РЕФЕРАТ

Отчет 137 с., 2 части, 31 таблица, 17 рисунков, 85 источников.

БАКТЕРИОФАГ, БАКТЕРИИ, PSEUDOMONAS SYRINGAE, ФИТОПАТОГЕН, БИОПРЕПАРАТ, БИОКОНТРОЛЬ, ИНДИКАЦИЯ, ПОЧВА, СЕМЕННОЙ МАТЕРИАЛ, СВОЙСТВА, ПАРАМЕТРЫ ПРИМЕНЕНИЯ

Объектами исследования являются нативные и искусственно контаминированные бактериями Pseudomonas syringae пробы семенного материала, почвы, воды, растительной продукции. Подбор параметров индикации Pseudomonas syringae проводился с использованием оригинальных гомологичных бактериофагов.

Цель работы – разработать экологически безопасный биологический препарат на основе специфических бактериофагов, который позволит проводить биоконтроль растений на наличие бактерий Pseudomonas syringae на разных стадиях (посевной материал, в период вегетации и при хранении).

В результате исследований:

— сконструирован фаговый биопрепарат на основе наиболее производственно-перспективных фагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae;

— произведен подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов;

— разработана пилотная технология получения экспериментального фагового биопрепарата, позволяющая нарабатывать средство для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae с высоким титром фаговых частиц, включающая многоступенчатую схему контрольно-испытательных мероприятий;

— разработана методология индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции методом постановки реакции нарастания титра фага;

— изучена эффективность применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции; на основании полученных данных определена степень распространения бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства;

— разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю экспериментальной серии фагового биопрепарата и методические рекомендации по его применению для индикации в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Сельскохозяйственным предприятиям предложен новый биопрепарат на основе консорциума 2 бактериофагов Ps.s-7 и Ps.s-27 серии УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae, для индикации фитопатогена в объектах внешней среды и объектах растениеводства и разработана методика его применения.

ВВЕДЕНИЕ

Pseudomonas syringae — это видовой комплекс фитопатогенов, поражающий более 180 видов растений. Pseudomonas syringae являются причиной заболеваний многих важных для человека культурных растений, что ведет к значительному экономическому ущербу [1].
Среди болезней, которые они вызывают, различают опухолевые новообразования, гниение, прекращение роста и гибель части растения без загнивания, хлороз, некроз [2,3,4,5].

Заболевания растений, вызываемые Pseudomonas syringae трудно контролировать из-за высокой частоты мутаций, горизонтального переноса генов и видоспецифической изменчивости [2,6,7]. Никаких специфических антимикробных средств в настоящее время не разработано. Бесконтрольное воздействие химических веществ, применяемых для дезинфекции в растениеводстве, может привести к развитию устойчивости у данных бактерий [8,9,10].

В настоящее время перспективным направлением для контроля бактериальных заболеваний растений являются бактериофаги. Бактериофаги (фаги) — это вирусы, которые заражают бактерии, используя их метаболизм для завершения своей репликации, что приводит к лизису их бактериального хозяина, не причиняя прямого вреда растениям или животным. Фаги являются одним из наиболее распространенных типов организмов в биосфере и почти всегда очень специфичны для своего целевого бактериального хозяина. В настоящее время потенциал использования бактериофагов для биологического контроля Pseudomonas syringae активно изучается рядом исследовательских групп [11,12,13]. Литическая природа фага, высокая степень специфичности к хозяину, способность сохраняться и размножаться в окружающей среде делают бактериофаги потенциальными кандидатами для биоконтроля фитопатогенов [14 — 20].

Цель работы – разработать экологически безопасный биологический препарат на основе специфических бактериофагов, который позволит проводить биоконтроль растений на наличие бактерий Pseudomonas syringae на разных стадиях (посевной материал, в период вегетации и при хранении).

Задачи:

1. Конструирование фагового биопрепарата на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующихся определенными биологическими свойствами (максимально широкий спектр литического действия и явно выраженная специфичность, максимально высокий титр литической активности при хранении, устойчивость к факторам внешней среды, отсутствие в геноме производственно-перспективных бактериофагов «локусов патогенности»).

2. Подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов (разработка количественных и качественных параметров культивирования, подбор методики очистки биопрепарата, контроль стерильности).

3. Разработка технологической схемы наработки экспериментальной партии биопрепарата.

4. Разработка методологии индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции.

5. Изучение эффективности применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции.

6. Разработка нормативно-технической документации на сконстуированный фаговый биопрепарат Pseudomonas syringae и методические рекомендации по его применению в растениеводстве.

Новизна научных исследований

Впервые проведены исследования по разработке экологичного и высокоэффективного фагового биопрепарата для индикации бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства, который позволилит в перспективе снизить производственные потери в растениеводстве от фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae за счет своевременного выявления возбудителя.

Полученные результаты помогут в перспективе сформировать теоретические и практические предпосылки для создания нового для Российской Федерации класса технологических вспомогательных средств на основе бактериофагов – безопасного продукта для биоконтроля фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae, вызывающих опухолевые новообразования, гниение, прекращение роста и гибель части растения, хлороз, некроз.

Сформирована и адаптирована многоступенчатая схема контрольно-испытательных мероприятий нового средства для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Усовершенствована пилотная технология получения фагового биопрепарата, позволяющая нарабатывать средство для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae с высоким титром фаговых частиц.

Бактериофаги, входящие в состав биопрепарата, специфичны для фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae, не подавляют рост пробиотических штаммов и нормофлору растения и ризосферы. Что позволит, в перспективе, снизить количество применяемых при производстве средств химической защиты растений, сохранить урожай и получить органическую (экологически чистую) продукцию.

Теоретическая и практическая значимость полученых результатов

Получены данные о биологических свойствах бактериофагов, специфичных для бактерий Pseudomonas syringae, включая их молекулярно-генетическую характеристику (литическая активность, спектр литического действия и специфичность, влияние факторов внешней среды, урожайность и скорость адсорбции; дана молекулярно-генетическая характеристика).

Получены данные о степени распространения бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Сконструирован фаговый биопрепарат, активный в отношении фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae, имеющий высокий титр и срок хранения в течение 1 года.

Подобраны максимально эффективные методы индикации бактерий Pseudomonas syringae в объектах внешней среды и объектах растениеводства.

Разработана нормативно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Pseudomonas syringae» и «Методические рекомендации по индикации бактерий Pseudomonas syringae».

Сельскохозяйственным предприятиям предложен новый биопрепарат на основе консорциума 2 бактериофагов Ps.s-7 и Ps.s-27 серии УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae, для индикации фитопатогена в объектах внешней среды и объектах растениеводства и разработана методика его применения.

Внедрение результатов НИР

В процессе исследования получен биопрепарат на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующийся определенными биологическими свойствами — максимально широкий спектр литического действия и выраженная специфичность, максимально высокий титр литической активности при хранении, устойчивость к факторам внешней среды, отсутствие в геноме производственно-перспективных бактериофагов «локусов патогенности».

Известно, что вышеназванные микроорганизмы наносят значительный экономический ущерб российскому растениеводству. Разработка методологии индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции позволяет сократить экономические потери, так как в течение 24 часов лаборатория, оснащенная ламинарным боксом, термостатом, водяной баней и бытовым холодильником, может достоверно определить наличие этого микроорганизма в пробе.

Фаговый биопрепарат Pseudomonas syringae представляет собой прозрачную жидкость от светло-желтого до желтого цвета, розлитую в стеклянные флаконы под резиновую пробку и алюминиевый колпачок объемом 100-500 мл, титр фага не менее 10⁸ БОЕ/мл, условия хранения: 2-4 ⁰С в течение 12 месяцев при относительной влажности воздуха 70-80 %, при транспортировании необходимо учитывать хрупкость упаковки.

Полученные в результате исследований данные используются в учебном процессе обучающихся по направлениям подготовки:

— 35.03.03 Агрохимия и агропочвоведение (высшее образование — бакалавриат);

— 35.04.03 Агрохимия и агропочвоведение (высшее образование — магистратура);

— 35.03.04 Агрономия (высшее образование — бакалавриат);

— 35.04.04 Агрономия (Высшее образование — магистратура);

— 06.01.04 Агрохимия (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации);

— 06.01.01 Общее земледелие, растениеводство (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации);

-35.02.06 Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции (среднее профессиональное образование – программа подготовки специалистов среднего звена);

-35.03.07 Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции (высшее образование — бакалавриат);

— 06.04.01 Биология (высшее образование — магистратура);

— 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации);

— 03.02.03 Микробиология (высшее образование — подготовка кадров высшей квалификации).

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ОТЧЕТА НИР

1 Обзор литературных источников

1.1 Бактериальные патогены растений – как глобальная проблема

По данным Всемирного банка, население планеты, как ожидается, достигнет более 9,6 миллиарда человек к 2050 году, что неизбежно увеличит спрос на продовольствие примерно на 59%–98% [21]. Хотя Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций (ФАО) стремится решить проблему голода к 2030 году, продовольственная безопасность несколько снизилась с 2015 года из-за изменения климата, конфликтов и вредителей. По данным ФАО, на вредителей приходится ежегодные потери до 40% продукции растениеводства, что обходится мировой экономике в более чем 290 миллиардов долларов. Как таковые, эти вредители не только создают угрозу продовольственной безопасности и экономике, но и представляют собой значительную часть ограниченных ресурсов нашей планеты, которые теряются. В этой связи борьба с вредителями имеет решающее значение для перехода сельского хозяйства к большей устойчивости [22].

Многие экономически важные продовольственные культуры, включая рис, картофель, помидоры, капусту, бананы, оливки и цитрусовые, страдают от бактериальных инфекций, на которые, как полагают, приходится 5-10% потерь урожая [23]. Традиционно химические вещества используется для защиты этих культур от бактериальных заболеваний.

Однако бактериальные патогены растений уже сегодня приобрели устойчивость к биоцидам на основе меди [24,25], перекиси водорода [26] и другим химическим веществам, включая антибиотики, такие как стрептомицин [27].

Поэтому стратегии борьбы с болезнями часто могут сдерживать вспышки только путем сосредоточения внимания на профилактике. Кроме того, в связи с возросшей осведомленностью об их воздействии на окружающую среду и здоровье человека широкая общественность и правительства требуют, чтобы химические вещества были ограничены или, предпочтительно, заменены альтернативой (Директива ЕС 2009/128/EC). В связи с этим бактериофаги снова привлекли внимание со стороны научных кругов и промышленности в качестве агентов биологического контроля фитопатогенов [28-29].

1.2 Фаговый биоконтроль – современное состояние

Концепция использования фагов в качестве средств защиты растений не нова. На самом деле первые попытки датируются 1924 годом, когда Hemstreet и Mallmann [30] использовали фильтрат разлагающейся капусты, содержащий фаг, для лечения Xanthomonas campestris pv. campestris. Эта бактерия по-прежнему представляет всемирную угрозу для производства крестоцветных культур, таких как цветная капуста, брокколи и другие [31]. Однако по мере того, как химические биоциды становились легкодоступными и имели более широкий диапазон применения, они становились более простыми в использовании и интерес к фаговому биоконтролю значительно ослаб [32]. С начала 21-го века фаговый биоконтроль вновь приобрел интерес, движимый достижениями в области биотехнологии, о чем свидетельствует растущее число публикаций, патентов и патентных заявок [29].

На сегодняшний день в мире представлено более 20 биопрепаратов для биоконтроля фитопатогенов на основе фагов, протестированных илиапробированных в крупномасштабных испытаниях. Многие исследования были проведены для небольшого числа потосистем в течение последних трех лет с особым акцентом на Pectobacterium, Ralstonia, Pseudomonas и Xanthomonas. Патосистема определяется как отношение между растением и конкретным патогеном, например, Pectobacterium atrosepticum-картофель или патосистема Xanthomonas oryzae-рис [33]. Для каждого исследования суммируются применяемые бактериофаги, рассматриваемый патоген, вызываемое им заболевание, стратегии применения, дозировка препарата и основные результаты борьбы с заболеванием. Большинство исследований показывают значительное снижение развития симптомов заболевания, доказывая потенциал биоконтроля на основе фагов.

Интересно, что диверсификация стратегии применения фагов может наблюдаться в различных исследованиях, в основном следуя стратегии заражения. Для биоконтроля Pectobacterium или Dickeya, в литературе основное внимание уделяется послеуборочной обработке продукции и посевного материала, так как это один из моментов развития инфекции [34-38]. С другой стороны, контроль Ralstonia показывает оптимальные результаты, когда фаги доставляются в почвенные системы [39-41]. Это еще больше подчеркивается в патосистеме дыни- Acidovorax, в которой обработка почвы также увеличивает количество жизнеспособных семян [42]. Более того, те же авторы описывают профилактическую обработку семян на основе фагов для этой патосистемы, которая способна ограничить воздействие патогена [43]. Эта стратегия применения была опробована и на других культурах, таких как картофель, кукуруза, лук-порей и рис [44-46]. Для последних обработка семян превосходит обработку распылением с уменьшением симптомов на 95,4%-83,1% соответственно [46]. Наконец, для борьбы с болезнями, которые в основном проявляются на уровне филосферы, такими как Pseudomonas, ученые в первую очередь описывают успешные методы лечения распылением снижающие титр бактерий и развитие симптомов [47-49]. Таким образом, определенно существует связь между жизненным циклом и средой обмтания бактерий и оптимальным применением фаговой обработки (например, различные типы обработки необходимы для почвенных бактерий, таких как Ralstonia solanacearum, по сравнению с эпифитами/язвообразующими бактериями, такими как Pseudomonas syringae). Это также демонстрирует, что продолжающиеся усилия по разработке и адаптации методов фагового биоконтроля в соответствии с этой и другими специфическими особенностями не теряют актуальности.

Так же, исходя из проанализированной информации, можно утверждать, что детальное понимание биологии патогена и фага необходимо для внедрения эффективного фагового биоконтроля в растеневодстве.

1.3 Место бактериофагов в растеневодстве и перспективы применения

Как правило, стратегии комплексной защиты растений (IPP) включают передовые методы, позволяющие в первую очередь предотвращать вспышку заболевания, раннее обнаружение и тщательный мониторинг потенциальных инфекций, использование адекватных, но достаточных доз предпочтительно биологических обработок и оценку эффективности [57]. В IPP взаимодействие (-и) с патогеном (-ами) растение считается ключевым, поскольку эта взаимосвязь очень специфична и варьируется между этим разнообразием и инфекционностью фага. Однако помимо конструирования оптимального коктейля фагов, понимание биологии патогена, то есть их биологического разнообразия, основного источника инфекции и пути заражения, имеют решающее значение для разработки любой целевой стратегии IPP на основе фагов.

1.4 Влияние биоразнообразия патогенов и путей заражения для определения оптимальной стратегии применения

Детальное понимание разнообразия патогенов и взаимодействия растений и бактерий включает в себя выделение репрезентативной коллекции штаммов и их характеристику на уровне генома, а также сопоставление филогенетических данных с метаданными, включая, например, региональное местонахождение и период выделения [59]. Например, недавнее филогенетическое исследование Xanthomonas oryzae pv. oryzae показало, что внутри этого бактериального подвида существует шесть различных групп с различными генотипическими характеристиками [60,61]. При разработке фагового коктейля против этого патогена и многих других фитопатогенов, необходимо принимть во внимание это внутривидовое разнообразие, которое имеет решающее значение для обеспечения эффективной работы фагового коктейля против наиболее релевантных патогенных штаммов в данном географическом местоположении [23,62]. Более того, такие данные, связанные с вирулентностью конкретных штаммов, позволили бы рационально разрабатывать предложеия специально для наиболее инвазивных штаммов в этом регионе. Информация о сроках появления этих высоковирулентных штаммов потенциально позволит идентифицировать источник инфекции и остановить заболевание на ранней стадии. Поэтому определение источника инфекции и регулярный мониторинг необходимы для предотвращения вспышки и дальнейшего распространения болезни в интенсивном сельском хозяйстве.

На рисунке 1 представлен схематический обзор наиболее распространенных стратегий заражения, используемых фитопатогенами, и того, как фаги могут вмешиваться на разных стадиях при рациональном проектировании стратегии применения. Рационально разработанные стратегии защиты растений должны быть направлены на предотвращение неконтролируемого размножения вредителя путем непосредственного взаимодействия с его жизненным циклом, ограничивая при этом влияние на текущую и будущую сельскохозяйственную практику.

Рисунок 1 — Обзор наиболее распространенных путей заражения растений патогенными бактериями (красные стрелки) и способов рационального применения фагов (зеленые стрелки).

(а) Бактерии, такие как Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, Xanthomonas campestris pv. campestris или Acidovorax citrulli способны заражать семена. Здесь целенаправленное обеззараживание семян на основе фагов может служить инструментом борьбы с болезнью.

(b) Многие культуры сначала выращиваются в питомниках, а затем пересаживаются в поле. Рассаду и молодые растения выращивают при относительной высокой влажности и в непосредственной близости. Следовательно, болезни могут легко распространяться от одного растения к другому. Фаги могут применяться в таких условиях, чтобы защитить соседние растения от возможность заражения и сдерживать распространение бактерий после высадки рассады.

(с.1.) Насекомые — известные носители множественных заболеваний, вызываемых фитоплазмами, Xylella fastidiosa и Candidatus liberibacter spp. (с.2.) Загрязненная вода с соседних растений и зараженная почва способствуют распространению патогенов. Часто, бактерии используют несколько путей заражения, чтобы проникнуть в ткани листа. (c.3.) Физические повреждения и ранения являются идеальной отправной точкой для бактерий, колонизирующих растение. (c.4.) Патогены, такие как Ralstonia solanacearum и другие, заражаются растения через загрязненную почву и воду. В этих системах, фаги могут применяться в качестве добавки и/или обработки почвы для защиты или лечения заболеваний.

(d.1.) Бактерии, такие как Erwinia amylovora, способны заражать цветы и соцветия, поднимая опылителей и брызги воды, тогда как другие (d.2.) Проникают в зародыши семян, чтобы произвести зараженные. Здесь возможны прямые внесения, а опылители могут действовать как энтомовекторы для доставки фагов.

1.5 Подбор фагового коктейля и его значение для патоген-фаговых взаимодействий

Для разработки устойчивой стратегии биоконтроля фагов сначала необходимо выделить разнообразный и взаимодополняющий набор фагов. Глубокое молекулярное понимание геномики этих вирусов необходим для обеспечения их безопасности для применения в сельском хозяйстве [63,64]. Кроме того, следует позаботиться о предотвращении развития резистентности бактерий к фагу. Так как механизмы бактериальной резистентности к фагам чрезвычайно разнообразны [65,66]. Однако развитие резистентности в основном наблюдается в стандартных (богатых питательными веществами) лабораторных условиях, но в меньшей степени у растений. Одним из способов развития резистентности бактерий является потеря или модификация внешних мембранных структур [67,68], что является ключевой особенностью дизайна коктейлей. Устойчивость бактерий к коктейлю из фагов может возникать и на уровне распознавания рецепторов. Например, при обработке семян фагами [45]. Считается, что использование нескольких фагов, нацеленных на разные рецепторы, может ограничить возникновение этой резистентности, поскольку развитие резистентности часто связано с приспособляемостью. Действительно, Wright и его коллеги показали, что появление устойчивости Pseudomonas aeruginosa PAO1 в лабораторных условиях зависит от стратегии введения фага [69]. При использовании коктейля из 2 фагов, включающего фаги с различными рецепторами, наблюдаемая устойчивость была снижена по сравнению с последовательным использованием фагов, в то время как обе стратегии имели одинаковые затраты. Таким образом, развитие резистентности не обязательно является непреодолимым препятствием (по крайней мере, в краткосрочной перспективе), и на результат резистентности может повлиять рациональная разработка стратегии применения. Остается открытым вопрос, верно ли то же самое для внешней среды. Hernandez и Koskella, обратились к этому, разработав эксперимент, в котором они совместно культивировали патоген растений Pseudomonas syringae pv. Tomato и два фага, в богатой среде и на листьях томата [70]. Они обнаружили, что устойчивость легко приобретается в богатой среде, как и ожидалось. Однако им не удалось выделить из листьев устойчивые к фагам мутанты. Таким образом, они подтвердили предыдущую работу, которая показала, что лабораторно приобретенная устойчивость может возникать из-за преспособляемости [71], и показали, что у растений не возникло альтернативной устойчивости. Однако в настоящее время не существует основы для оценки развития и воздействия потенциальной устойчивости к фагам, и этот аспект следует внимательно учитывать при практическом применении.

