.: МГАВМиБ, 2004. Ч.1. – С. 319-322.

Грищенко Л.И., Акбаев М.Ш. Болезни рыб с основами рыбоводства: учебник для вузов. – М.: КолосС, 2013.– 479 с.

Грищенко Л.И., Елеев Э.Л., Заботкина Е.А. Гистологические изменения при герпесвирусной инфекции осетровых рыб // Российский ветеринарный журнал. СХЖ. – 2015. — № 4. – С. 20-21.

Грищенко Л.И., Елеев Э.Л. Герпесвирусные болезни рыб: распространение, течение, диагностика и профилактика // Российский ветеринарный журнал. СХЖ. – 2018.- №1. – С.22-28.

Елеев Э.Л., Грищенко Л.И., Пономарев В.Н., Калабекова Ф.С. Клиниические признаки и патологоанатомические изменения при герпесвирусной инфекции гибрида русского и сибирского осетров // Российский ветеринарный журнал. СХЖ. – 2014. — №1. – С. 19-21.

Елеев Э.Л. Особенности течения герпесвирусной болезни сибирского осетра, вызванной изолятом SIZ6/0311 // Сб. научн.тр. междунар. учебно-методич. и научно-практич. конференции «Актуальные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии». – М.: 2014. – С. 139-141.

Елеев Э.Л., Грищенко Л.И., Заботкина Е.А., Погомарев В.Н. Патоморфологические изменения при герпесвирусной инфекции осетровых рыб // Расширенные материалы 1V Междунар. конф. «Проблемы иммунологии, патологии, охраны здоровья рыб и др.гидробионтов». – Борок-Москва. – 2015. – С. 512-516.

Елеев Э.Л., Грищенко Л.И., Заботкина Е.А. Герпесвирусная инфекция осетровых рыб: патоморфология, патогенез и диагностика болезни // М.: Труды ВНИРО. – 2016. — Т. 162. – С. 116 – 127.

Степанов М.И., Архипов Г.С. Особенности использования витаминов и эссенциальных микроэлементов для лечения и профилактики рецидивов простого герпеса // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 7-2. – С. 456-462. – URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30164 (дата обращения: 25.09.2019).

Щелкунов И.С., Щелкунов Т.И., и др. Герпесвирусная болезнь осетровых рыб в России // Российский ветеринарный журнал СХЖ. – 2007. — №1. – С.10.

Щелкунов А.И., Щелкунов И.С. Герпесвирусная болезнь сибирского осетра // Ветеринария. – 2010. — №1 – С. 18-21.

Hendrick R.P. McDowell T.S., Groff J.M. Isolation of epitheliotropic herpesvirus from white sturgeon Acipenser transmontanus // Dis aqatic organisms. – 1991.-Vol.11. – Р. 49-51.

Нормативные ссылки:

1. Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб, утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России №13-4-2/1054 // Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. – М.: Изд. Отдел маркетинга АМБ-Агро.1999.- Ч. 2. – С. 60-75.
2. Методические рекомендации по диагностике герпесвирусной болезни сибирского осетра, утверждены отделением ветеринарии Россельхозакадемии 04 июня. – 2009 г. – 10 с.
3. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, OIE, (2012-2017).
4. Методические указания по проведению гематологического обследования рыб, утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России №13-4-2/1738 // Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. – М.: Изд. Отдел маркетинга АМБ-Агро. – 1999.- Ч. 2. – С.69-97.
5. Ветеринарно-санитарные правила для рыбоводных хозяйств // Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. — М.: Изд. Отдел маркетинга АМБ-Агро.1998.- Ч. 1. – С.5-14.
6. Ветеринарно-санитарные правила для заводов по разведению осетровых рыб // Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. – М.: Изд. Отдел маркетинга АМБ-Агро. – 1998.- Ч. 1. – С.19-25.
7. Руководство по ветеринарно-санитарному контролю племенных рыбоводных хозяйств, одобрено НТС Минсельхоза России (протокол №11 от 04.07.2017 г.). – М.: ФГБНУ «Росинформагротех». – 2018. – 52 с.