1.6 Индивидуальные стратегиям применения фагов

В настоящее время существуют различные варианты применения фагов в зависимости от пути заражения. Однако, применение внекорневой подкормки в открытом грунте представляется довольно ограниченным методом, из-за проблем со стабильностью, вызваемых биотическими и абиотическими стрессами, включая солнечный свет, изменение погодных условий и высыхание [54]. Поэтому предпринимаются попытки по повышению выносливости фагов на листовой поверхности. Born и его коллеги протестировали рецептуру фага Erwinia amylovora Y2 и смогли выявить 28%, 34% и 38% исходного фага после воздействия высокоинтенсивного ультрафиолетового излучения, смешав фаг с 10% морковным соком, 5% соком перцев и 50 mM ароматических аминокислот соответственно. Это гараздо выше по сравнению с 0,21% выявления без предложенной рецептуры [72]. В другом примере GasˇI c et al. повысил стабильность фага Xanthomonas euvesicatoria Kf1, смешав его с 0,75% обезжиренного молока и 0,5% сахарозы. Таким обзаром подготовленная популяция фагов обнаруживалась после шестидесяти дней инкубации в УФ/темном состоянии 16/8 часа, в то время как неподготовленная популяция фагов была необнаружима через сорок дней [55]. Поскольку все фаги состоят из белкового капсида, аналогичные стратегии можно было бы предусмотреть для всех обработок распылнием в открытом поле. Другой подход в этой перспективе был предложен Svircev и др. для борьбы с инфекциями Erwinia amylovora для обработки цветков яблони и груши фагом в полевых условиях [73]. Чтобы минимизировать потерю фагов из-за стрессов, они применяют штаммы-носители фагов Erwinia такие как Pantoea agglomerans для поддержания высокой концентрации фагов in situ для предотвращения распада фагов [74]. Во многих патосистемах зараженные семена считаются одним из основных путей заражения [75]. Следовательно, фаги могут применяться в качестве дезинфекционного этапа при подготовке семян или замачивании для уменьшения развития болезней. Так, искусственно контаминированные Pseudomonas syringae pv. porri семена лика были замочены в растворе фага, после чего происходило снижение бактериального титра [45]. Другой подход в этой перспективе основан на покрытии семян. Например, Kimmelshue et al. снижал бактериальные титры Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis у кукурузы на 76% на семя в семенах контаминированны снаружи и 51% и 78% в семенах, инфицированных изнутри, в семенах и тканях проростков, соответственно [44]. Rahimi получил аналогичные результаты при контроле бактериальной пятнистости плодов дыни. Авторам удалось увеличить всхожесть семян с 13% в семенах без покрытия до 96%, в семенах покрыты фагами [43]. Они также показали, что фаги поглощаются рассадой и возможно использовать такой способ защитить растение от инфекции [42]. Поглощение фагов растениями описано и для других патосистем, таких как яблоки и бобы [76-78]. Эти подходы показывают потенциал бактериофагов в качестве обеззараживающего средства семян.

Кроме того, известно, что некоторые бактериальные заболевания растений распространяются в питомниках и проявляются после пересадки в полевые условия. Тут фаги могут быть применены в качестве обработки почвы для дезинфекции или их можно использовать в качестве профилактической обработки, промочив лотки для растений перед посадкой их в поле или теплицу. Полный потенциал этих методов еще предстоит изучить.

1.7 Интеграция фагового биоконтроля в цифровое земледелие

Современные революции в растениеводстве и сельском хозяйстве вцелом, именуемые умным или цифровым земледелием, включают в себя внедрение новых технологий и приборов. Смартфоны, робототехника, машинное обучение и сенсорные технологии могут быть интегрированы в сельскохозяйственный процесс, что облегчает обнаружение различных фитопатогенов как в тепличных, так и в полевых условиях [35, 79]. Гиперспектральные сенсоры, способны обнаруживать возникающие бактериальные инфекции с точностью до 96%, что позволяет своевременно идентифицировать возбудителя и применять терапию на ранних стадиях [80,81]. Таким образом, лечение может быть направлено конкретно на отдельные больные растения и их соседей. В случае интенсивного вертикального земледелия растения выращивают в гидропонных системах в условиях искусственного освещения с использованием светоизлучающих диодов (светодиодов) в качестве основного источника света. Эти условия идеально подходят для применения фагов, поскольку они не приводят к высыханию фага на поверхности листа, отсутствует воздействие ультрафиолетового излучения и другие абиотические стрессы,присутствующие в поле. Здесь фаги могут быть применены до развития симптомов в качестве профилактического средства в питательном раствор, предотвращающем заболевание, или в виде спрея для лечения потенциально зараженных растений после обнаружения. Шмели и другие энтомовекторы также могут быть использованы для распростронения бактериофагов, как агентов биоконтроля в тепличных условиях [82]. Кроме того, сенсорное обнаружение больных культур также возможно в условиях открытого поля благодаря оптимизации беспилотных технологий и беспилотных автоматизированных транспортных средств [83]. В этом случае больные культуры снова могут быть точно обнаружены в поле и уничтожены во время обработки почвы. Фаговые технологии вместе с другими организмами биоконтроля могли бы служить в этом контексте комплексной стратегией борьбы с болезнями, которую еще предстоит изучить или использовать. Однако такое рациональное использование ресурсов служит экономической и экологической логике, поскольку сокращает количество необходимых обработок. Эффект самоусиления и автоматического дозирования фагов еще больше увеличивает эффективность применения. Автоматизированное прецизионное нанесение также позволяет поддерживать постоянную скорость нанесения, обеспечивая равномерную обработку там, где это необходимо. Кроме того, при обработке только загрязненных культур и применение агентов биоконтроля заболевание может быть сдержано, а риск развития резистентности патогена снижен, поскольку он вводится только локально.

На рисунке 2 представлен схематический обзор полного внедрения фагов в качестве устойчивых агентов биоконтроля в современную сельскохозяйственную практику.

Рисунок 2 — Обзор комплексной стратегии защиты растений на основе фагового биоконтроля. 1. Репрезентативная бактериальная коллекция должна быть создана путем выделения штаммов из больных культур. Филогенетический анализ этих бактерий позволяет оценить общее бактериальное разнообразие. Метаданные о географическом местоположении и периоде ыделения помогают понять географическое распределение штаммов. Кроме того, необходимы данные о вирулентности штаммов, находящихся в коллекции, для определения наиболее релевантных штаммов из коллекции. 2. Коллекция бактериофагов может быть получена из различных зараженных районов. Диапазон хозяев различных фагов должен быть протестирован и соотнесен с бактериальной филогенией, чтобы иметь возможность разработать рациональное применение фагов на основе распределения штаммов. Кроме того, глубокие геномные данные позволяют отбирать на литических фагах те, которые безопасны для использования в сельскохозяйственных условиях. При составлении фагового коктейля коктейль предпочтительно должен состоять из фагов, распознающих различные рецепторы, чтобы ограничить развитие резистентности. 3. В вертикальном земледелии растения выращиваются в полностью контролируемых гидропонных теплицах с использованием светодиодов в качестве основных источников света. Растения можно контролировать с помощью сенсорных методов, позволяющих контролировать рост растений. С этой точки зрения гиперспектральные датчики, могут быть использованы для раннего выявления заболеваний. Как только инфекция обнаружена, и подтверждена уведомление может быть отправлено на смартфон фермера 4. и зараженные растения могут быть уничтожены, а соседние растения обработаны биопестицидом, таким как бактериофаги. 5. Гиперспектральные датчики могут быть прикреплены к БПЛА, которые могут отправить отчет фермеру, что позволит своевременно избавиться от больных культур и рационально обработать зараженный участок.

1.8 Перспективы полноценной вирусо-ориентированной комплексной борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур

Исследования по биоконтролю фагов привели к появлению ряда коммерчески доступных продуктов. В США они зарегистрированы как биопестициды. В отличие от этого, до настоящего времени не зарегистрировано ни одного фагового продукта в Европе или России. На сегодняшний день несколько вирусов насекомых и вирусов растений были зарегистрированы в качестве биопестицидов для борьбы с вредителями (База данных активных веществ для пестицидов растений; URL:https://ec. https://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database/). Кроме того, в пищевом секторе несколько фагов получили статус GRAS от Управления по контролю за продуктами питания и лекарствами США, в том числе Фаги листерий, сальмонелл, эшерихий и шигелл используют как технологические добавки (URL-адрес:https://www.accessdata.fda.gov/scripts/fdcc/). Кроме того, применение фагов Pectobacterium в качестве упаковочного средства для поверхностной стерилизации клубней картофеля после уборки урожая разрешено в пищевой промышленности Европы. Изменения в регистрации фагов в качестве биопестицидов в соответствии с требованиями пищевой промышленности могли бы послужить дополнительным стимулом для полного изучения потенциала бактериофагов. Это даст толчок целенаправленным исследованиям и потенциальной коммерциализации методов борьбы с болезнями на основе фагов.

Все же сегодня отсутствуют устойчивые биологические стратегии борьбы с бактериальными инфекциями в растениеводстве. Предпринимаются усилия для решения этой проблемы путем применения бактериофагов. Предыдущие исследования действительно показали, что фаги перспективны в качестве биоконтролирующего средства для индикации профилактики и лечения бактериальных инфекций. Однако современные цифровые технологии земледелия, до сих пор таят в себе неисследованные и уникальные возможности для внедрения фагового биоконтроля. В последующем необходима полноценная оценка безопасности бактериофагов с точки зрения развития долговременной резистентности и их влияния на природные микробные сообщества. Сбор таких данных будет иметь решающее значение для регулирования и коммерческого внедрения фаговых технологий в современные методы ведения сельского хозяйства.

2 Результаты исследований

2.1 Объекты, материалы и методы исследований

Научная литература, посвященная исследованиям бактериофагов, была проанализирована формально-логическими методами. В работе использованы микробиологические, иммунохимические, молекулярно-генетические и статистические методы исследований.

Для работы со штаммами бактерий и фагами, выделенными из объектов внешней среды были использованы изолированные боксированные помещения для проведения микробиологических исследований.

Обязательными начальными этапами работы было:

— определение спектра чистых культур Pseudomonas syringae — как перспективных штаммов бактерий (т.е. кандидатов в производственные штаммы бактерий);

— определение спектра вирулентных бактериофагов, специфичных для Pseudomonas syringae для конструирования фагового биопрепарата.

Объектами исследования стали 8 бактериофагов активных в отношении Pseudomonas syringae выделенные из объектов окружающей среды: почвы, воды (река, сточные воды) и сельскохозяйственных растений (листья, плоды, стебли).

Для исследований были предусмотрены раздельные микробиологические боксы для работы с производственными бактериальными штаммами и маточными фагами.

При производстве фаговых препаратов проводили валидацию технологического процесса, технологического оборудования, сырья и методов контроля. Все исходные материалы и сырье, используемые при производстве, имело документы, подтверждающие их качество. Производственные питательные среды обладали хорошими ростовыми свойствами и были стерильными.

В экспериментах применяли штамм бактерий Pseudomonas syringae Ps.s № 3 (коллекция музея бактериальных штаммов и бактериофагов кафедры (МВЭ и ВСЭ) микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ); референс-штамм бактерий Pseudomonas syringae В-10917 из коллекции БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика.

Для изучения специфичности бактериофагов были использованы штаммы бактерии: Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Рectobacterium carotovorum, Хanthomonas campestris, Saimonella enteritidis, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Echerichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis.

Термостат (ТСО-1/80) ОАО «Смоленское СКТБ СПУ»; Термометр; Ультрафиолетовая лампа марки «Phillips» с длиной волны 253 нм; Спиртовка; Петля пастеровская; Плитка электрическая; Лабораторная стерильная посуда; Дистиллированная вода; Лабораторные весы; Автоклав (ГК-100-3); Дистиллятор (Liston); генцианвиолет 548-62-9 (ЗАО «Вектон», РФ); Набор реагентов для окраски микроорганизмов по методу Грама (НИЦФ Россия, Санкт-Петербург; ГРМ-агарагар (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск);ГРМ-бульон (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск); Среда Кинга В (Пептон Пептон ферментативныйООО НИЦФ СПБ; Глицерин раствор ОАО Самарамедпром РФ; калий фосфорнокислыйдвузамещенный ГОСТ 4198-75 УлХИМ РФ; магний сернокислый УлХИМ РФ; ГРМ-агарагар (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск)); Оксидазные диски HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Водорода перекись раствор 3% ООО «ЮжФарм». Краснодарский край, Крымский р-н, ст. Троицкая; Аргининовый бульон HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Питательный желатин HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Раствор Люголя (НИЦФ Россия, Санкт-Петербург); Пептон ферментативный ООО НИЦФ СПБ; Натрий хлористый ГОСТ 4233-77 УлХИМ РФ; калий фосфор¬нокислыйдвузамещенный ГОСТ 4198-75 УлХИМ РФ; бромтимоловый синий (HiMediaLaboratoriesPvt.Limited (Индия);Натрий хлористый ГОСТ 4233-77 УлХИМ РФ; Кальций хлористый ГОСТ 450-77 УлХИМ РФ; ГРМ-агарагар (ФБУН ГНЦПМиБ Россия г Оболенск);Tween 80 (HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Сахароза (чда) ГОСТ 5833-75УлХИМ РФ; Полоски с реактивом Ковача (на индол) HiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); Железосодержащий пептонныйагарHiMediaLaboratoriesPvt. Limited (Индия); питательные среды Гисса (ООО «НПЦ «Биокомпас-С» Россия, г. Углич), хломамин Б, 70 % этиловый спирт, среда Кесслера, среда Эндо, среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон), среда Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон).

Среда CRL содержала следующие компоненты: пептон 12.0 г, глицерин 10.0 г, агар 18.0 г, MgSO4 0.7 г, K2HPO4 2.0 г, KH2PO4 2.0 г, глюкозу 2.5 г, дрожжевой экстракт 2.0 г, мясной пептон 2.0 г, сахарозу 15.0 г, NaCl 2.0 г, CaCO3 20.0 г (реактивы производства PanReac AppliChem, Испания) на 1 л дистиллированной воды. Среда CRL.2 состояла из тех же компонентов, за исключением CaCO3. Все ингредиенты перемешивали, доводили рН 20%-м раствором соляной кислоты до 7,0-7,2 с помощью pH-метра (МР 220, Mettler Toledo, Швейцария) и стерилизовали при температуре 121℃ в течение 15 мин (автоклав MLS-3020U, Sanyo, Япония). Для получения среды mCRL.2 к среде CRL.2 после стерилизации и охлаждения до 50℃ добавляли спиртовой (70%) раствор циклогексимида до его конечной концентрации 200 мг на 1 л среды и водный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) до конечной концентрации 50 мг на 1 л среды.

Изучение биологических свойств фагов проводили по методам, описанным в научных работах (Н.А. Феоктистова и др., 2017; Д.А. Васильев и др., 2017; П.С. Майоров и др., 2020).

Реакция нарастания титра фага – это метод индикации, позволяющий выявить бактериальный агент в анализируемом материале, не выделяя чистую бактериальную культуру (Г.Р. Садртдинова, 2017).

Реакцию нарастания титра фага ставили на пробах почвы (садоводческое общество «Садовод УСХИ» п. Октябьский Чердаклинского района Ульяновской области), семенах огурца «Китайский змей», речной воде (р.Свияга, г.Ульяновск), томатах сорта «Бычье сердце», цуккини сорта «Цукеша», огурцах сорта «Аэлита» на базе кафедры (МВЭ и ВСЭ) микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ). Пробоподготовку осуществляли следующим образом: гомогенизация и последующее разведение анализируемого материала в стерильном физиологическом растворе, используя соотношение 1:10.

При подборе оптимального времени экспозиции компонентов фагового биопрепарата с исследуемой пробой эмпирически подбирали временной диапазон термостатирования с учетом температуры культивирования индикаторной бактериальной культуры. Эксперименты ставили на стерильном МПБ.

Параметры постановки эксперимента:

— исследуемый субстрат вместе с введенным бактериофагом термостатировали при температуре 28±1 0С, не применяя этап «предварительного подращивания», в течение 3,5; 7,0; 15,0; 24,0 часов);

— исследуемый субстрат вместе с введенным бактериофагом термостатировали при температуре 28±1 0С, включая этап «предварительное подращивание», в течение 3,5; 7,0; 15,0; 24,0 часов).

Схема исследования показана в рисунке 3.

Результаты индикации бактерий в анализируемом субстрате методом реакции нарастания титра фага (РНФ) учитывались следующим образом: увеличение на чашке Петри количества негативных колоний фага (бляшкообразующих единиц) по сравнению с контролем в пять и более раз свидетельствует об наличии в опытной пробе искомых бактерий, на которых адсорбировался специфичный им бактериофаг и был зафиксирован цикл его развития (Е.О. Чугунова и др., 2016).

Рисунок 3 – Схема индикации бактерий Pseudomonas syringae с методом реакции нарастания титра фага с использованием изучаемого бактериофагового биопрепарата

Для протеомного анализа нами были использованы ресурсы систем SnapGene Viewer v.4.1.7 и UGENE (v.36).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета программ Statistica Desktop 13 Russian (for Windows; StatSoft Russia (TIBCO USA), Microsoft Excel 2010).

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Конструирование фагового биопрепарата на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующихся определенными биологическими свойствами

Морфологию негативных колоний изучали на плотных питательных средах по методу Грациа. Установлено, что бактериофаги бактерий Pseudomonas syringae на МПА формировали схожие между собой негативные колонии — прозрачные, округлой формы, без зоны вторичного роста диаметром от 5 до 9 мм (рис 4).

Рисунок 4 – Морфология негативных колоний бактериофага Pseudomonas syringae Ps.s-8 УлГАУ

Литическая активность — это свойство фага вызвать лизис бактериальной культуры на плотной (по методу Грациа) или жидкой (по методу Аппельмана) питательной среде. Для получения достоверных результатов такая активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях. В связи с этим, индикаторный штамм Pseudomonas syringae — Ps.s №3, выращивали на стандартном мясопептонном бульоне в течение 18-20 часов и использовали в эксперименте.

Установлено, что бактериофаги проявляли разную литическую активность на культуре бактериальных клеток штамма №3 Pseudomonas syringae. Результаты представлены в таблице 1.

Литическая активность изучаемых бактериофагов Pseudomonas syringae составила по Аппельману от 10-4 до 10-8; по Грациа от 1,0±0,1×106 до 2,0±0,1×109 (БОЕ/мл).

За изменениями литической активности во время хранения наблюдали в течение года, проверяя результаты через каждые 3 месяца. Все фаги хранились в виде фаголизата бульонной культуры в закупоренных стекляных флаконах в условиях холодильника при температуре 2 — 4 ºС. Результаты определения литической активности по методам Аппельмана и Грациа приведены в таблице 2. Установлено, что бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-13 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ не изменяют свою литическую активность в течение 12 месяцев. Литическая активность фагов Ps.s-1 УлГАУ, Ps.s-8, Ps.s-15 УлГАУ, Ps.s-30 УлГАУ, Ps.s-77 УлГАУ снижалась при хранении в течении года в пределах 1-2 порядков и легко востанавливалась после 3-5 последовательных пассажей.

Таблица 1 — Литическая активность

Таблица 2 — Литическая активность бактериофага через 3 месяца хранения

Спектр литической активности бактериофагов, т.е. диапазон лизиса гомологичных к бактериофагу бактерий является их характерной особенностью и одним из критериев отбора для включения бактериофага в состав биопрепарата. Диапазон литической активности устанавливали на 15 штаммах Pseudomonas syringae, 2 из которых референс-штаммы и 13 — полевые.

На подсушенный газон бактериальной культуры наносили каплю бактериофага по секторам и инкубировали при температуре 28°С в условиях термостата. Оценку результатов проводили через 16-20 часов (рис. 5).

Рисунок 5 – Стерильные зоны лизиса в месте нанесения бактериофагов — положительный результат

Опыты показали, что фаги характеризуются различным спектром литической активности по отношению к бактериальным культурам.

Установлено, что спектр литической активности изучаемых фагов варьировал от 21,4% (Ps.s-13 УлГАУ) до 85,7% (Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-27 УлГАУ).

Изучение специфичности действия бактериофагов Pseudomonas syringae проводили по методу Отто. Установлено, что все 8 изучаемых бактериофагов специфичны к бактериям вида Pseudomonas syringae и не проявляют активности по отношению к представителям других родов и видов бактерий: Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pectobacterium carotovorum, Хanthomonas campestris, Saimonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Echerichia coli, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis (табл. 4).

Таблица 3 — Спектр литической активности фагов по отношению к штаммам Pseudomonas syringae

Степень устойчивости бактериофагов и клеточных хозяев к инактивирующим факторам физического воздействия имеет теоретическое и практическое значение, поэтому при изучении биологических свойств фагов определение их чувствительности к таким агентам является обязательным. Нами было проведены исследования по изучению термоустойчивости бактериофагов в диапазоне 40-64 °С в течение 30 минут.

Бактериофаги прогревали на водяной бане при температуре от 40°С до 62 °С с интервалом 2°С в течение 30 минут. Контролем служил стерильный мясопептонный бульон. Качественное изучение активности фагов подвергнутых прогреванию проводили по методу Отто. Культивировали посевы в условиях термостата в течение 18 часов при температуре 28±2 0С. Наличие зоны лизиса в виде «дорожки» свидетельствовало об устойчивости фагов к воздействию температуры (табл. 5).

Таблица 4 — Результаты изучения специфичности действия бактериофагов Pseudomonas syringae

Таблица 5 — Определение температурной устойчивости бактериофагов Pseudomonas syringae

Установлено, что бактериофаги бактерий Pseudomonas syringae умеренно термоустойчивы. Нагрев выше 62 °С приводит к инактивации бактериофагов.

Изучение устойчивости фагов к воздействию хлороформа проводили при следующих условиях: соотношение фаголизата и хлороформа 10:1, время воздействия 5-40 минут с 5-минутным интервалом. Надосадочную жидкость после отстаивания использовали в исследованиях с индикаторным штаммом Pseudomonas syringae по методу Отто. Культивировали посевы в условиях термостата в течение 18 часов при температуре 28⁰С. Наличие зоны лизиса в виде «дорожки» свидетельствовало об устойчивости фагов к воздействию хлороформа. Результаты исследований представлены в таблице 6.

В экспериментах также определено, что контроль в виде индикаторной культуры Pseudomonas syringae Ps.s №3 не выдерживал воздействие хлороформа даже в течении 5 минут. В свою очередь изучаемые фаги Pseudomonas syringae показали устойчивость к воздействию хлороформа даже при воздействии в течении 45 минут, таким образом обработку хлороформом можно считать оптимальным способом очистки фаголизатов от бактериальных клеток.

Таким образом, нами изучены биологические свойства 8 фагов, которые обладают способностью инфицировать и лизировать эти бактериальные патогены и, следовательно, потенциально могут быть использованы в качестве агентов биологического контроля Pseudomonas syringae.

Таблица 6 — Определение устойчивости фагов Pseudomonas syringae к воздействию хлороформа

Для того чтобы фаг был эффективным агентом биологического контроля, предпочтительно, чтобы он обладал способностью лизировать целый ряд генетически разнообразных штаммов бактериального патогена. В связи с этим спектр литической активности фагов устанавливался нами на 15 штаммах Pseudomonas syringae, в т.ч выделенных из объектов внешней среды, что позволило определить штаммы фагов с широким диапазоном хозяев — Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-27 УлГАУ.

Изучение специфичности фагов на 15 видах гетерологичных культур, показало, что все 8 изучаемых бактериофагов видоспецифичны для Pseudomonas syringae и не оказывают негативного воздействия на другие бактерии.

Все изучаемые фаги, имели схожую морфологию негативных колоний и продуцировали прозрачные бляшки, демонстрируя цикл литической инфекции, что ограничивает риск горизонтальной передачи патогенного гена, возможного при лизогенном фаге.

Для определения оптимального способа очищения фаголизата от бактериальных клеток была изучена устойчивость фагов Pseudomonas syringae к воздействию физических и химических факторов. Исследования показали, что изучаемые фаги умеренно устойчивы к нагреванию и теряют активность при 30-минутном воздействии температуры выше 62°С.

Оптимальным же способом освобожения фаголизатов от жизнеспособных бактериальных клеток Pseudomonas syringae стал трихлорметан в соотношении 10:1 и временной экспозицией 45 минут.

Чтобы использовать фаг в качестве агента биологического контроля, он должен быть способен сохраняться в течение продолжительного периода времени, не снижая свою литическую активность. Результаты изучения литической активности фагов при хранении в условиях холодильника показали, что бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ, Ps.s-13 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ не снижали литическую активность в процессе хранения, а литическая активность фагов Ps.s-1 УлГАУ, Ps.s-8, Ps.s-15 УлГАУ, Ps.s-30 УлГАУ, Ps.s-77 УлГАУ снижалась при хранении в течении года в пределах 1-2 порядков и легко востанавливалась после 3-5 последовательных пассажей. Таким образом, хранение фагов в условиях холодильника при температуре 2 — 4 ºС является оптимальным.

Изучаемые фаги потенциально могут быть использованы в качестве биологического контроля Pseudomonas syringae, наиболее производственно-перспективными с учетом биологических свойств являются фаги: Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, обладающие характеристиками:

Ps.s-7 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10-8 (при определении по методу Аппельмана) и 2,0±0,1х109 БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) (при определении по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; в исследованиях установлена устойчивость к температуре до 600С в течение 30 минут и трихлорметану в соотношении 1:10 (временная экспозиция 35 минут).

Ps.s-27 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10-8 (по методу Аппельмана) и 1,0±0,1х109 БОЕ/мл (по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; определено, что бактериофаг устойчив к воздействию температуры до 600С в течение 30 минут и трихлорметана в соотношении 1:10 (время экспозиции составило 35 минут).

Для данных производственно перспективных штаммов фагов был проведен еще ряд исследований.

На первом этапе исследовании были изучены температурные показатели культивирования выделенного бактериофага. Для этого в опытную пробирку, содержащую стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6) вносили 0,2 мл суточной культуры Pseudomonas syringae штамм № 3 в две пробирки, в одну добавляли 0,2 мл бактериофага Ps.s-7 УлГАУ и другую – 0,2 мл Ps.s-27 УлГАУ. Параллельно ставился контроль. Для чего, в пробирки, содержащие стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили суточную культуру Pseudomonas syringae штамм №3 в количестве 0,2 мл. Пробирки помещали в термостат (культивирование при температуре: 19 °С). Далее опыт проверяли 22°С, 25°С, 28°С, 31°С, 34°С, 37°С, 40°С соответственно.

Помутнение пробирки указывало на отсутствие лизиса, просветление в сравнении с контролем на наличие лизиса.

Таблица 7 – Температурные показатели культивирования бактериофага

Примечание: «-» — отсутствие лизиса, «+» — лизис.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что оптимальная температура культивирования бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ находится в диапазоне 250С -31 0С. Нами решено инкубировать систему фаг-культура Ps.s-7 УлГАУ — Pseudomonas syringae штамм №3 и Ps.s-27 УлГАУ — Pseudomonas syringae штамм №3 при температуре 280С.

На втором этапе исследовании мы подбирали количественное соотношение бактериофага и культуры для культивирования. В опытную пробирку, содержащую стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6), вносили 0,2 мл фага Pseudomonas syringae Ps.s-7 УлГАУ и также в другую пробирку Ps.s-27 УлГАУ, затем в пробирку вносили 24 часовую культуру Pseudomonas syringae штамм №3, сначала 0,2 мл, затем 0,4 мл и т.д. постепенно доводя объем культуры до 2,5 мл. Параллельно ставился контроль. Для этого в пробирку, содержащую стерильный 1,5% МПБ в объеме 4,5 мл (рН 7,4-7,6) вносили культуру Pseudomonas syringae штамм №3 по 0,2 мл.пробирки помещали в термостат и культивировали при температуре 280С.

В результате исследований было установлено, что для бактериофагов Pseudomonas syringae Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ оптимальным количественным соотношением бактериофага и культуры является соотношение 1:1, т.е. 0,2 мл фага х 0,2 мл индикаторной культуры и температуре 28 ⁰С.

Анализ протеомов селектированных бактериофагов

Нуклеотидная последовательность выделенных и селектированных бактериофагов, полученная при секвенировании, позволила нам провести сравнительный анализ их геномов. Однако исследование биологических свойств бактериофагов включает в себя также их протеомный анализ (аминокислотную последовательность протеинов, их качественный и количественный состав, а также молекулярный вес).

Основной целью исследования протеомов выделенных бактериофагов было определение отсутствия факторов патогенности для возможности их дальнейшего использования при фагоиндикации бактериальных культур.

Исходя из данной цели были определены следующие задачи:

Составление карты протеомов бактериофагов в соответствии с аннотированными геномами бактерий и вирусов на основе триплетной кодировки аминокислот;

Исследование протеомов бактериофагов на предмет соответствия локусам патогенности;

Составление филогенетической схемы каждого из протеомов исследуемых бактериофагов на предмет аналогии с аннотированными факторами патогенности.

Ps. syr. phage 7 УЛГАУ

При анализе протеома бактериофага Ps. syr. phage 7 УЛГАУ было выявлено 29 белков с молекулярными массами от 18,8 до 138,8 кДа. Качественный протеомный состав фага представлен на рисунке 6.

Рисунок 6- Качественный протеомный состав фага Ps. syr. phage 7 УЛГАУ

✓ORF #3 566 .. 1315 750 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTTWVSTVSGNPLLIRVTCTRKPVSFPLVGMILILYRRPTRVRLWLVLMVVPFDEVVVGPDEELEPVLLGIRQPCYLQIAQHYWRSIGR

DLLVHPFLAEGALLLGDLLTVEHIGQDIAHVWRTLLLHVVLQAELDQLCNGTHGSVPHVSKADGISRTVVLIAEVPKVLVQLVPDTGELFP

GLDRTEAEPHQQQPALLELESLGPAKTSKVIDGDVTDTVETSELEHQMFSLVSVRSRRAMTTSTSSDTK*

249 amino acids = 27,6 kDa

✓ ORF #11 3268 .. 3789 522 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MEASQTTANAGHLEVHVAVLPGEVHEPLYGLGYVTDVTGDQPPTVGPVLGGQGIGHASRPFPYAHFCTLVVSCIEGSTSPVDASIVATEH

EHHVIGFHQLNPPNLLRGPLPRWLISWFRTGISHLGIRLDFFTGLGSWSSMWAIILSSSAVMSMYTMSIFQPLYLRTSSSLFR*

173 amino acids = 18,8 kDa

✓ RNA polymerase small subunit 4987 .. 5919 933 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTITHMLPEDMQRANEYRFARAHIDGYIREFIRGDEDLPGLMEQGVALLEEYRTTEYSYNSKNLRMETVRNLDLEHIVFEIIVASAYCQVP

DMFISFTAKLAGVLGFDDKADSIKTIAEMVAVLAELDVYDIEQVSKYGTYKVISNIQLPEKLQHAVERAMYLPPMVCKPSKLTGNKSKLHLT

LEKESLILNNNHHNEDICLDVLDKMNAVELCLNTEFLSTVEEESHKYLDTQDKKDDWYRFVSESHEMYKLMVQQGNRFYLLHKYDKRGRV

YAQGYHISTQGSPYKKAMLDLANKKVVTGVPEHLKIK*

310 amino acids = 35,9 kDa

✓ ORF #5 6708 .. 7994 1287 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MASSDLVNDIVEDVAVGQFGEDVDVVLAHLVAEVRVALELIVHGDQFEGFVNPHGVPQGTQSFQVVSLQLTHVDSVDVVEDHCIDHVGA

VVQVFVDSQLGVQGFTGFTLTRVTVHQFSPNQLHYLGDGFAVVVAAAVHGTQHVGVDGVDDVGSILHSTLYTAVLLVDVLEACTFHLVY

FHPSLEHVRGLDDGVEVVRQHPGVLHGIGLPSVDQVIPHLVGDGSYHLHALVEGFQFRSVLTEQVLRLSLRAIEVGHGCSLDVRPLDLTY

RLTQVGRGGSGDQAIRILTEASVDEVGGLCTRFTATQGGHDLHARAAGIQPYKVADRLTTLSSTDGHDSLEILRTSLLVALQILQVVEVV

VAPLDTLFEEPLVMAHLVCSVDQQVFESGVRGHGLVPIKRRWIGIKDRRWSTVLEVLSVFPRYKLQACTY*

428 amino acids = 46,4 kDa

✓ RNA polymerase large subunit 8614 .. 9240 627 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MQVRNFTYEDGGWVLDGMDTFDPGDSLTVIHDSFEHIDSTEGLEAELRAFGAMWWLRGETDWWCRFPRMDPRPEQVMYYDIATFIR

ENDFLIDNVGKRFKLGVDEESFLDVLRKLVEDALERDSQYLDKPVARKVIQEAASTAMDWLRVGYRAARRKYPDNFAVADLMYDIYCRVY

ALNFRALEGSMLQLKYTLNGKLVEISLDGEPI*

208 amino acids = 24,3 kDa

✓ hypothetical protein 1 9791 .. 10 372 582 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MDKITWFRRGEPIEVPIERCLYFLADGKLVQFLYYDERGLFQIAHVTGISVGKIYSAVKGKFVYVRHGFIVKNERVGITLGHGEDYRRPVC

VYVKGFEHVRGSLTAGAQELITAQLLGDHVRLCTKQNIGGTLVMLPGEPGERVRKKVIIEEIGTDIHRNWCGNACFEIAVIDKHGRRYTEL

NDHFQLYGVNK*

193 amino acids = 22,0 kDa

✓ hypothetical protein 2 10 372 .. 10 890 519 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MLMSEDKFQYEISAMKSKMKRLRRRVEVLNNKRDILLEDIDATNKMVENLSGQVETLLREANKVKGPVMQPGHLHQSDVLLTGQNIQGM

MDSGEAVAQFEVKKGDDQTTTILKDAVVTQMSNKLAELLDALGFGKEHVQKHGLDETVYDACLYIQSLKGGEALLNNLRSMLK*

172 amino acids = 19,3 kDa

✓ ORF #7 11 731 .. 12 432 702 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MDQCNRLDIMLPMTEVNCASLTKEGYSGLSLSKALAPLATLGNVPNVVFCDEMDKLFLSGNSNDSHANEISIGVQNEFLRVLEGSTTQTFG

DYGKYNTVSVERSLFIFAGAFNGQENMDATELLKCGVKTEFIGRTGLVYNLEKPTLEALVQYLKESELWANYRSLFPKEDHKKAEKWLIKEI

GHQYPDSNIGVRLINTLIHQYYINAGEDSKPQAGKKEFARTLDFSTGRLK*

233 amino acids = 26,1 kDa

✓ ATPase 12 703 .. 13 773 1071 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHFPQEQEVSIFDAKFIAEGFLRAGLKPMIHGSPGIGKSAVACQIAKENNLKLIDLRLTQMDPADLNGLPNLSGERAKFQVFEQFPLVGDE

LPVNPETNEPFAGWLLFLDELTSADDDRQAAAYKLILDRQIGNEDLHPKCLVMGAGNLETDGAIVNPMSSALISRLHHIVVRNDLKRWLQ

VVAPKLDIATKVQAFLEFSPRAFYTFDPQNSGRVYACPRTWEDFSKWFLKMSPEQDPRALDDMLNLAAAMGIIGTVATDFKAFLAYFGRL

PSLEEILTSPSTIYVPKDEPGLMFAMCSMLADNAKVDNIEKILIFLDRFNPDHMVITLRMACQRNKGLIQNPRISEWVKKNLNML*

356 amino acids = 40,0 kDa

✓ N4 gp25-like protein 14 302 .. 15 528 1227 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTDRSAEDIALSKAKIRIIGDSKVSFYANIMMGLKYVWEEGMGTAAIDGVTMFIDPKFFLSLDETSRKAVILHEIEHVWRHHIGETRRGD

RDPMLYNIAGDHVINNNLLACGYGPISWTDYKTGAKCNWVCDPKFADMSTEEVYDALYQEQKSQSGGGSGALDQGNSGNNPVPFDDI

SRPTPTKEDGTPMSETEIQGAINDLILSAATAARANGNPGSIPGEVQVFIDSLMFPKLPLPHLLRQFFQVVKRGGFTWARPNRRLINRYY

LPSRRGKALLRIAIAMDLSASVSNEEIRRYLSEIANIFVTLKPAQLDIIQFDASIRSVDTVPNLNALMNMELKGWGGTCIAPVMQWAAENK

PHALVVFSDGEFHHYNDNPGVPILWLIHPYSRKSNWKAPYGQVILFDPKE*

408 amino acids = 45,6 kDa

✓ putative RecD-like DNA helicase 15 447 .. 16 784 1338 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MVDSPVQQEIELESPVRASDPVRPEGVGKPAPFVLTPGQEAGFQTFINFYTNPDAQVMVLKGWSGTGKSTLIRRILDEMESLDRALSTL

DDNFEPFEPLLTATTNQACDALAVAMKEFNHEVKTIHRALGLRLRTDYKTGKSELMPIRNFDIPFRCLIVVDEASYIDSALLQFCFDRTYCC

KFIFVGDDCQLTPVGTNIMPAFAMKDIVVELTEVKRQNSGPLLDLCNAFRHTVKTGEWPKIQLDGDQLIHVPRDKFVEMAEEAFQNPQV

HGSTKVLAYTNACVTEYNKHFSQLLLGSSDPQVGQKMLVNEAVINKHAQLSNGSEVVIEDIRPTREFDVDGYLVKLMHHNSSFFLPKSLK

DRKDREKLARKEEDYKILQLIDQNWVDLRPAFSCTVNKSQGSTYDTVFIDLDNICGKVHRPNALARLLYVGFSRARRRVVMTGDM*

445 amino acids = 50,3 kDa

✓ putative DNA polymerase I 17 311 .. 19 926 2616 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MKYITWEEQDSYPVAILIKEAAVSRSAAESTYIKQLEGLGVPRKNVIVISLDYEGKKVSAKAIKECIKDRDQLLRDLGVQYAYVADSKYFK

EWTKRKTDADFGNLSPPAGYDPGYLVTPGVNHQVLLFDPGQMHKLSRGFKAIVDHANGVYRPVGSDLLHNVTYIYRGHVSQAREALAR

LMDKPEISCDIEGFSLSMFDSGIATIGFAWNEHDAVQIQCDYREMIQDENKHHGYYEPNAEMREVLKWFFTEYPGRIIYHRANHDVKVLI

YTLFMEHDLDKEGMHRGLEIMTPRMDDTKIIAYLALNSTADVSYSLKDLGQEHAGNWAQDDIKDIRLITLDDLMKYNAVDAVTTVWVKN

KYYPIMVQDQQDALYHGLFKDSLDLIIQMELVGMPMNPRKITEVNTELNNLRDGYHNTVMSHPAVAKVEVLIQTSEMEKANAKLKTIQHP

LSKFSHIRFNPNSGPQVARLLHEVLDLPVLDVTATKQPSTSGGTLKKLLNHIKAEPYKDLIQALMDLGAVEKVISAFMPAFKAGRMKADGM

MYLHGSFNLGGTISGRLSSSDPNLQNLPAGSTYGKLVKSLFCAPPGFLFGGADFAALEDRINALLTQDPNKIKVYTDGYDGHSMRTFAFW

PDKCDGIVDTVDSINSIQKVYPDLRSKAKTPHFLLQYGGSWMGLVRQVGFSDEEAQEIETNYNKLYRVSNEWVAGEIDKATKTGYVELAF

NLRLRTPLLGSTILGLKATPKEAAAESRSAGNAVSGQSWGLLTNRAAVEFRKLLLDSPYKLKVEIISLIHDAIYVMWPDDPDVTVWVNNTL

CKCMAWQEDPKINDKRVPLGANLDIFWPSWREACTLDYPITKERLIEQCREHAAALKEKAA*

871 amino acids = 98,1 kDa

✓ DNA topoisomerase VI subunit B 21 354 .. 23 873 2520 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MQVTHQKDYATHVVIGGKQAISMGISDDPAFFQVLSSSLYTDKILAVVRETLCNAYDAHKMVGIEKETPVEITLKDDEFVIRDFGPGIHP

DDVGTIYGVYGGSTKKHDGSQTGGFGLGCKSPFAYVDNFQVTIHHEGKTNVYRMQKASIQNGGRPAITPVVTDIPTDQTGLEVRINIK

NEDVRRFGTLIRRIVANAEMLANFNGVKLPTLPFSQVTEDWSIATEQVLEYNGHIICVRYGDVIYPVERDEFIAEVYDPAHKFVNSLPGNVN

VLVLQAKPNSVSITPSREALSMEDHTRKTLLQLLNKFLRATRNITKERSDILAKSCEELVQARKGAMVQPEEVNANRVLVSSMCGSKLCTK

GLMSTMEEVGLSQLYHSHNRSEKEHFKALLKQLSLIGKQPRNQGNTLYLSFIRLLKKVGLADGISHYERSNFGELLRFNKSSWQALEVQK

WGQKHLVSKLLPLIHEEGLCPTRLVWYGFGRNLHNGDSVRNYNNHAAYPLVRYWSKNPMSYVPLFRRCIVLTHSRRDIHNRVKDHDEW

VGGYGADDSLIAYVVPRSEKKLQEARKALSTLKGWSVIDLTEEYEKVEYSSASSSSTTVATKPRKKGYPMLSACQSSGIFSLEMARTDSV

ARVENPSYYVRLPTKSDYYTRKCVRGLDKVCSAYLLKNFGDVGAVVYTETQEANMEKKGIKSARDFLLVKLLEEVEKPEFSKACSLRYTLLL

DAAKEPEYVDLIRKMMQVEECRKVFKLPEPEDPAAEELLTTVYSMDSRFFTQEQKESLETLGKKIKAIPGDKQVLEMLKKISEAPLVALLNT

SEVRRALGDKKTVTSAVKLLKTAIRG*

839 amino acids = 94,5 kDa

✓ lysis inhibitor 23 885 .. 25 663 1779 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MSNKVTVVGAVLDERYLTLYVKGSAEQIRIPQGDPRVAVFVEKYVPILSQGGEVDYSEDLLVINNVYEAAEKKSGGIMRFFRVAKKKVAEFF

SAASASEPAAPVAPVTAGAVPGDCAPDTDAGQDVGEEVVEKVTIKDPALAKAVDDILAHAVPASAPQFSSVDLENLSEDGVESEDPDDDV

GEGDTIIAVTDQGTIVPDAQKLKTQLTAAVQSKAKGSTVGIENFLRRAGAVSVKRQHSVQDLMRFIERGDLPIADDGCIVIYKLLLKGGP

DGHKEFSYRDIHSQKVPQGVSTLVCMNESLVDPDRRNECSNGLHVARRQYLGSFSGNVCVLAKVAPEDVIAVPSYDANKMRVHAYHILF

ELPNEAMVALKANRSMTDIKEASRMLGAALSGQHSEPAYHVEITGHRGSSIVVHKGPASTKNKVQTAVPKNAPEARSLPTKPNEVVGEKV

DVLDVVDTVMTETKKPEPEAPSLTKDVPVAEPKPVKAEKKSKSRVPARKAKKLKSVKVEAKPVAQPVQDTFKAKGKPLPSDKKTAMTLVE

QGQVLWQAFVDSKGDKAKAQACLDFKKAKKKGWTVLGMPGDAADKLAKALK*

592 amino acids = 63,5 kDa

✓ putative tail fiber protein 29 803 .. 31 995 2193 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MTTKVIFTFHSPDGSPQANEKFTVRLTRPGMSDAEHCVVIPETYEMVTDAKGEFTMDLESSTSAYRVTAIGDDDEYEDDPCSQYTFTFYV

PDSVDPVYVQELILMPPPNNLPWDEEAMNKITQAVVDARNARDDAEESADRAEAQVGLAAEQVTLAKAEVTKATAQADRSKAEADRATT

QATNAANSATAAANSATQANTQANRAKTEADRAKTEADRSKSEADRARDLADAVAEKVEGGSLPPLVGMNETFTYEGTDPYRWTVSGPA

TAVSDGNVMRLTKTDGSGSRAFLRQAVTFPDSHWIVYMRVKTQTGTAAQNRSAQIRFIAADNKDCVVYFNVNANGLVEPNTIHMQGTE

GGTRNAATMFTGLGTEDWLDLAVKYDAVNRHIELFRRMPNGIWQKGGGRLMVDAIKPAFIEVSSMPVAPQNWWLDLDYISVCKPNLIC

YGDSIAAGQNEYGVTRGNNPYNNNRNWAGTWFGKVPLYATNRNNLVLVQGVQGRRTWQYLSQLSEISNSGVKVVFMHASTNDVKDAT

MTMAKRTSDTQAIIDQLHAVGAQVVLFNSMQGTKAYNDASSNTVKLRDYTDQWWNTELPKVNGLAQTLDIARLIAKDGYMDPDLAAS

DGLHLTNASAQKIAYKLGQFFSNSSDTNGFASLDSPAFTGTPTVPTQTPFLPYGRLSPTPSTWLRSSKTGLNGTATVNSPWIAAPVLSCL

AEVYVAATTMFPLVQVTPCLLA*

730 amino acids = 79,5 kDa

✓ tail fiber protein 32 998 .. 34 287 1290 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MVDTCNINGVCGTGDWNGPKPGDPNMNDLLLKATPAFGGIDIEFTWPTTNPGAVGTTRLFRSTDANFAGATIRAFVNGNFYFDKTDPGS

KVDQRYYYWIQLVSINGTDGDIIGPATATARPLIEQMIEQLTGEIDNGLLSQELRKEIAQIELNKLGITQEEIERAKNDDALGVRLTQIDAK

MDQNTAILQEEVRARVTADSSLVQTVNTMYADFNGNIAAIQQENTALATKVNALASSVTTINATVNGDSASGKVGLVAEVQTLDGKVTQI

GARWTATVDVNGLVGGFGVYNDGRTVEAGFNVDRFWIGRPGTPKNPGSYPFIIDNNIVYIKEAAIQKLTFDKLRAQDGSFIVQNGKIQAD

YIEAKDIVVNNIQSDNYQPGVQGWAFRPNGIMEINGTAGTGRMTINNATIKVFDQAGKLRVHIGNLQA*

429 amino acids = 46,4 kDa

✓ hypothetical protein 3 35 487 .. 36 497 1011 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MGQIYTNQTGIPMAMALWLASDYYDYSEAGLSATTLMKPIRQVVLARRIKPSDSMADIEGMIANRMGAAIHDSIEKAWTMNKDRALDA

LGIPASVAKRVLVNPTEAELKAFNEANEQPAITVYMEQRSKKEYAGVTVSGKYDFVADGQVEDFKSTTTFSYIKDTKDNDYILQGSIYRAL

NPELITKDTMRIHFIFTDWQKFMAKQNKDYPQSRVASKVFNLMPIAETEEWITNRVKWLMSLKDTPEADLPLCSDEELWRSQPVYKYY

RDPAKADQKGARSTKNFDSLSEAMAHRAKDGNVGVVKTIPGQVKACLYCPAYLLCTQKDMLIAKGDLIV*

336 amino acids = 37,9 kDa

✓ phosphate starvation-inducible protein 37 741 .. 38 580 840 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MPRKNRNSQSNQHSQGNRSQQRSRKDRRQNETHAGLHAQADLDIAAHEAAKLVKARDTSPVVGRNPNQKEYIKGIKHSPITIGDGPA

GVGKTWVVAALAAEMLELGEIDKILLTRPAQEAGEKLGFLPGEKEEKYEPYLQPFREALEERLGKSTLEYYLKVGKIEGAPLAYMRGRTFKN

TLMILDEAQNTTPVQMKMFLTRAGEGSRIVVNGDLAQQDTYGVSGLLTAKKKLGWLPSVKLVEFKVADVVRSGLVQEVLEAWEAPDLPP

NELDSHVKEVA*

279 amino acids = 30,9 kDa

✓ putative DNA primase P4 type 38 846 .. 40 423 1578 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MDKKWFDYRLLHPTVATYLFAQCYTKGYQRFIRVSQDHERAAFVKGFKGYARRCFFGMAGEGKKVDMTPEEVYDLMTKNSTSTFIEDL

CDDLERLADASNMRRVLTMDKDTALLSIEYKLKCEKIAAGLPEHQEAKKAEVTHRYFKALKLAGAYAFVDDSPVLTMDHLYAAIKVAEESG

ECFDMLMTRDRPYVKLAKYLAATNAETTVAELDEDLPFYRGSRQQKDDMLVMATAWGYKNNIIIKKTYEQDIMFLRGEALQATDIHDKS

MIVAYSQDIAYGYFNDLATWDDLWKMTQANGIHWINHHLNGGEDRKGHRNEENCRVGFNLLVIDIDHGCKMSTAKEFLKGYKALLYTTK

RHQTENNGDRFRIILPLNYTLKMDAKEYKEFYNAVIESLPFEVDDGVGQRARKWLSHAGHYEYLDGELFDALPYIPKTTKDEERRRNLKD

QASMDKLERWVINNTGDGNRNNMLLRYAMILLDAGFSVNAIHGKVNELNSKMADKLSEIEIASTIMVSVAKKAGANGN*

525 amino acids = 60,3 kDa

✓ putative single-stranded DNA-binding… 41 233 .. 41 979 747 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MFGNLSTSNNSDIKEAKDSIGGGSRIFDTDIYAFKILAAYGSESSGGALAVNFEFEEHGTGRKLKIQQYVTSNKEKGQTNYYVNAEGEKHY

LPGFNIVNAICLMTAEKELAACAPEQRTLKIYDYDAKAEVPKQVPVLTDLTGKDIYLALEKIIENKRVKNEATGQYEDSSETRESNDVAAVFH

FGTKKTLNEARAKAEPEFFDKWKEAKAGTVRDKSKKVAGGGAASGRPAPAGGQAGGGKPASLFS*

248 amino acids = 26,8 kDa

✓ ORF #21 46 945 .. 48 795 1851 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHTGVAHRTSQQANLTTTTTGHQNLVGFQASTLVYLHITSNSVAALLEVGQVTAVYGQHFDLGVEDVRYIAIGVQTFGALEQGILGALT

QAMMHGQDQIHTVAIGTVGFGLQHFTGTALHLGTRVLPPIDSLQLVQQFDGFRTICLGGLEHTLGTKHVCDVRTVQHQVRTDVAANH

TVVSQVLHSTQVILTIRQCQKLVFEVFAEIGELAIVQKDFLQPIHTQSFTQVAHVGTQETLGQCSTVFSAQVLTVVLEALIDHRSGVLDVL

LTSHLVGLGLLEQSVCSEVTLVCSTHLVHYLHGHAVLALESVVTDASDTVQDQANTLIGDGADGLASYPNEGAVRLSEEGRFSDPVQVVL

DGFTSVRQGSFHLVQGTHFLVSQTATTLGFDVYQTIHQSEQAALSHFTRTGLVVQLTQTGKQATEHLHQTSSQWHTSQGLLAATGSEL

KQIRYFLARYTQGSKAAQVVAAGTHTLRTEQEVVLLLGHILLCLGGLIPLAREEVLRSQSILGFTPQILQAAAYEDTVVAVQGSGHSSLD

LLQHVGFLRADNERRSQCLRGEWQAASVQGLQDSISGGQCLATSNLVAECTHGTVKLGDDAVQDRLQLVAVSLGKRGLLAL*

616 amino acids = 66,1 kDa

✓ ORF #22 49 108 .. 50 733 1626 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHVRHSVGVLGRQTTVLAQHVASTGTDHLQVVDHTPGHGIVVGVGLLLVQFTLDGTAQAHMEQFVGQHLFGDARLDELRTLHIERFEV

ALGCIPATSLAHTLTDGTVRASGRGDQLDRYIFTDGPESSTQYLLAERVIGASYQSLSQTTSGQVIGFGQQIHQCLVRRSYRLAQFTPY

RGLGTAVLLNGLDHLSSTIFRQDFLGRLQAQVGLLHHLGYLLDVLLQLTFSLDAVHGVQRSSRSQGLYRVIAQRLTSSGLGFTRSSLQLS

VDSISHRFRFRVEGATDLFAGLHSSSTVSIGDDVATAIGGVLTHCTHVGQHVQLVGVSLFSDVTDAGQLSGDGSFLAFQVLAELVCNLRIL

YPLAEASKGTLEGRNHLTGCRVVQHQLEGLLVQTLASSVHTQYTHTVSIVDVQDIFTHQCIVGDERVTCVGSSDERSYTRTFVDGGHAT

GTEALHGLLTAFLIGELQRFSEVDFRAVQGRVVQFTTSLRHQHPRIQVTTSFRESGVQDRFHVLQLVADLVDLSTSEVSEGLAIIATRQV

GRSQ*

541 amino acids = 58,8 kDa

✓ hypothetical protein 4 51 796 .. 55 659 3864 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHLAGLRVDHVGSQANTLRLPHAPVEVQRLFHAKVRNLLDPTEELVEVVDLTHQTIVLGLSASTVGLVYEPTFDVYSTSDGGQCVLGQVA

PHLVHVLTKTHGTLTCVVQDLGQFLGNRLLSTLGILLCERHRSEARLSLTFSRTEQLGQDGLATGIGFTDLASNCTRNQLAIYTLTDRGQ

EVVLDTRVGRFVGVHQGLQLGIAHSGDLGHAHLHQKSQGMFTKGSFQSSTLVHRSIRQDFQTKDINDLGTQLGSCGGLASTYVAQDC

IGSRRDFFISVLAQDGIDTGIGVHQVVGSIDSPVVRTVGNGGGQVLVQSTVSIHQELSIVPEVVTSGVTGLRGVWLQRTLDDRLGSTLE

LHELLDGRLLLTSEALHTSEFSHAAFTSTDLGSEVFDCYQRLLSVTVVTCRGLLEESRNQIGSLVVLSSNFLATHSFTLTDSREFTSFGLGS

RFCLDRLGFTDWDIFSDLSDRRLYRGHLFSYLYGRFLCGGSFLHHRGRTSNRTSLDQFTQGLSRARQCSGFQCYSITQLEGASGDLQ

TTSRLQLAGSHGLRCFGPVASFITYDTDGVVGTLDLLIRSVDGIELRHTTVSEGTQLVYLTSSRFFVAVHQSHTHSVAVLRQTFEAITTR

LDVSAYTAQTREFVECNLCFAEATQGCTLLSGKGVAGVSYQSIYLLQAQSIRVDHGQGDQTLGGFRLDSSFLNQSLYLGSLRSGFHLETL

DGVTSSGQYLLSILQFLGLSLTLLRSDVADLLTYAAQVGQFFVQAGNGSFISTLLGLLTLFDGLLDLGQTFFTEQDLFLLQLGYTLGSFLLD

GVSLLQGTVLDLLGHTISHDLFLENYHCTSRVIGLRGHIGQGRDVAGFTGSIHSFTRSQSSLSTGSTRAGTYSSTATDVHGSADSSTNG

CSFDDLFQARVLQVGNVLTPGLVTLGHAFTSAGTKSRADQTTAFTTDTTQDASNGYLFSYCQGGSSKTHPQTIVSIRQLALVLGLVLGD

AFTVFIRGIAHVGSSTQYRVSGIGQHLRSVLHSVLADCQRVGCRCTDSGSSGLANTECTLHQAIQNLATAEGLACIAETFYATSSRISDV

VAQLVTASSVYDARPVEELVHVGRELAEFVHTLHALQHGLGNTVVTGSSLAQDGFIAFLHLAGDIAVVGFDGFVGYASLTHVSSSVDRQS

NHVAENTASTGYEGSSSVEDLSASSTGGDTHLADEGFFHVALLALADAVEVVSLLRTLHVQAHTGKVQSVECRALQPLLDDGRAQDITIT

AEQPHNGWLNLQIDITDATGNPQVFRQPVRVN*

1287 amino acids = 138,3 kDa

✓ hypothetical protein 5 57 303 .. 58 922 1620 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MQKIGDSTSTANASGEYTEGNPGAGVDATLIRAPWLNAVQRELVGLVQGAGIDLDPADDAQVLKAVRALAALALGKALPNNNPLPGGSL

DLHGASYAFVTAPSESSVCQNCYYSGTAWLRHDISRPAICVTVDGGQFYVRRAGAGQNPIIWQTMSPVWDASNAKFSGLLERPTTLA

GYSISDAFTKAETNANIETAIARLIGSAPGAVDTIEELARALNNNPNFATDVINGLATKADKATSLQGYGITDALQNVNPLPGGSIDIHGAAY

GFLSAQSEASLCQNCYWNGSAWMRHNTSAPAVSITADSGRVTVRKAPAGANPIAWGTVRELWDSGNATFANLSAKPTSIDGYGITDAI

KNINPLSGGSIDLHAAAYGFLSAQEEASVCQNCYWSGSVWMRHDTSRAASTLTVSNGQVRIRSVAAGANPIAWVTDSPVWHNAAVTT

SLSSSLGILALPNGWTQQVFEVTESTSATDYRYYPLEFPNGVFGVFPVLLSSTVGTGWGTNVGLVTGAWDKQKFVLNGGGSFSSEGRFR

ILALGW*

539 amino acids = 56,5 kDa

✓ IS3 family transposase 63 203 .. 64 633 1431 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MNVNNAKLQREANTQSYLDQVAASTLEQLSNADYRSGLEAQRDAMGMNLDRAATRDAITKQISAQQNQAAATQKFDDMQAEVGQRGI

VDQLRTLAAEGRAGEVNQILAEQQLINEGEIRKELTGVQDAIQNRQYRAAGEQRAQAAANRAAEAHSLSMAAGRENLAFTREQRDELRR

DRDEAKLVSGTIATTFQDYDESRQAQSEIMRIVGKEVGMPTDDQGMPDMSRASQDQLDAFSNALNEAGVQANTSPTERRNAALKSLVD

AGVSSKGIAQAKQEMELRESLEGLAPQDRTKVEATIGAVNAELDTLQRTATEDYEREVARNPFVEPDKDPLGSVNKIVDKAVKSGFGWEG

DRQDLNNMLVDFATNGIKLPDGRTAVVPSKLLEQAFNTTNTWLFNNAGDVEKRIIELMTTDGMTQMREDAPTIRENFLKTVSDIANQKRS

NAVKVTRSAEREKGVTMDPTDDLTFALRGRKR*

476 amino acids = 52,5 kDa

✓ N4 gp53-like protein 65 209 .. 67 431 2223 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MGLFSSKKKTVVNTTVQRVFDDAHIPDSPRTGVIQGITHETGIVENILEKLADSIGVRANTAYLWAQRNNYYWGLPESKVVNGVDARAV

VVQTIARSEGTITTYYNQFGPLNSLHWGFTELVRLYQYNPLTNELPGLSTTKGSKVYLFDMIPVFQTDTVAWADETANKGMLQDFGFSPK

SGYAPSRPYNTIGGMGQFAGWSPYRTDNSYGEDYVLLTYEWKDAQGVIKQETIRMLMNLDLSLDYHQVRYRRQNGTQGFFTYQDGK

GTYPLIDGVFNLDYTKQGTYYPWMYCRFNKMNVKDIPGNAYRDVKEVAKISGIGIDELIDGVHADPDIGDVAQVVLFYGVPPGATNQDQ

LTYIFEYLLLLHSEALAQIQKAENLQGKLGDYSNTADQMITMRDKYFKMDFSFSGITVNRKSGKVGPIGFINVKSGMADKSSGQIKTQQP

AYTYTRQAMDSMYDEVIIYNPAMHYQITSKKGHVAQLGQPELLIPVDRVVLSQLGLRAQEQLLCRSLHMAINTQVQIKTPWYASGFFK

VILIVVSVAVTIFTAGSAWGTIVAAASLGVAALTMVIVQMIVTTLAVSYGVKLFVRAVGPELGILAAVAALAVGAYGMSNNATWSENLMAV

SHGIAKESQTMEQAGLMDTLKELERNQTYYADQLQSLEDQRRELGLVQFQALQGEDFVNRPLAILGESTDDFFSRTVHAGNIGAASFQL

TEYFVDAKLQLPSINETIEEINNGLSVQ*

740 amino acids = 82,2 kDa

✓ ORF #28 69 344 .. 70 336 993 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MHRNLVVRVHGLADAGPVHHLRVDDDAEATQLADFAVHGGTTGSVLLDGDEGRIAVVVLHGFDGRNQIGTNVQSTGVAHGTGVDHAG

TGDHLDLGRSTRVVQVQTQTHQRVVGDLGGGVDFSVGGCSARITDGASRVEQVDLQQVFGDLVRALHHFGGDVTFHRRIAVEVELLL

GVLAEEAVLLQLALDLDTLETNTVHATADLGEGRHLRGDVAHVTARTVEVAVGDGSAGSVDTLVVHVAVVEQRDVVQSHDLFAVVLRHRE

GIGQLTEVRFLGGVDERALVPVAGMDLGTDGRLYPVRGVVVLHRLDVIYRTGHEMFSLFQFQGLLS*

330 amino acids = 35,1 kDa

✓ ORF #27 70 224 .. 71 627 1404 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MEDSTPFAGSLYFIGLMLSTGPAMRCFPYSSFRDCLVEAQLLEFFVRHRQGIELGRLSLSRYSFGRSRSPTFFFHSRFLCLGAGGDSLHR

FSGCFTLAFSGRGLNQIVECTLSLKLIPNRLICVQVRGTISDRAECLTALDLGVDSVEYPIGHVLFEVADDLRMFGNQLLRSFIQLAQRSN

HSVVGWTVLDGIELFVQCFTNLVEWYSSRFVIRNTLLIQVERIYTGIFSQLSDGFRFLVFEKIDHIGDSLRVQQTSIIQLTHHVQVRFERG

HLVVVVSTHLHQTDSLFRRLDLEITAIRFERCSDLRHEVSRIYLLLGSLGLLGFRFFFSRSIFRLFLVAVFFFLPRLFFSRFLFRRKIAEFIVR

RVERILFLLLFFFLLFISRFFFFFLDNFFRLHVVLLSLLGFFLIGASLLFYFVELGQIVVTHFEEVSHYSSSSSSRTRSSSASQSLMACSASSP

RTPISWK*

467 amino acids = 54,0 kDa

✓ putative portal protein 71 933 .. 74 113 2181 bp CDS

/transl_table = 11 (Bacterial, Archaeal and Plant Plastid)

/translation = MADVDEDYLTLPNEDGDPSKRLQPEWSNAPSLAQLKQDYQEAKQVTDEKITQINRWLDYMHVRGEGKPKTEKGKSAVQPPTIRKQAE

WRYSSLSEPFLSSPNIFEVNPVTWEDAESARQNGLVLNQQFNTKLNKQRFIDEYVRAGVDEGTIIVKVGWNYQSRTVKEQVVTYEMMPD

SSEELAQIYQTAAQIREESPSEYPEIPEDVRLGLEETEANGIQVRAVPVGSEEEEREETVENHPTVQVCDYNNIVIDPSCGSDFSKAKFLIET

FESSYAELKADGRYQNLDKIQVEGQNLLSEPDYTGPSEGVRNFDFQDKSRKRLVVHEYWGYYDIHGDGVLHPIVATWVGAVMIRMEENP

FPDKRIPYVVVNYIPRKRDLYGESDGALLIDNQRIIGAVTRGMIDTMARSANGQVGVMKGALDVTNRRRFDRGENYEFNPGADPRAAVH

MHTFPEIPQSAQYMINLQQAEAESMTGVKAFNAGISGAALGDTATAVRGALDAASKRELGILRRLSAGIIEIGRKIIAMNAEFLDDVEVVRI

TNEHFVDIRRDDLAGNFDLKLDISTAEEDNAKVNDLTFMLQTMGPNMDPMMAQQIMGQIMELKKMPDFAKRIREFQPQPDPIAQQKAQ

LELMLLQAQIEAERARAAHYMSGAGLQDSKVGTEQAKARALASQADMTDLNFLEQESGVQQARKRELQQAQSEAQGKLAMLNSQLKR

LDEATSARTSQK*

726 amino acids = 81,7 kDa

Ps. syr. phage 27 УЛГАУ

При анализе протеома бактериофага Ps. syr. phage 27 УЛГАУ было выявлено 34 белков с молекулярными массами от 19,7 до 128,4 кДа. Качественный протеомный состав фага представлен на рисунке 7.

Рисунок 7- Качественный протеомный состав фага Ps. syr. phage 27 УЛГАУ

✓ terminase small subunit 198 .. 1694 1497 bp CDS

/product = terminase small subunit

/translation = MVIALVDKHREVVRVIQLVGREVVDVDKAPEIYIPQVFEPYLYPAMVKVARGGRASAKTHSFIRIILARMQATRTHVGCFREIQKSIADSI

KQTIETVIEDLGLKDQFYITDKEISHVATGSKMVFAGLYRNVVSVKGMDWIDIAFCEEAENISEASWNVLIPTLRKPGAELMVCYNPKNAL

DATHLRFGPGVCKAWHYKDDGTKFRYSVTRQVNYTENPYFTETSRIQMETMRDDDPDLFQHIWLGMPNADSELAIIKPSWIEAAVDAH

LVLGFEAEGRKRVGQDVADEGKDTSALCYAHGSIVEDLEEWRDQDTNYTARRCYAYAKAVDADEIVYDSIGVGAGVKAELRQIMSKDVD

RNGGQVFDVRVYGFNAGGEVQNKNQVYRSGKKNKDMFSNVKAQAWWHVADRFRKTYQAVREGKQIHPDELISLPKNLPHLDKLKAEL

SRPRVDYAENGKVAVESKKAMKKRDIPSPNLADALIMCFAPIKADHKGMLTS*

498 amino acids = 56,3 kDa

✓ ORF #5 2049 .. 2990 942 bp CDS

/product = ORF #5

/translation = MAMPILPSSVTDPTGQDRRERGAIAEFNRRFKQINKGAQAILAAIPVTKKTLSVNVRGLSFALNAESLTRYEFQVDTIQMELIGEEIDRLV

DQWIEVRGDASEQWLNSGYVGPAYQQGTAMTFANLSAQSVQYKASRQSLTELIKTPEYRRRIGFVRGRVFEEMKGLSASVKTGLRNAL

SDGIAQGLNPLEVARNIDEATRVGEVRARRIARTEITTALRRARLDEAEQASGDLGLGMRMMQMSALSSTTRPSHAARHSKLYTFEQAR

VWMATSPNMINCKCSFVEVLVDANGKPLTPKIVSLAFAQKAKNGW*

313 amino acids = 34,7 kDa

✓ hypothetical protein 3018 .. 4436 1419 bp CDS

/product = hypothetical protein

/translation = MQNAITLPAPGTPMALALNSALGETRAAWARQRFGGPAYGMDDKRQNAWQAFGWKEHPTFMDYYRLWERGSLANGAVGRTISKCW

QDEPKVIRGAEDTDDREQSEWEVELAKFAKTYKLWEAIRETDLRRCVGHYAGMILQIADNKTWESPVRGRIKRLVKIIPAWEGQLTVSE

WDTDETSPTYGEPKMYQFQEGAVGIQANTASAVGSAGRNVMVHPDRVIILGDLVNGVPLLRAGFNDFSNIEKILGGSGESFLKNAARQLA

IAFDKEVDLEDIAAAHKVSMAGLKTLYDDVTRGLNQGIDQTVVTQGAQVTPLVASVPDPEQHFNVAVMSAAASIMIPVMVWIGSQTGER

ASGEDQKDWAATCQGRRVRVLASDIEKIITHLVRIGLVKPVDEFSVIWTDLTEATQAEKLGNSKLLGEINEKFASMGEVPFSIEEARTAAGY

ANKGRQRVVLPDQQDTGESEEEKEKPE*

472 amino acids = 52,1 kDa

✓ hypothetical protein 2 4266 .. 5030 765 bp CDS

/translation = MLFPAEGLPCVLALVVHAVCRPAKTLTSPCSTGLAKRAIQRQGHRRPWCWQSDSVLHWVPLNLRLAIVHRLNPVYLGGSYHNGDTRP

MKSTIVTRALIFLGTCFPLLLAYAFPAKADAFGLAGVISAYVVAALTALGIFFLEATRIGVGQDKVEDYKNAANILDKDPLGRSGIIFFALNW

GLFAVLLLSLNHIVPVAVLATAAFVSILSLGRLKRIVTIARLNPRAYYKIAKYRDSEAQKGWTEAKDKSQATRT*

254 amino acids = 27,8 kDa

✓ major capsid protein 5120 .. 6409 1290 bp CDS

/translation = MAVSSTLRINASAKVRNQDIKMIQHNGKDHWVIPSYTLPAGVVMNGGLYPGDEIDKAYKTLEGTLAPIGHPVVNSKAVKAGTAEAINSHY

HGVWNKNVSKSKCGRIYIEKWVDIEFAGRTEEGRQLLGAIEAGLPIHTSTGLYCEKEPVTNGAAGYSWIARNMRFDHDAILFDEPGAATP

DDGVGMMVNSAELVVNAVVPELTTNGVLKNSWGMKRDALNAALREVYGTNDNWVSVEDFDDTDVVFYSKEGVRMVSYEFDDGVPVLGS

NITELVSRTEFVAKGTVVGTNLSLQKNSVESEPSTTITQPEKTPDMDPKELAAALKDALAVGLAPIQEALTATNQAVAKLQSEADARQEQLT

ANAKKADDELRTAIIAADPGLEMVANSLSGEPLELLAAKTAKAAPLGAGASMTTNSKDGVAAFDNVKGA*

429 amino acids = 45,7 kDa

✓ ORF #11 6406 .. 7590 1185 bp CDS

/translation = MQGKRLVPEVQDCIVGGARRSQIDAHDGHVDLTGVAVVADALAVEAFFGHVRRAVQDVITHGLEHVAHFQRLRLGHGVHVGQLVTLPL

APVDTETGLENRNRVTVAGAVDVVVGDQALTVHGDFNLLVDVAGDRVRLEGVADVHRGGQLHQVGQQLTTLVVVTNGNGALVHRQPEL

WRELVGVVLDQILGRQRVAVHVNQALLYGVTELALVPYGLELPLELMGAMLLAEAVFLFHHVRHGAPLEHANFDVTAGNRGSRYGVGLEG

DGDGISRAGGDFQLTASTDGQQGLTFYDGNAGLDQSRKDAGFVNVVGGDAIADSDWVEDRAADLVVAASDVKRLDGISSSQNQSARS

ELEELARQDRHGRFADDGLRLAVDVDAMRALAHYRIASHGD*

394 amino acids = 42,1 kDa

✓ hypothetical protein 2 6871 .. 7962 1092 bp CDS

/translation = MSYVMEQKYRLGEEHGSHEFEGQFQAVWNQRKLGYAVQKGLVDMYGNALSSEDLVKNNADQFAPEFWLSMDKRAVAIRDNDKGRELLT

DLMKLATPVDIGHTFKAYPISGDIDKEVKISMDGQRLITYDHVDRTSDGNPIPIFQTGFGINWRKWKGHQLANMNTVAESQALKMRDM

FEAMCDYVLDGSPDVTEKGFDGQGIRNHRNTRKIDMTVVGIDLTAASTTNDAILNFWNQTFALHLDANYVNGKIDVVWVSPEIERRMNV

PFSNSQGFKGGTLRSFIMEFGRVGEFRSTYKLSGNEFLAYNRDQEAISPLVAQAVATVPVERRGPRDNYNFEIWGAMGLEIKADMNGRGS

VFYAAPLT*

363 amino acids = 41,0 kDa

✓ ORF #34 8951 .. 9520 570 bp CDS

/translation = MNGATVLFEPLFEKARLGVGVPVVPVPGTATELYAGLGDAKVSTRLALERALGVMHRKGVGSGVTNDGAPAVPVVAQPAEHGVNQVRGV

DRCEQRREGLPGCGASGSRSLRLDVYDVVGHCRALGADACKSDHWHQHALLKSGSGSLKNDISQFVWLRIGLAPTVVGLGSACSPC

AIMSPNLTRLSSWK*

189 amino acids = 19,7 kDa

✓ putative glycoprotein 10 537 .. 11 214 678 bp CDS

/translation = MHIITEIGEQGITIGEKTYILRPSFRAMTRLGEPDEIVEIFAAIHKPPNFIEHMEWDGVGVRSAGDTVSRTVFKRYWLEMLYLSRDVMIAC

CDEDLTPAIGEPGSRYGSYRIGPVSPEIMLAMARSLMQHGCIGPVAKAVQRSERSGSKSGYTREFNALGFVSKAIANLGVTESDAWNMT

MSSFHAHWEAKYGEPKEARYVDEHEATMSWLAKVNAIRDKGKTNG*

225 amino acids = 25,1 kDa

✓ tape measure protein 11 207 .. 12 286 1080 bp CDS

/translation = MAETVVGDIVYNLDVNTKKFVDGMQTADKNLEKMGESMDKTDQKAQQLGGGLTKLAAAIGGLVLIDKLRDLQKLSEEFTVLSARINRVSA

DSAEGAENYQRLLAISSKSGADLGTAVKTWESLTLSLREFGKTNDEILGVTDSIMKMGAIGGSSTEEMKNGLRQLGQSFSGGIVRAEEFN

SVLENVPEIARQIAKGIGIPFSELRQMMLDGKLTAEVVLEALKKQAAEVDAEFAKMPRTVAQASNAMTNNFGTMISKLDQTSGASANLAKA

IDIVAGAFLSLSGDANAIQTIFDGITMAGASRCQCHSNHLRRHHHGWRIARSHPGWSTPDGPVQRYSGESVDDARYHCQHRSAARS

SC*

359 amino acids = 38,6 kDa

✓ tape measure protein 11 207 .. 12 286 1080 bp CDS

/translation = MAETVVGDIVYNLDVNTKKFVDGMQTADKNLEKMGESMDKTDQKAQQLGGGLTKLAAAIGGLVLIDKLRDLQKLSEEFTVLSARINRVSA

DSAEGAENYQRLLAISSKSGADLGTAVKTWESLTLSLREFGKTNDEILGVTDSIMKMGAIGGSSTEEMKNGLRQLGQSFSGGIVRAEEFN

SVLENVPEIARQIAKGIGIPFSELRQMMLDGKLTAEVVLEALKKQAAEVDAEFAKMPRTVAQASNAMTNNFGTMISKLDQTSGASANLAKA

IDIVAGAFLSLSGDANAIQTIFDGITMAGASRCQCHSNHLRRHHHGWRIARSHPGWSTPDGPVQRYSGESVDDARYHCQHRSAARS

SC*

359 amino acids = 38,6 kDa

✓ tape measure protein 2 12 060 .. 14 372 2313 bp CDS

/translation = MPMPFKPSSTASPWLAHRDANAIQTIFDGITMAGASLAAILAGRLLTALYSATAAKVSMMRATIANTAAQRVAAAEAVRAATAEFAAARAE

QQRAAAHLAATSAVVQGSAARAAAADAMAAANARAVLAEKGLQAAMAASAAVAKTTSIAMRGLQTVMGFLGGPVGVVLLAATALYQFAT

SAREAKDPTDLLTQSVDALGNAQLRLQKIKLTEAIAEQDKLAKGSMWTQYKVNALKKDIAEAPEGSNAWKGYTKQLTEIEAESEGAREMS

AKLQEQLAKVNAEIGKRSGEKQVVNTPKRKEDPEDAKVRQRLQDELELAKLSGEAKARQAALQKLSANATDEERQKVSDLAAEVWRLDE

AKKATTKTDKEGAALAKKKTAEEKKGAEENKQAIIDYAIEIGKLADKTQDYSEASALAKLNKFATPEDVRVMRELAAAQAQIIEAEKNKALLG

QLDPMAGEDQRFTKQLEDLKKLNDAKLLEDERYLELKGIAERQHLETVRQLQEENFKAASLGNEILMNSIDAMASGATGALSGILSGTMSL

QEALGNLANTVLNSVIGAFVQAGVDFVKQEIIKRAAIQATQTTQQASMAAVAATQAGTTAAMAATTTTTAATTGASVAGSMAPAAGLSSI

ASFGGAAVIGGAALLATMALAKSFGGGRRYGGDVNSDSFYRINESGPEIFTANDGKQYMTGANGHVTSNADAFNNGGGSRPVQVIIEDY

RGNGADPQVSQETLTDRDVIRIVLNDMQSGGQLARATNQITGTKRPGG*

770 amino acids = 80,7 kDa

✓ hypothetical protein 3 15 525 .. 18 296 2772 bp CDS

/translation = MMTPKIPKMNSLAAAGQGKDLDSATAKGNKVKINQVRPEVAGKCRIYGNYAKPARRFFNDKRDQRVDLCLDLGVGDIEVLPSEIYIGLTP

VTSYGADVSYAIYRPGQSLAADRRADWWHDVQEVGSGSNGSSGLDMTESTELTKSYVAYSHQMNGYQVLIPSGAGNFPADWTAGLIV

RIVVPYQYNVIDDATADIIEGDNLTMLAPVVGQSIEIVGASGGFYTVRSFSPKVPAVPADPGSPAYSTGSAAPSTFNFTTTPANFTVRVGT

TDYPVTINTNTTNMAGLISAINAAKPSGAPFVASDVGGRVRCTDNASVNTGRALTITGDSRIFGLSTNAVAGVAATGGTPEVPPRMTLNL

NGQPAKSLALGQQSMCIGPAGLRYRLTAASTTALTVVRLNSTGGNDNSFPGFTYQETTGTVITLDQSNLQGGFRGPFACCPEGEKITKI

QWDVFHPSGLFGLGREGQIYDIRSFHRLEWRDMDLAGAWTQVDIEHVGGKQDAMGFTYELTLPYPMRAEARIVKRFVSQPGRIDNEK

QDEIVWYGLRGLIPRGRKVYPNSTILCLTVRGGDRLSAESEAQVWVKGTRRLPVRRGGVWQPPEPTRDIVPFALHVLKSAGYTDDALD

LEEWDALDALYRSRGDRYDRLHTEESTVQSVLEDCLNAGFARLTVKHGLLTPVRDESRSIFTALYTFDTQLEGEGLDIRFNMISGDDYDG

VDVQYTDQVKWQNDTVKCRLPGVPNPKKVKVIKAEGITERLQAYRYGMRDLMEIRYRRKTGEWASEMAAFNSNFGDLVQVGGECPGY

AQSHVMRSVSADKKTFTLRAPLDLSQLAPPYMASFRRIDGTCFGPALVTNIVGDRTFTIANPLDFDPILDQPGTVLPTYVLFGNGYGVLI

DEIDPEGTESARIKATFYDERVYTYDNAPLPAGA*

923 amino acids = 100,6 kDa

✓ hydrolase 18 788 .. 22 336 3549 bp CDS

/translation = MADLPYNTGNAIGSADPKDRWDNSIGLDYAMLSTTDYWKDRLGRNRRTLYWMERAATGIPAVSAAERAETAAAAAQLSAGIYDTTAAG

LAATTNGKYFSVPQPGNPSTALMLYKNNAGAALYITSYATGVASSLTINYGKTFPNRRAVRNGVDSADSTQLNEFVLDACVIGAEPGYYYR

IGYYVNGNPTYPISPDGWAIERIASANYETAANAAEDVVRYTDPAPTIGNGIQTITLTSVVYPDLKFVLTVDGSKRPARGTSITTRLPAYA

GYSHIIDPSVYLETTRRNGLNLNSGSIVPFKSMTRDGTVSPSNSLMFNAILGVTVINAKPGMYYGLKYFQNGNADAVPAADNWMIEEIKV

ADYATSAVIDPANLISTIQEITQPPISRSLGIQTITLTTKTDVRILVTIDPAQLPAYGTAVAMSSKGGSGWSHIIDPAFYQTKSDKGGEMS

YYIDANGRLTVNWLDTNGETRGYTFGINGANDLPNFFNFLKGTKIVSQFGTDMLPPMVLDAVNNVDADPYPIDFTGGNHTIDGQKTAVNT

IFDIIADGRLVSVKGTSGRARSLVVRITNRLMACNTVKSGRYVGQQNFVVSFFPGGAQVEAQFTPYEAVQVYIDYGPQLVTINVEETIFFF

DGQYASPIPYDPGANSGKPSEYPNTWAVVTTGADGQLGAWIDRSYGIAEAKNSSDEFGFITGSGAGSTSRKLYPTAIHQPLRRADGGI

QFMAGESYFWRGGYTWSPKVTRAGMVATMEYMLGGTVRRAEAATGSRTYAPDADWVAREVRRISNELDAVAKDVETIGVPPQELSEL

AKALRNPFHSVCLLGIGDSITYGSGAAYIPGANPVPEYDVPNAKINFAMRTWFNRFRENIGTTYGEGDVIQDGSGNGYYEKLHLVDVLDG

YKYADWYDGRTGFKIAMPVPVISASATFGKYLDLSTWIRPTVDVTGNNITVIHAKLTASDPAQAIVEVWDTITETKLGEFNWHSATPSFG

NRSAVTFPWGKYRVQLRTVGPIAQLRFEGFEVTQRIQARNIGVSGSGTMSWLPGSANMNNVAPEDEFVTVMLGTNDRGNNSLPLNYAR

TKANIKTIVNHLRSLGKTVIVMCANVAVGTAEYPNSPYRYSMSTVARALRESTQELNVSFVDHYAPTRKAYLDGEVIFSNGDYLHPNDLG

HKLINDTLTGRIYETEE*

1182 amino acids = 128,4 kDa

✓ ORF #12 18 797 .. 20 086 1290 bp CDS

/translation = MRPAATALARHGNGCAIGWQLRRIDGHQDPDIGFGGQSDGLDTEGSRDWRLRDFLNGRDQVCRVDDCRGGVIGNLDLLNHPVVSS

RNSVGVAVLEILEAVIHAWLGVDYGNAEDRVKHQAVTWRYRAVAGHRLERHNRPAVQVQAVAASGLQVDARVDDVRIASIRRESSGN

RGSARRALAAVDRKDEFQVRVDDRGQGDGLNAVANSRRRVGVADDILGGVGGGLVVRGCDALDGPAVRRDRIGRVAVDVVADPVVV

AGLGTNHAGIEHELVELGAVGAVDAVAHGAAVRERLSVVDGQRGGNASGVAGDVQRGACVVLVQHERGAGVARLRHAEIFAVGGGGKT

CGSGVVNASGKLGGSGSGLRAFGGAYCWNAGRGALHPVQGAAIAAQAVFPVIGGGQHGVVKTNGVIPSVFGVGGADGVAGVIW*

429 amino acids = 44,2 kDa

✓ ORF #14 24 820 .. 26 400 1581 bp CDS

/translation = MLELLPLGRQPVVAARGLVIDRERPIRRGVRHHALGVAVTADAVLVLHADHLVALRLVRVFLLALELDAKLGVRVDQLALTLFAVPCRDIV

VVPAIVVRARLGRPAISALVAEPVRVLMERLASSPEMGWHGKLFRLPLVVEFGAVDKDAVTGEVGEVPVLVDGVPLVILAQAELVGELALRT

HKISRRAGGATKACLDIRLEDIAIRAVLLKVLRVVEDQHMVFTLVQSQATANDLLQESAGLGLAQDRNDIDVRRIETGRENGDVDQVLEL

LRLEVFDGLLAVGLAGYLGVARDHPGQLWRQRAHDLLSVLDGRGEDHDATLVARLVNDVRDDCGGLAAIAHESPVDLAFDLGLAGAKV

DPGGVVGLLAERANHRRRQVPEVDQLASQDRVDLLHEVRVASLLVRHGLAVLVHAVDIAVTQHVWRAGQAYHANLGVLLADVLNDLAD

GLGHALAFVDDDQAITLANLFRDLDEGLRRGENHRVPQVLFAEAGAVDRRRLAGEQVLHIVLLNQLLRRRNAQGALS*

526 amino acids = 57,0 kDa

✓ ORF #15 26 499 .. 27 506 1008 bp CDS

/translation = MPKLHRSHSADTGEGCNSLFQFPANRGGATILFQVQAWQVLFNDLAVLDRAGGLGPREPTTADENRLVFGKGLELVKDFLFARRVVVDD

QLQLVKLRHQLLHMLAVKRFARRLQVVLVLGLVLVLRIEALKVGHCAIYLALVKLHQLMLGAQHRPLEEDAPRAASKRHFDLHLYGHVRLI

IQRVELAAVGNVALVERQPDKDQARAWVFVGMHHGWVHGQEFMRLLEIALDQCLAELRLECCLCCSAVAVGVLCRSVGNILAWHVVVL

THHFADHVGALAVFVHAEDWCHVAHGDLGMHLARGTLLGCNFLWGVLGHQVFGCSYVGFRHFVKFPW*

335 amino acids = 37,5 kDa

✓ putative phage-type endonuclease 26 550 .. 27 485 936 bp CDS

/translation = MSESDVAAAENLMAQDSPKEVAAKQRAARKVHPKITMGNVAPILGMHKYRKRSDVIREMVRQYHNMPSEYVANAPAEYADRYRAAAEA

AFEAKLGKALIKCDLKKPHKFLTMHPTMVHSDKYPGPGLVFIRLPFHKRDIAHRSEFDSLDDQAHMAIQMQVEMALAGCTWGVFFQWS

VLCTKHELVQLDQGQVDRAMADLERFYAEYKDETKNKDHLEAPRKSLDSEHVQKLMAELDELQLVIDNHTSRKEEILDEFKALAKDKSVFI

CGRRFTRSESSGSVQYSKIVKEHLPSLDLEKYRGAPSVSWKLEK*

311 amino acids = 35,6 kDa

✓ hypothetical protein 5 28 034 .. 28 786 753 bp CDS

/translation = MSLNFWDLGEGQKALEAGKTSIEVEGGGNLDMPIPAGTQVRIIIADAKWETSDGAGTYINLKYQVEAPACYKGRIIFHKLHVRCHEFPAA

RENARLTEEKLANKRVKALRMFAVIDANAGGKLLASGKMPDDVALQTNLSGKTMAMTLDVYEFDTDKDGKKLPNRIDWNRGNWVKKVD

PRTAFVDMTKEQQEAAVEASKREFEKMLNDAGGVRNTPAASGPAGGGGGMPGRPAGGAPAADFDSFDDDIPF*

250 amino acids = 27,0 kDa

✓ DNA primase/helicase 28 857 .. 29 828 972 bp CDS

/translation = MIIEAPKRRPPFITLLGEPGLGKTTLACMFPDPIIIRLEDGIESVPEQFKPSIMPVVTTFAELDAQIRWVFAKRKEHKRKTIIIDSITKAESM

LEQHLIDTDPNKPQSINQACGGYGAGPKALGGLHGYFKKLLDHANKAGDMTIVVIAHAATDTVEPPDGENYSRYVLRLGKHSMAPWVD

DVDLVGFLRLQQTVRGAKEGNAKGIGAKAGKVLSGGVRELVCHTAAANVSKNRFGIRDAIEIPDPMDNPKVPNPLLALIPYYVENGLAVAP

EKPKEVEPEPEPEPEQQHTPDLNTEMADGDDYSDAPSRSDVEPMDDDGPAI*

323 amino acids = 35,2 kDa

✓ ORF #19 29 157 .. 29 924 768 bp CDS

/translation = MTHQLADAARQDLASLGPNALGVAFFRATNGLLQAQEADEVNVVNPRGHGVLAEAQHVAAVVLAIRRFDRIGSGVSDDHDGHIASLVGV

VEQLLEVAMQAAERLWTSTVTAARLVDRLRLVRVGVDQVLFQHGLGLGDRVDDDGFALVFLALGEHPANLRIKLGEGGNHRHDRRLELL

GDGLDTILKADDDRIGEHTGQGGLAQAWLTQQGDEGRAPFRCFDDHGYWVSRGWLSFDRANSTDSDYSRQPLFQNNY*

255 amino acids = 27,9 kDa

✓ putative bifunctional DNA primase/pol… 29 996 .. 32 425 2430 bp CDS

/translation = MSTLSDALNFLDNGYRIFGLYGEKNGECGCSRPGCLAAYKHPTISNWQVVPEWSEEQLEGFEALGHFNTGYGVLVSGLLVIDVDARNGGT

DSYARLVEDLRLDFAASSGLTVLTGSGSGSMHIYYKAPEGVALIQNHKKYPGIDFKSSGFCVGPGSLHASGNRYETLFGSPKEIGVAPDCL

VELLKRPDTFRADRDGMQMDITTQEMARMLTFISPSCDRPTWISIGFALHHATGGSAFELWDNWSSGGDTYPGPQELRKQWDHMGK

KGSPITLGTLFHYAEQGGWKEEEQADVPDFPEGSWMAELAAGRTVAMMEKAEVIEAEVALYAEENGLDEAEKVKETIKRKLGNRPFDIDD

VDLLRPPGFVGEVCKWINGQSRYPRENLAVAGAIQSVGNICGLRYTDDYDGVTANLFTLCVAASSTGKEAVLNAVGTLHRTAGVARAVV

GSIKSEQEIIRNLIDNQAAYYVIDEFGIILKTITTSKEAYHTGVVGTMMAAYSKADSFLQLNGDTKREVRKILVNEQKTVRKMISENEGDR

DQLQRREANLDRAIKSIDNGLERPYLSMLGFTTPVTFESLVTPEQATNGFIGRSIIVTEKDTNPRAKPDFKKAKMSARMEATLMSLYAGLS

YDPDDYRVENYDEREEIPTTAEAKRMLDDVYEWGWQLAESHKEKTGLESIPRRAREMVSKLSLILAAAGRIRTAEHVRWAFAFIERDIRE

KCALAYANELEQTAGDEGVNQAIRARIMTVIDDKHGESQAVLINRCKKWSRAQVITVINMMVDKGQLVKRESIHARNGTKVEKYHRPET

EE*

809 amino acids = 89,9 kDa

✓ putative DNA (cytosine-5)-methyltran… 33 989 .. 34 798 810 bp CDS

/translation = MARTNRKGPSTPMAKVLIGYSCCGNTRAAFEKYGHDVWTCDLLPPRHDSQKHLQMDVWRALEMSWDFAILHPMCTYLTSSAEWAYK

DPDFKRYKEKGGYHQRLKPGTLFGADRRKAREEAVENFKRIMALPFPVVAENPARGALSTLMRGPDQVLHPYQAGDDASKATGLWRNQ

GDIPPLPIDPAAFVKPRMVCNNSTREDPHHSPYGSTQCIKCGSPKMLPRWANQTDSGQNNLSPGDQRWLDRSETYPGIAALLGDTYG

PWLNRKVA*

269 amino acids = 30,3 kDa

✓ DNA binding protein 35 057 .. 36 094 1038 bp CDS

/translation = MKCCALSQSAPPFTSSAFNGALPMTQAKITHAVATAKEIHRNMLKMEPGSVERLGARTYRDRHLTYARDMIDALALEQQPLDQRAEAAI

RTLERLGYTYQGGELWKPPLGVRRPIASAPARRKALHARIEFNPDDYRRQMGQQLASDELRGVFDYDPQPLRHTAQILPDQFARPVSS

ADIRESGFTTAQAMIDCLARAQHRVDLKGPLGYDHKVAACIRFSMQDPHGAFRPGQFISFVRRTDDVGNFVHERCIVLSAGVSGMRIA

NVDTALEWQIDGHTIGMGSSPSFHDRVSAVYPLMPTEWAQTCLDNYKRNWLKEEIRRLDEQSEYSKRRELMVELASVGMR*

345 amino acids = 39,0 kDa

✓ hypothetical protein 6 37 541 .. 38 341 801 bp CDS

/translation = MRGNIKVIGMAGMSENQKAALEQLKTNMDKAFEEQAVLDELLALPQPKIGANSHSAAEISEKIQTGNQACGGEVAGKEFVIHQLNSNDSG

DRPRRYIGRDVTLSWPADAPLPRHLSVQHEGVQVEDGRVVDMGRQVSMSYSMDGETWQEIGALQAKEFAVSWDEARPGDDVTAVQ

YRELPKTSPVLVVGGGRHGQVAALIAHMRHILLCARVTEMATRRGYQHIFSDVPRVDRAFEIETAKNVLPKGFRGVYSSTRSRAGRAAR

WR*

266 amino acids = 29,3 kDa

✓ Lar family restriction alleviation protein 39 216 .. 40 079 864 bp CDS

/translation = MACNHQRSQAFLHGRRAHDQARGLRGREVHMGNNTTGLDQGRVVDSLQNLYEEAYVDGQNAPNGYSCNKKRDDAVAAAMVSACEPG

HAIAGRVILNAEGVKAISFGDEQWASLQVGDVIYSAGMGVGLGHGDPVGEVVAFGKGLHEIAWAAGRMPKLGAKLYTHADPGEVERLAI

LLRQTQVKHSQERDTLRAQLAERVALLREVIDGKTRTQFDGNLMHRILMVLSASAEPSAPVERPVISGTALAEITTIIDEAFVAGQNGPY

YAEDCINWVDRILEQVGKRRDD*

287 amino acids = 31,1 kDa

✓ hypothetical protein 7 41 057 .. 41 878 822 bp CDS

/translation = MATNKLEVTMRGDMDSASLVARLIAQAVNGDLTGGVPLFMGYNINYTGMTVCPRIDLERRTGQDLEQEHEIIKRRLNALRAANRMPPVD

IWKCGMVDSGCAPIHEVLEHQLNALRTEYGLQPLAVSAQGVVLPPEPAPVELVAIKAPFGKIRKAIREVLGHVVEIHKGVKELVHLARDAE

TRRKGQTINVTDDPLHGMEIEVQLEQVRKRDPEYHFHFKGRTFKANTGDSLLNRREALRQAAMTPDCDSDTLAKLVASIRDEEARRAIP

KGRQ*

273 amino acids = 30,5 kDa

✓ hypothetical protein 8 42 994 .. 43 578 585 bp CDS

/translation = MQMKSNIRDYQLEAIADITGNVNLRNRAINEQRLRAAHYGRELGVQPCAYDSLDAIYEHLELTNDRLREAVERGEMAKRFLLDRARVTLS

QMYCERWGRLEAELKTLRRWGLVNAKVAWHQANADQKRYGVMLAYAQTDWVDQSAVLDAHRSLQCARHCRDHRPPRTSADLIGK

YAAIQIQPARNLGKTISVKV*

194 amino acids = 22,4 kDa

✓ N-terminal domain-containing protein 47 793 .. 48 803 1011 bp CDS

/translation = MQECKMIKRTDSGQMIQLKHIYDKTREDGSLWNRRDMESPETKAHIQDIITHLQKGGIVPAIEVQPREGGGVEKVDGHCRTEAYKAID

ASGTGELWVSIVPFKGDTLKALARIKTSNHDRKLTPLENLDLFKSIRQELVDMGEKGSLQQIADEVGCTRQYVDQILKLDKLDDEGKQAL

SEGKINAAQALKVARTGVKEGKEAAKAALKTEVKRSAPKPLTASRALLDDMYVGMTDLFYSVPAEAKTAAAEFLKGDRPATDMVRIPVGEL

AKLMALKAEGDRQIEAAAERQMQKAEKAAQEEMGSDLDPVQKAAEPEPKAEHAEQPEENDEPDLSFL*

336 amino acids = 37,1 kDa

✓ DNA polymerase 49 318 .. 50 085 768 bp CDS

/translation = MAIKDFFGCILDTETTGNDPETCKVIETARLAITGSPLEFMKIPVEDSIMDGQLYSPGDAPFAFGAMAANRITPSMLEGKPKFEGFSYYGKL

VVGHNIDFDQRVTAYNVQHQICTLALSRYLWPELDSHSQSAVLLYIGSITRKGIDWAMDLLKNAHRAQDDVQNCARVLKFIIFTLSRSP

EHKHHVESWEALAALSLDCKVPRHMPFGKHKGLPIEQGGALDQGYVDYLVNNGNTDRYLMSAFRRAGFNVPENL*

255 amino acids = 28,5 kDa

Согласно проведенному анализу бактериофага Ps. syr. phage 7 УЛГАУ — было выявлено 29 белков с молекулярными массами от 18,8 до 138,8 кДа; бактериофага Ps. syr. phage 27 УЛГАУ — было выявлено 34 белка с молекулярными массами от 19,7 до 128,4 кДа. Протеинов, являющихся факторами патогенности или их аналогами (анализ на основе филогенетического родства) в составе данных бактериофагов выявлено не было.

2.2.2 Подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов (разработка количественных и качественных параметров культивирования, подбор методики очистки биопрепарата, контроль стерильности)

Разработка количественных и качественных параметров культивирования. Для определения количественного соотношения для бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ и их индикаторной культуры Pseudomonas syringae №3 было необходимо подобрать оптимальное соотношение для последующего культивирования на МПБ. Для этого была разработана схема постановки эксперимента, отраженная на рисунке 8. Варианты эксперимента – индикаторная культура Pseudomonas syringae №3 вносилась в пробирки с 4,5 мл МПБ в различных объемах: 0,2 мл, 0,4 мл, 0,6 мл, 0,8 мл и 1,0 мл. Объем суспензии каждого фага варьировал в объемах от 0,2 мл до 1,0 мл. Время экспозиции подбиралось визуально, ориентиром служил контроль культуры в МПБ. Температура культивирования была стандартной и составляла при (28±1) ⁰С.

Рисунок 8 – Схема постановки эксперимента по подбору оптимальных количественных соотношений фаговой суспензии и индикаторной культуры

В таблице 8 представлены результаты исследований по подбору количественных соотношений выделенных фагов и индикаторных культур и технологические параметры их культивирования (временной интервал) при концентрации микробных клеток равной nх10⁸(КОЕ/мл) бактериофагов, специфичных для бактерий Pseudomonas syringae. Температура культивирования в условиях термостата при (28±1) ⁰С.

Установлено, что для выделенных нами бактериофагов Pseudomonas syringae — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, было подобрано универсальное оптимальное соотношение фага и культуры для пассирования равное 1:1 (0,2 мл фага: 0,2 мл 18±2 часовой индикаторной культуры при концентрации микробных клеток nх10⁸ КОЕ/мл), временной интервал культивирования в условиях термостата при температуре 28±1 0С находится в пределах 3,5 часов.

Таблица 8 – Подбор количественных соотношений выделенных фагов и индикаторных культур и технологические параметры их культивирования

Подбор методики очистки бактериофагов. Метод очистки бактериофагов от бактериальных клеток мы выбирали из трех методов

— ) трехступенчатой фильтрации, включающей:

1.осветляющую микрофильтрацию через мембраны «Владипор» марки МФАС-ОС-3 с размером пор 0,8 мкм,

2. осветляющую микрофильтрацию через мембраны «Владипор» марки МФАС-ОС-2 с размером пор 0,45 мкм,

3. стерилизующую фильтрацию с применением фильтрующей насадки фирмы «Millipore Millex-GP» с полиэфирсульфоновым наполнителем и диаметром пор 0,22 мкм.

— воздействие температурного фактора в диапазоне 40-60 ⁰С — степень устойчивости бактериофагов к воздействию температуры проводили следующим способом: исследуемые бактериофаги прогревали на водяной бане при определенной температуре в течение 30 минут. По завершении обработки бактериофага определяли количество бляшкообразующих единиц фага методом диффузии в «мягкий агар» — метод агаровых слоев по Грациа;

— обработка трихлорметаном — определение чувствительности бактериофагов к трихлорметану проводили методом обработки фаговой суспензии им в соотношении 1:10 при постоянном перемешивании.

В экспериментах было установлено, что индикаторная культура Pseudomonas syringae № 3 не выдерживает воздействия хлороформа во временном интервале равном 5-85 минут. Установлено, что бактериофаги Pseudomonas syringae — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ — устойчивы к хлороформу.

Ниже представлен протокол исследования:

в пробирки с 4,5 мл МПБ, вносится по 0,2 мл испытываемого бактериофага и 0,2 мл бактериальной культуры, чувствительной к данному фагу (индикаторная культура): пробирки культивировали при температуре 28±1 ⁰С 18 ч;

в каждую пробирку добавляется по 0,5 мл трихлорметана. Время экспозиции с трихлорметаном при непрерывном встряхивании соответственно: 1-я пробирка – 5 мин; 2-я пробирка – 10 мин; 3-я пробирка – 15 мин и так с интервалом в 5 минут до 90 минут; полученную смесь откручивали на центрифуге 30 мин при 5000 об/мин, собирали супернатант;

активность бактериофага определяли по методом Отто (контролем служил стерильный фильтрат фаголизата, полученный с использованием бактериальных фильтров).

Простота и эффективность трехступенчатой мембранной фильтрации стали основополагающими факторами при выборе метода очистки фагового биопрепарата от бактериальных клеток индикаторной культуры и т.п.

Контроль стерильности. Контролируемые по каждому исследуемому бактериофагу микробиологические показатели приведены в ТР ТС 029/2012 и указаны в таблице 9.

Протокол исследований на определение КМАФАнМ

С соблюдением правил асептики готовили разведения исследуемого фагового биопрепарата в стерильной воде 1:10; 1:100; 1:1000.

Из каждого приготовленного разведения делали высевы на девять чашек Петри с МПА (по три на одно разведение). Для этого стерильной пипеткой у пламени горелки отбирали 0,2 см раствора и переносили на поверхность МПА в чашки Петри, тщательно распределяя его по всей поверхности путем мерного покачивания чашки. После этого засеянные чашки Петри помещали в термостат при температуре (37±0,2) °С на 24 и 48 ч. Через 24 ч подсчитывали выросшие бактериальные колонии.

Затем чашки Петри оставляли в термостате еще на 24 ч для выявления медленно растущих бактериальных колоний.

Таблица 9 – Контроль микробиологической чистоты фаголизата

В результате проведенных исследований было установлено, что КМАФАнМ во флаконах с бактериофагами равно 0, то есть рост бактерий через 48 часов на всех девяти чашках Петри с МПА нами зафиксирован не был.

К БГКП относятся факультативно-анаэробные, грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу (глюкозу) с образованием кислоты и газа при (37 + 1)⁰С в течение 24-48 часов, в основном, являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т. е. учитываются цитрат положительные и цитрат отрицательные варианты БГКП). Для выявления БГКП производили посев на среду Кесслера. Через 24 часа инкубирования при (37 + 1)⁰С делали пересев на среду Эндо. Было отмечено отсутствие на среде Эндо колоний, типичных для БГКП (красных и темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых или бледно-розовых).

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в исследуемом объекте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа бактерий рода Salmonella или сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella. Навеску массой 25 мл вносили в забуференную пептонную воду, затем инкубировали при температуре (37±1) °С в течение (18±2) ч. Далее производили посев на среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон). После посева RVS-бульон инкубировали при температуре (41,5±1,0) °С в течение (24±3) ч, а МКТ-бульон — при температуре (37±1) °С в течение (24±3) ч. Далее небходимо было провести пересев выделенных культур на две селективные агаризованные среды: ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-arap) и висмут-сульфит агар. Отсутствие роста бактериальных культур на средах предварительного обогащения в неселективной питательной среде и на селективной среде обогащения свидетельствует о том, что бактерий рода Salmonella выделено не было.

При определении количества E. coli в 25 мл фагового биопрепарата делали последовательные разведения и наносили на поверхность агара лактозного с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, разлитого в две параллельные чашки Петри. Для подсчета количества определенных групп или видов микроорганизмов на селективно-диагностических или диагностических средах учитывали колонии характерной морфологии, показавшие характерную цветную реакцию с присутствующим в среде индикатором. Отсутствие роста бактериальных культур свидетельствует о том, что бактерий E. coli в 25 мл фагового биопрепарата выделено не было.

Параметры микробиологической чистоты фагового биопрепарата экспериментально производственных серий фагового биопрепарата соответствовали контрольным значениям приведенным в таблице 9. Результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что в процессе хранения готового фагового биопрепарата при температуре 4±2°С активность обоих бактериофагов не опускалась ниже нормативных значений в течение 6 месяцев (содержание БОЕ в 1 мл бактериофага 10⁹).

2.2.3. Разработка технологической схемы наработки экспериментальной партии биопрепарата

2.2.3.1 Требования к производственным штаммам бактерий Pseudomonas syringae

Производственный штамм бактерий Pseudomonas syringae №3 обладает типичными для вида тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами, не продуцирует энтеротоксины и не содержит умеренных бактериофагов. Оценку наличия индуцируемых профагов проводили путем обработки бактерий индукторами (ультрафиолетовым излучением, митомицином C) с последующим контролем появления бляшек лизиса, вызванного активацией умеренных бактериофагов, содержащихся в геноме бактерии. В качестве химического фактора воздействия использовали митомицин С в дозе 0,5 мкг/мл.

Протокол исследования

Исследуемые бактериальные культуры засевали в пробирки с МПБ, содержащим 0,5 мкг/мл митомицина С. После инкубации пробирок в течение 5±1 ч при 28±1 °С содержимое пробирок центрифугировали (3000 об./мин) и пропускали через фильтры «Millipore Millex-GP» с полиэфирсульфоновым наполнителем и диаметром пор 0,22 мкм.

Суспензии индикаторных бактериальных штаммов наносили в объеме 0,1–0,2 мл на поверхность МПА в чашках Петри и втирали досуха шпателем.

Чашка Петри с МПА делили на 3 сектора, на которые наносили по 100 мкл:

содержимого пробирки с физ.раствором с 0,5 мкг/мл митомицина С (отрицательный контроль),

фаголизат бактериофага (положительный контроль),

тестируемую бактериальную культуру (опыт).

После инкубации в течение 18 ч при 28±1 °С чашки исследовали на наличие зон лизиса на бактериальном газоне.

Учет результатов. В месте внесения физ.раствора с 0,5 мкг/мл митомицина С зоны лизиса фиксироваться не должны. В месте нанесения фаголизата бактериофага визуализируется зона лизиса. Наличие зоны лизиса газона на секторе с нанесенным содержимым тестируемой пробирки указывает на лизогенное состояние штамма.

В качестве физического фактора воздействия применялось ультрафиолетовое облучение (УФО) с длинной волны 250 нм. Эксперимент проводили в полузатемненном помещении с целью предохранения облученных бактерий от фотореактивации

Протокол исследования:

Исследуемые культуры в период эксперимента должны были находиться в экспоненциальной фазе роста. Суточная культура бактерий разводилась в соотношении 1:100 в фосфатном буфере с рН 7,6.

Разведение бактериальной культуры в объеме 2 мл помещали в чашку Петри и облучали в течение 20 (25, 30, 35, 40) секунд на расстоянии 40 (45, 50, 55, 60) см.

Затем облученные штаммы бактерий засевались на мясо-пептонный бульон (МПБ) комнатной температуры (20-22 ⁰С) в соотношении 1:100.

Посевы инкубировались при 28±1 ⁰С в течение 6,5-7,0 часов, после чего делается посев методом диффузии в «мягкий агар» — метод агаровых слоев по Грациа.

Накануне опыта по чашкам Петри разливается 1,5 % МПА в ламинарном боксе. Чашки Петри с МПА ставят в термостат для проверки на стерильность на 11±5 часов. Перед применением чашки Петри с МПА дополнительно подсушивают в термостате при (28±1) ⁰С 15-20 минут.

Готовят штатив с 10 пробирками, содержащими по 4,5 мл МПБ; в первую из них добавляют облученную бактериальную культуру в количестве 0,5 мл, тщательно перемешивают другой пипеткой и в количестве 0,5 мл переносят в следующую пробирку, из второй — 0,5 мл в третью и т.д. В серии пробирок обученная культура разводится 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. до 10-10 (из этой пробирки после перемешивания выливается 0,5 мл разведения с целью соблюдения количественного единства в эксперименте).

Стерильный 0,7% МПА, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляют на водяной бане и остужают до температуры 46±2 ⁰С.

В пробирку с 2,5 мл 0,7% МПА вносят 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл облученной культуры, в которой предполагается выход профага. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивается вращением в ладонях и выливается на поверхность 1,5% МПА.

Дополнительно ставится опыт на контроль бактериальной культуры (в пробирку с 2,5 мл 0,7% МПА вносится 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл стерильного МПБ). Содержимое пробирки тщательно перемешивается вращением в ладонях и выливается на поверхность 1,5% МПА.

Опыт на контроль бактериофага (в пробирку с 2,5 мл 0,7% МПА вносится 0,2 мл облученной культуры, в которой предполагается выход профага и 0,2 мл стерильного МПБ). Содержимое пробирки тщательно перемешивается вращением в ладонях и выливается на поверхность 1,5% МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности МПА.

Чашки Петри оставляют на горизонтальной поверхности стола до полного застывания верхнего слоя МПА, затем посевы инкубируют в термостате при температуре 36±1 ⁰С в течение 18 часов.

Учет результатов. При положительном результате на чашках Петри образуются зоны лизиса, при этом в чашках с контролем бактериальной культуры должен быть зафиксирован ровный газон культуры, а в чашке Петри с облученной культуры, в которой предполагается выход профага, отсутствие роста бактериальной культуры.

При проведении исследований было установлено, что производственный штамм бактерий Pseudomonas syringae №3 не содержит профага. Биологические свойства производственного штамма бактерий Pseudomonas syringae № 3 представлены на рисунке 9 и в таблице 10. В качестве контрольного бактериального штамма используется референс-штамм бактерий Pseudomonas syringae В-10917 из коллекции БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика.

Производственный штамм бактерий Pseudomonas syringae №3 лизируется маточными фагами в титрах по методу Аппельмана и Грациа не менее чем на 1-2 порядка выше показателей специфической активности конечного продукта (бактериофаг Ps.s-7 УлГАУ имеет показатели литической активности — 10^-8 (при определении по методу Аппельмана) и 2,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) (при определении по методу Грациа); бактериофага Ps.s-27 УлГАУ имеет показатели литической активности — 10-8 (по методу Аппельмана) и 1,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (по методу Грациа); полифаговый биопрепарат состоит из двух бактериофагов — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, которые культивировались на индикаторной культуре Pseudomonas syringae Ps.s № 3, показатель литической активности 1,0±0,2х10⁷ БОЕ/мл). При этом стабильность лизиса сохранялась после 48 часов инкубирования при температуре 28 °C.

Рисунок 9 — Культура Pseudomonas syringae №3 на среде CRL.2 после инкубирования при 25℃ в течение 48 ч

Таблица 10 — Биологические свойства производственного штамма бактерий

Примечание – «+» — положительный результат,

«-» — отрицательный результат,

«d» — вариабельный результат.

На средах CRL.2 и CRL Pseudomonas syringae №3 имела белые, матовые, растекающиеся колонии неровной формы, характеризующиеся быстрым агрессивным ростом (рис. 9).

Производственные штаммы бактерий Pseudomonas syringae №3 хранятся в специальных изолированных помещениях в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре 2 — 8 °C в течение 10 лет или в бактериологических пробирках с 0,4 — 0,7 процентной агаризованной питательной средой (на основе МПБ) под стерильным вазелиновым маслом, при температуре 2-6 °C и регулярном пересеве каждые 2-3 месяца.

2.2.3.2 Маточные бактериофаги

Для получения фаговых препаратов мы использовали только вирулентные бактериофаги. Их выделяли из природных, пассируя на штамме целевого вида бактерий — Pseudomonas syringae №3. Маточные бактериофаги включали вирулентные фаги с широким диапазоном действия по отношению к штаммам Pseudomonas syringae, обладали высокой активностью, стабильностью лизиса, специфической направленностью антимикробного действия. Характеристика кандидатных фаговых рас (штаммов) при отборе была дополнена современными молекулярно-биологическими методами (полногеномное секвенирование с последующим биоинформационным анализом). Хранение производственной коллекции бактериофагов осуществляется в жидком состоянии при температуре от 2 до 8 °C в течение 5 лет с ежегодным пересевом на бактериальных штаммах и в лиофилизированном состоянии.

Расширение диапазона действия препаратов в отношении циркулирующих бактериальных возбудителей может быть достигнуто путем подбора фаговых рас из коллекции предприятия или из природных источников. Это обеспечивает возможность выпуска производственных серий бактериофагов целевого назначения. Например, при вспышке или появлении очага инфекции, обусловленной фагоустойчивым возбудителем, передача на производство бактериального штамма – возбудителя инфекции в конкретном случае, позволит адаптировать препарат к конкретным условиям путем подбора к этому бактериальному штамму активных фаговых рас из коллекции производителя и последующего использования их при изготовлении препарата.

Характеристика биологических свойств фаговых штаммов, включенных в состав фагового биопрепарата

Бактериофаги должны иметь строго литический инфекционный цикл. Наиболее полной характеристикой, позволяющей всесторонне оценить наличие генов перехода в лизогенный цикл, факторов вирулентности и токсинов, является определение полной последовательности генома бактериофага.

Экспериментальными признаками такой классификации может служить ПЦР-типирование по наиболее консервативным генам, характерным для данной группы бактериофагов.

Каждый из фаговых штаммов, используемых в препарате:

— демонстрировал высокую специфическую литическую активность, выявляемую путем титрования в жидкой питательной среде по методу Аппельмана;

— имел высокую концентрацию (количество бляшкообразующих единиц в 1 мл), определяемую методом агаровых слоев по Грациа;

— обладал широким диапазоном литического действия на коллекции бактериальных штаммов, музейных и «полевых»;

— был изучен с помощью молекулярно-генетических методов (полногеномного секвенирования) для определения его полной нуклеотидной последовательности ДНК с последующим биоинформационным анализом.

Другими характеристиками, которые должны были определены для каждого фагового штамма, являются:

— частота генерации фагоустойчивых форм;

— длительность латентного периода в ходе инфекции;

— урожайность и величина выхода фаговых частиц из одной инфицированной бактериальной клетки.

Штамм, на котором проводится культивирование бактериофага -Pseudomonas syringae №3 — не содержал легко индуцируемых профагов, загрязняющих препарат. Оценку наличия индуцируемых профагов проводили путем обработки бактерий индукторами (ультрафиолетовым излучением, митомицином C) с последующим контролем появления бляшек лизиса, вызванного активацией умеренных бактериофагов, содержащихся в геноме бактерии.

Характеристика основных биологических фагового биопрепарата

Представленные материалы на препарат в целом, помимо характеристик на отдельные фаги, должны содержать следующую информацию:

— специфическая литическая активность, определяемая по методу Аппельмана с использованием соответствующих бактериальных тест-штаммов (контрольных штаммов), типичных по своим морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, которые не были использованы при изготовлении препарата.

Активность бактериофага, определяемая по методу Аппельмана, выражается отрицательным десятичным логарифмом, указывающим последнее разведение бактериофага в жидкой питательной среде, в которой рост бактериальной культуры визуально не наблюдается;

— диапазон действия изучаемого препарата в отношении соответствующих ему видов бактериальных возбудителей инфекций, выделенных из объектов внешней среды (пораженных растений, воды, почвы), циркулирующих в современных условиях на территории РФ (не менее 3-х регионов);

— стабильность препарата. Активность препаратов бактериофагов сохраняется при регламентированной температуре хранения. Определение стабильности препарата (способности сохранять литическую активность бактериофага) проводится по методу Аппельмана.

При проведении исследования антимикробного действия бактериофагов были обеспечены следующие условия, гарантирующие достоверность результатов:

питательные среды для культивирования бактерий, на которых изучалось антимикробное действие бактериофага, отвечали требованиям стандартности и воспроизводимости результатов;

стандартность бактериальной нагрузки (посевной дозы) штаммов-мишеней для изучаемого бактериофага.

2.2.3.3 Основные этапы производства

Производственный процесс включает в себя:

1. работу с бактериальными возбудителями,
2. подбор к ним вирулентных штаммов бактериофагов,
3. отбор бактерий — продуцентов бактериофагов,
4. получение маточных бактериофагов,
5. культивирование производственных штаммов бактерий — продуцентов и маточных бактериофагов с целью получения биомассы бактериофагов,
6. приготовление препаратов бактериофагов:

6.1 подготовка стартерных культур пары бактериофаг – штамм-хозяин.

Штамм бактерий Pseudomonas syringae №3, используемый для наработки бактериофагов, лиофилизируют, используя сублимационную сушку CoolSafe110 Freeze Dryer. Штаммы бактерий в соотношении 1:1 смешивают с защитной средой (сахароза 20 %, желатин 1 %), разливают во флаконы по 2 мл и высушивают в течение 12 ч при давлении ≤0,03 гПа и при постепенном повышении температуры от -50 до +20°С.

Фенотипически и молекулярно-генетически охарактеризованные штаммы бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ лиофилизируют по схеме, соответствующей изложенной выше в отношении штаммов бактерий, используя следующую защитную среду: сахароза 20 %, желатин 8 %.

6.2 подготовка помещения и оборудования

Перед началом дезинфекции проверяют эффективность вентиляционного оборудования и HEPA фильтров. Боксированное помещение и ламинарный бокс обрабатывают при помощи хлорамина Б. Дезинфекцию оборудования, предназначенного для розлива и укупорки флаконов с фаговым биопрепаратом, а также поддонов для флаконов и емкости для крышек, проводят 70 % раствором спирта.

6.3 приготовление расходных материалов

Перед стерилизацией осуществляют мойку стеклянной посуды. Стерилизацию лабораторной посуды осуществляют по следующему режиму: сухожаровой шкаф – 1 ч при 200 ºС. Стерилизацию емкостей большого объема и частей перистальтического насоса (силиконовый шланг) проводят в автоклаве под давлением пара 1,2 атмосферы и рабочей температуре 121 ºС, время стерилизации – 20 мин. Сухая стерилизация гамма-лучами пластиковых флаконов и крышек производится по контракту по следующей схеме: 18,5 кГр при скорости конвейера 3,0 см/сек.

6.4 приготовление питательных сред

Разливают в литровые матрасы и стерилизуют при следующих режимах: под давлением 1,2 атмосферы и рабочей температуре 121 ºС.

6.5 подготовка фаголизатов бактериофагов

Фаголизаты бактериофагов получали способом, запатентованным в РФ (патент №2525141)– с учетом модификации, приведенной выше, 4,5 мл 18-часовой бактериальной культуры Pseudomonas syringae №3 в титре 109 КОЕ/мл засевают в матрац для культивирования – скошенная плотная питательная среда толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3–3,5 ч при оптимальной температуре – 28 0С, затем на полученный газон культуры Pseudomonas syringae №3 засевают маточный бактериофаг (Ps.s-7 УлГАУ или Ps.s-27 УлГАУ) в титре 106–107 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования. Культивируют в течение 4–5 ч при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0–7,2 в количестве 9–10 мл, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют трихлорметан в количестве 1:10, выдерживают в течение 30 мин при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об./мин, отбирают надосадочную жидкость в стерильные пробирки и проверяют титр по Грациа. Полученные раздельно бактериофаги в титре не менее 10¹¹ БОЕ/мл смешивают в стерильной емкости, в равных объемах.

6.6 стерилизация фаголизата

Полученный коктейль фаголизатов фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм.

6.7 сведение компонентов фагового биопрепарата

Коктейль стерильных фильтратов фаголизатов с учетом конечного титра бактериофагов доводят до объема 100 мл, с помощью уравновешенного буфера (Hyglos) в стерильном флаконе.

6.8 розлив

Асептический розлив и укупорка во флаконы по 100 мл с крышкой, содержащей контроль первого вскрытия.

6.9 маркировка

Маркировка включает следующие сведения о продукте: наименование, указание «не для розничной продажи», наименование и местонахождение изготовителя, объем, дату изготовления и дату упаковывания, срок годности и условия хранения, номер партии.

6.10 определение срока годности фагового биопрепарата

Необходимым этапом при конструировании рецептуры и разработке технологии получения фагового биопрепарата является определение срока годности готовой формы. Для этого образцы из 6 партий продукции хранили в течение 9 месяцев при температуре 4±2°С, периодически отбирая для контроля согласно ОФС.1.1.0004.15 Отбор проб «Государственная фармакопея Российской Федерации», XIII издание, том I, 2015 год. В таблице 11 представлены данные по изучению стабильности специфической литической активности бактериофагов в разные сроки с момента выпуска продукции.

Таблица 11 – Стабильность специфической литической активности бактериофагов (по Грациа) при нормативном хранении фагового биопрепарата

6.11 контроль стерильности (микробиологической чистоты, аномальной токсичности и определение эндотоксина фагового биопрепарата)

Критические контрольные точки на этапах создания фагового биопрепарата.

В процессе производства бактериофагов на разных этапах получали промежуточные продукты, которые должны соответствовать определенному уровню качества.

При подготовке производственных штаммов бактерий контроль посевных культур бактериальных штаммов-продуцентов включал в себя следующие показатели:

— чистота;

— типичность биологических свойств;

— отсутствие легко индуцируемых профагов.

При подготовке маточных бактериофагов контроль маточных бактериофагов включал в себя следующие показатели:

содержание бляшкообразующих единиц в 1 мл — специфическая активность фаголизатов, определяемое методом агаровых слоев по Грациа (табл. 12);

литическая активность, определяемая титрованием в жидкой питательной среде по методу Аппельмана и методу Грациа на Pseudomonas syringae №3;

стабильность лизиса (сохранность полученных результатов лизиса по методу Аппельмана) в течение 48 часов инкубации при температуре 37 ± 1 °C. Температурный режим и время инкубации зависят от специфических особенностей бактерий и их фагов;

микробиологическая чистота фаголизата. Контролируемые по каждой партии фагового биопрепарата микробиологические показатели приведены в ТР ТС 029/2012 и указаны в таблице 9.

Таблица 12 – Контроль специфической активности фаголизатов

Параметры микробиологической чистоты фагового биопрепарата экспериментально производственных серий фагового биопрепарата соответствовали контрольным значениям приведенным в таблице 9. Результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что в процессе хранения готового фагового биопрепарата, состоящего из 2 бактериофагов Pseudomonas syringae (Ps.s-7 УлГАУ или Ps.s-27 УлГАУ) при температуре 4±2°С активность обоих бактериофагов не опускалась ниже нормативных значений в течение 6 месяцев (содержание БОЕ в 1 мл фагового биопрепарата более 10⁹).

Контроль микробиологической чистоты флаконов и крышек для розлива. 5 флаконов из партии отбирали в боксе из двойного пакета. Заливали 10 мл стерильного МПБ. Флаконы закрывали, тщательно встряхивали, ставили в термостат при 37 ºС и 25 ºС на 48 ч. Затем, из каждого флакона, делали высев 0,1 мл на чашки с плотными питательными средами (кровяной агар, Сабуро) методом spot-теста. Инкубировали при 37 ºС 24 часа на кровяном агаре и при 25 ºС – 72 часа на среде Сабуро. После инкубации контролировали наличие или отсутствие роста на чашках. Стерильным пинцетом выбирали 5 крышек из партии, замачивали в емкости с 250 мл стерильной жидкой питательной среды (МПБ). Емкость закрывали, ставили в термостат при 37 ºС и 25 ºС на 48 ч, после чего повторяли методику высева и учета результатов в соответствие с процедурой, приведенной для флаконов.

Контроль фаголизата на аномальную токсичность

Объем 1 мл фаголизата вводили внутрибрюшинно 5 здоровым мышам обоего пола. После введения фаголизата наблюдали за животным в течение 7 суток. Фаговый биопрепарат считался прошедшим испытание, так как в течение вышеназванного срока наблюдения не погибло ни одно из подопытных животных.

Определение эндотоксина в фаговом биопрепарате

Определение уровня эндотоксина после рабочего разведения фагового биопрепарата (до титра каждого бактериофага 109 БОЕ/мл) определяли с помощью реакции гелирования лизата амебоцитов крови мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛтест). Предельные значения уровня эндотоксина составляло не более 50 ЕЭ/мл.

Для получения жидкого препарата после финальной стадии бактериофаг разливали по флаконам и укупоривали.

Для получения других форм препаратов бактериофагов: в концентрированный бактериофаг добавляли стабилизаторы и лиофилизировали; сухую массу бактериофага контролировали в тестах на специфическую активность и микробиологическую чистоту; готовый продукт контролировали по всем показателям, указанным выше.

К специфическим методам исследования, используемым для характеристики бактериофагов, относятся методы Аппельмана и Грациа.

Транспортирование и хранение

Транспортирование осуществляется при температуре от 2 до 8 °C, в пределах 1 месяца — допускается при температуре от 9 до 25 °C.

Хранение в сухом, защищенном от света и недоступном для детей месте при температуре от 2 до 8 °C в течение 1 — 2 лет. Однако возможно расширение температурного режима хранения до 25 °C при подтверждении активности препарата в течение заявленного срока годности.

2.2.4. Разработка методологии индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции

При подборе оптимального времени экспозиции бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ с исследуемым материалом (в эксперименте использовался стерильный мясо-пептонный бульон) было установлено, что этап «предварительное подращивание» применять в схеме постановки эксперимента нецелесообразно, так как определено, что культивирование системы «бактериофаг — исследуемый материал» при температуре 28 ± 1 0С в течение 3,5 часов позволяет выявить бактерии Pseudomonas syringae при методом РНФ в концентрации 10³ м.к./мл. Увеличение экспозиционного времени не повышает качества реакции. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 12.

Далее эксперименты были направлены на отработку параметров постановки РНФ на тест-объектах (семена огурца, проба почвы, речная вода), которые были контаминированы бактериями Pseudomonas syringae в концентрации 10³ – 10⁷ м.к./мл (г) в лабораторных условиях. Схема эксперимента отражена на рисунке 1. Полученные нами результаты экспериментов представлены в таблицах 13-15.

Таблица 12 – Результаты постановки реакции нарастарния титра фага с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в стерильном мясо-пептонном бульоне

Таблица 13 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ на семенах огурца

Таблица 14 – Результаты экспериментов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в пробе почвы

Таблица 15 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в пробе речной воды

Принимая во внимание полученные нами положительные результаты экспериментов по индикации бактерий Pseudomonas syringae в концентрации 10³ м.к./г (мл) бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ на пробах семян огурца, почвы и речной воды, было принято решение провести исследования на тех же тест-объектах с применением фагового биопрепарата, состоящего из вышеназванных бактериофагов. Применение бактериофагов в составе полифагового биопрепарата позволило бы сократить затраты расходных материалов и трудозатраты на исследования. Таким образом, продолжительность постановки РНФ с бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ составляет 23 часа, включающие этап подготовки реакции 30 минут + 3,5 часа — время термостатирования посевов + этап очистки субстрата трихлорметаном — 30 минут + высев субстрата методом агаровых слоев — 30 минут + 18 часов — время термостатирования посевов = 23 часа. В расчет времени не был включен этап предварительной подготовки бактериофага до концентрации 10³ БОЕ/мл.

Следующий этап исследований – это отработка схемы постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae фаговым биопрепаратом (два бактериофага — Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ — культивировались в одном флаконе) на следующих тесмт-объектах: почве, речной воде, семенах огурца, товарных томатах, огурцах и цуккини. Результаты экспериментов отражены в таблицах 16-22.

Результаты постановки РНФ на тест объекте – семенах огурца –показали, что выявленная при помощи фагового биопрепарата концентрация бактерий Pseudomonas syringae составила 10³ м.к./мл, то есть визуально нами было подсчитано, что количество бляшкообразующих единиц бактериофагов на опытных чашках Петри в сравнении с контрольными увеличилось примерно в 8 раз.

Из материалов таблицы 17 следует, что эффективность РНФ в пробе почвы показала, что обнаруживаемая в пробе почвы концентрация бактерий Pseudomonas syringae — это 10⁴ м.к./г. Согласно вышезаявленным критериям оценки результатов постановки РНФ полученные результаты не являются положительными. Было зафиксировано снижение «чувствительности» реакции, что, по нашему мнению, связано с адаптацией искусственно вносимой бактериальной культуры на тест-объекте, и его структурой, которые, возможно, усложняют адсорбцию бактериофагов на индикаторной культуре.

Таблица 16 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе семян огурца

Таблица 17 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе почвы

С целью повышения эффективности РНФ мы решили снизить исходную концентрацию изучаемого фагового биопрепарата с 10³ БОЕ/мл до 10² БОЕ/мл. Далее мы поставили реакцию по ранее описанному алгоритму. Результаты отражены в таблице 18.

Таблица 18 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе почвы (титр фага 10² БОЕ/мл)

Таблица 19 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе речной воды

Экспериментально было установлено, что снижение исходного титра полифагового биопрепарата до концентрации 10² БОЕ/мл позволило провести индикацию бактерий Pseudomonas syringae в концентрации 10³ мк/г почвы.

Результаты постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae фаговым биопрепаратом в пробе речной воды представлены в таблице 19. В исследованиях пробы воды речной были получены результаты, сходные с данными эксперимента на пробе семян огурца. Концентрация выявленных бактерий Pseudomonas syringae составила 10³ м.к./мл.

Таблица 20 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе томатов

Таблица 21 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе цуккини

Таблица 22 – Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе огурцов

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, которую можно определить в вышеназванных пробах, используя данный метод составила 10³ м.к./г. Свободный бактериофаг не обнаружен ни в одном из экспериментов.

Таким образом, все проведенные исследования и полученные в ходе них данные принципиально не расходятся с данными аналогичных исследований на иных бактериальных агентах (Г.Р. Садртдинова, 2017; Н.В. Пименов и др., 2019), и позволяют рекомендовать данный алгоритм в качестве метода индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae в пробах почвы, воды, семенном материале и товарных овощах (томатах, огурцах и цуккини). Длительность исследования составляет 23 часа, простота постановки РНФ не требует высокой квалификации исследователя и сложнотехнического оснащения лаборатории.

2.2.5 Изучение эффективности применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства нами были проведены исследования проб семенного материала (семена огурцов некоммерческого (домашние) пробы под номерами 1-4, 10-11 и коммерческого происхождения – пробы № 5-9), проб почвы (ПФО – 1-10, ЮФО – 11-20, ЦФО -21-30), воды (1-5 пробы — р. Волга, 6-9 пробы — р. Свияга, 9 проба р. Гуща, 10 проба – р. Сура, 11 – р. Малый Черемшан, 12 проба – р. Майна, 13 проба – р. Большой Черемшан), растительной продукции (цуккини, томаты, огурцы плоды и семенной материал), приобретенной на продовольственных рынках г. Ульяновска и г. Димитровграда на наличие бактерий вида Pseudomonas syringae с помощью специфических бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ.

Материал для исследований отбирали в соответствии с требованиями, указанными в ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов (с Изменением № 1)

Обнаружение бактерий вида Pseudomonas syringae проводили бактериологическим методом по авторской схеме (рис. 10) и с помощью реакции нарастания титра фага.

При индентификации выделенных штаммов из объектов санитарного надзора мы определяли следующие свойтва бактерий: морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические. Определение тинкториальных свойств (окраска по Грамму, подвижность культуры, образование спор) проводили по стандартной методике.

Для изучения биохимических свойств выделенных штаммов из окружающей среды мы определяли у них наличие оксидазы, каталазную активность, способность использовать источников углерода (глюкозу, лактозу, сахарозу, маннозу, сорбит), использование аргинингидролазы, способность к гидролизу эскулина, желатина и крахмала, а также продукцию сероводорода. Устойчивость штаммов к абиотическим факторам: рост при среде 5 % концентрации NaCl, действие температурного фактора (рост при +41^оС). Определение каталазной активности проводили с применением 3% раствора перекиси водорода. На суточную культуру бактерий, засеянную на МПА (культивирование при температуре 28⁰С в течение 24 часов), наносили 2 капли 3% раствора перикиси водорода. Реакция считалась положительной, если на поверхности МПА образовывались пузырьки.

Высевали суточную культуру на картофельный агар (культивирование при температуре 28⁰С в течение 24 часов), добавляли раствор Люголя для определения гидролиза крахмала.

Тест на оксидазу проводили экспресс методом. Суточные культуры наносили на диски (оксидазные диски HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), результаты оценивали по изменению цвета дисков.

Протеолитическую активность определяли на среде с питательным желатином. К МПБ добавляли 15% желатин, нагревали до полного его набухания, после стерилизации при 0,5 атм разливали в пробирки по 5 мл. На эти пробирки высевали культуры. Результаты смотрели 1-3 суток. Наличие протеолитических ферментов выделяемых в процессе роста культуры наблюдали разжижение столбика.

Суть определения аргинингидралазы состоит в том, что бактерии, обладающие аргинингидралазой, образуют из аргинина NH₃ в анаэробных условиях, что сопровождается защелачиванием среды и изменением цвета индикатора. Обычно этот метод используется для дифференциации псевдомонад.

Индол определяли с помощью реактива Ковача, способность к окислению углеводов определяли в аэробных условиях с помощью цветного ряда Гисса, определяли реакцию на образование сероводорода.

Для определения роста при 41^оС, суточную культуру высевали на МПА и помещали в термостат при 41^оС на 24 часа. Результаты учитывали по росту колонии на чашке. Паралелльно определяли рост в среде с 5% NaCl, культуру засевали на МПА с 5% NaCl и инкубировали в термостате при 28^оС на 24 часа.

Окислительно-ферментативный тест на использование глюкозы (тест ХьюЛейфсона). Для определения анаэробной ферментации (O/F). Готовили среду (пептон ферментативный, NаС1, К2НР04, агар-агар, дистиллированная вода; после автоклавирования при 0,5 атм. вносили бромтимоловый синий), разливали на 2 пробирки и суточные культуры засевали уколом параллельно в 2 пробирки, затем на одну пробирку заливали стерильным вазелином. Результаты регистрировали ежедневно в течение 3 суток. Изменения смотрят по окраске индикатора. Кислота образуется вначале только в верхней части. Если же микроорганизмы не катаболизируют углевод, то кислота не образуется ни в одной из пробирок. Если микроорганизмы образуют кислоту в открытой пробирке (О-реакция) с окислительным типом метаболизма.

Липолитическую активность (ТВИНазную) определяли с помощью Tween-80, лецитиназную активность. Липолитическая (твиназная) активность используют для идентификации бактерий рода Pseudomonas. Твины – это эфиры спиртов (сорбитол, маннитол и др.) и жирные кислоты. Твин 80 является эфиром олеиновой кислоты. Под действием бактериальных липаз жирные кислоты отщепляются, затем осаждаются в виде мыла присутствующими в питательной среде ионами кальция. Весь этот процесс сопровождается помутнением среды. Для выполнения работ готовили среду (дистиллированная вода, пептон, NaCl, СaCl₂·2H2O, агар-агар), после автоклавирования при 1,5 атм к среде добавляли Твин 80 и стерилизовали при 0,5 атм. Затем перемешивали и разливали в чашки Петри. Суточные культуры засевали на поверхность среды медальонами и инкубировали в течение 7 суток. Результаты смотрели по образованию вокруг бляшек замутнения.

Определение лецитиназной активности: готовили яично-желточную плотную среду (300 мл стерильного, охлажденного до 45-50^оС мясопептонного агара добавляли 1 желток куриных яиц. Смесь тщательно перемешивали и разливали в чашки Петри). Затем суточные культуры засевали в чашки, инкубировали в течение 24 часов при 28^оС. Если реакция будет положительной вокруг колонии формируется небольшой ареол, отливающий металлическим блеском. При отрицательной реакции цвет среды вокруг колонии не изменяется.

Образование левана на среде с 5% сахарозой. Тест на продукцию левана используют для установления видовой принадлежности бактерии рода Pseudomonas. Многие бактерии из рода Pseudomonas утилизируют сахарозу в качестве источника углерода и продуцируют из нее леван, это свидетельствует о наличии фермента левансахаразы. Для исследований мы засевали суточные культуры на МПА с 5% сахарозой. Результаты учитывали в течение 1-3 суток. Если на среде с сахарозой культуры образуют белые, мукоидные, тянущиеся колонии, то это свидетельствует продуцирование левана.

Определение гиперчувствительности состоит в том что, если заразить растение фитопатогенными бактериями, не являющимися патогенным для этого вида растений, на месте введения бактерий запускаются быстрые механизмы защитного ответа в виде почернения и усыхания. Для работы суточные культуры на скошенном агаре смывали 3-4 мл физиологическим раствором и 15-20 мкл вводили в мякоть листа с помощью стерильного шприца. В качестве контроля использовали стерильный физиологический раствор. Результаты смотрели через 1-3 суток.

Общее время исследований по схеме занимает 192 часа.

Каждую исследуемую пробу массой/объемом 10 мл вносили в стерильную колбу, содержащую 90 мл стерильного МПА (рН 7,2-7,4) в соотношении 1:10. Содержимое колбы встряхивали в шуттель-аппарате в течение 15 минут с последующим отстаиванием взвеси в течение 10 минут. Далее работали по методике, отраженной на рисунках 10-17.

Рисунок 10 – Бактериологическая схема идентификации бактерий Pseudomonas syringae

Результат реакции нарастания титра фага учитывали путем подсчета бляшкоообразующих единиц фага в опытных и контрольных чашках. Оценку реакции проводили в соответствии с показателями таблицы 23. Положительная реакция характеризовалась увеличением количества бляшкообразующие единиц фага по сравнению с контролем в 5 и более раз.

При исследовании 11 проб семян огурцов бактериологическим методом на наличие в них бактерий Pseudomonas syringae было обнаружено наличие искомых микроорганизмов в пробах № 3 и № 11.

Таблица 23 — Оценка реакции нарастания титра фага (РНФ)

Рисунок 11 – Рост Pseudomonas syringae (полевой штамм, выделенный из пробы семян огурцов № 5) на среде Кинг Б в течение 24 часов при температуре 28°С (под УФ лучами виден флюоресцирующий оттенок)

Рисунок 12 – Реакция на аргинингидролазу у Pseudomonas syringae (первая пробирка с полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 5) — с вазелиновым маслом, вторая пробирка полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 5) — без вазелинового масла, третья пробирка — контроль) (время экспозиции 24 часа при температуре 28⁰С)

Рисунок 13 — O/F тест (определение анаэробной ферментации) слева пробирка контроль, по середине пробирка с вазелиновым маслом (полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 7), справа пробирка без вазелинового масла (полевым штаммом, выделенным из пробы огурцов № 7)

Рисунок 14 — Объекты исследований – семена огурцов

Рисунок 15 — Объект исследований — цуккини

Рисунок 16 — Объект исследований – огурцы

Рисунок 17 — Объекты исследований – томаты и огурцы

Реакция нарастания титра фага с использованием фагового биопрепарата, включающего фаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ также дала положительный результат индикации бактерии вида Pseudomonas syringae в исследуемых пробах семян огурцов № 3 и № 11. Результаты исследований представлены в таблице 24. Бактериологическим методом также в данных пробах были выделены и идентифицированы бактерии вида Pseudomonas syringae.

Таблица 24 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах семян огурца

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

При исследовании 12 проб огурцов бактериологическим методом на наличие в них бактерий Pseudomonas syringae было обнаружено наличие искомых микроорганизмов в пробах № 5 и № 7.

Таблица 25 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах огурцов

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Поставив реакцию нарастания титра фага с использованием скунструированного авторами фагового биопрепарата, включающего фаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ мы получили положительные результаты индикации бактерии вида Pseudomonas syringae в исследуемых пробах огурцов № 5 и № 7. Результаты исследований представлены в таблице 26.

Изучение 12 проб цуккини на наличие бактерий Pseudomonas syringae бактериологическим методом показало, что пробы под номерами 6 и 7 кокнтаминированы вышеназванными микроорганизмами.

Таблица 26 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах цуккини

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Используя предлагаемый метод фагоиндикации, авторами в пробах № 6 и № 7 цуккини были также выявлены бактерии Pseudomonas syringae, так как титр фагового биопрепарата увеличился в 5 раз и более.

Дальнейшие исследования проводились на пробах томатов. Применяя авторскую бактериологическую схему выделения и идентификации бактерий Pseudomonas syringae, было установлено обсеменение проб томатов под номерами 3, 8 и 10. Последующие эксперименты по фагоиндикации подтвердили полученные бактериологическим методом результаты (табл. 27).

Таблица 27 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах томатов

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Анализируя данные, полученные при исследовании 13 проб томатов было установлено, что 3 пробы были контаминированы бактериями Pseudomonas syringae, так как титр фагового биопрепарата увеличился в 5 раз и более в опыте по сравнению с контролем.

Изучение речной воды методом постановки РНФ с 13 пробами показало, что в пробах 1, 8 и 11 было установлено увеличение титра фага в опыте по сравнению с контролем, что свидетельствует о наличии в данных пробах бактерий вида Pseudomonas syringae. Использование в исследованиях авторской бактериологической схемы выделения и идентификации бактерий Pseudomonas syringae позволило также в вышеназванных пробах обнаружить бактерии Pseudomonas syringae.

Таблица 28 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах воды речной

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

При исследовании проб почвы различного хозяйственного назначения Приволжского, Южного и Центрального федеральных округов было установлено, что уровень контаминации бактериями вида Pseudomonas syringae составил 20 %, то есть увеличение титра фага было зафиксировано в 5 пробах под номерами 5, 7, 15, 18, 22, 28. В данных пробах также были выделены вышеназванные бактерии бактериологическим методом.

Таблица 29 — Результаты использования РНФ для индикации бактерий вида Pseudomonas syringae в пробах почвы

Свободный фаг при исследовании обнаружен не был.

Проведенные нами исследования по идентификации выделенных бактериальных культур бактериологическим методом отражены в таблицах 30-31.

Таблица 30 – Биологические свойства выделенных бактериальных культурр из проб объектов санитарного надзора

Примечание: «+» — положительная реакция, «-» — отрицательная реакция.

Таблица 31 – Биологические свойства выделенных бактериальных культурр из проб почвы

Примечание: «+» — положительная реакция, «-» — отрицательная реакция.

Из данных таблиц 30-31 видно, что у выделенных бактериальных культур зафиксированы отрицательные результаты по тестам на оксидазу и аргинингидралазу, определена продукция каталазы. По литературным данным бактерий Pseudomonas syringae гидролизуют желатин вариабельно, по нашим исследованиям оба референс-штамма не разжижают желатин. О/F тест положительный. Липолитическая (твиназная) активность регистрировалась, лецитиназная активность не фиксировалась. Изучаемые бактериальные штаммы образуют леван, индол не выделяют, не растут на МПА при температуре 41ºС. Ферментируют глюкозу, сахарозу, маннозу и сорбит. Тест на мацерацию ткани картофеля через 24 часа – результат отрицателен. Реакция на гиперчувствительность ткани положительная, что соответствует литературным данным.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что выделенные штаммы Pseudomonas syringae обладают типовыми свойствами.

Изучение эффективности применения сконструированного фагового биопрепарата для индикации Pseudomonas syringae в пробах семенного материала, пробах почвы, пробах воды, пробах растительной продукции показало, что реакция нарастания титра фага не уступает по эффективности бактериологическому методу выделения и идентификации вышеназванных бактерий. Очевидна также экономия расходных материалов и трудозатрат при ее постановке по сравнению с бактериологическим методом. Необходимо также отметить и сокращение времени исследования с 192 часов до 23 часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактериальные фитопатогены значительно снижают урожайность сельскохозяйственных культур и, следовательно, наносят значительный экономический ущерб и представляют угрозу для продовольственного обеспечения растущего мирового населения. В этом контексте бактериофаги исследуются как агенты биоконтроля, позволяющие своевременно провести индикацию специфичного микроорганизма, предотвратить распростронение заболевания и снизить экономический ущерб.

Цель работы – разработать экологически безопасный биологический препарат на основе специфических бактериофагов, который позволит проводить биоконтроль растений на наличие бактерий Pseudomonas syringae на разных стадиях (посевной материал, в период вегетации и при хранении).

Первый этап работы — конструирование фагового биопрепарата на основе имеющихся фагов, специфичных для Pseudomonas syringae, характеризующихся определенными биологическими свойствами. Для этого были изучены биологические свойства 8 бактериофагов активных в отношении Pseudomonas syringae. Отобраны 2 наиболее производственно-перспективных штамма фагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ с максимально широким спектром литического действия и явно выраженной специфичностью, максимально высоким титром литической активности при хранении, устойчивостью к факторам внешней среды, отсутствием в геноме «локусов патогенности».

Ps.s-7 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10^-8 (при определении по методу Аппельмана) и 2,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) (при определении по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; в исследованиях установлена устойчивость к температуре до 60⁰С в течение 30 минут и трихлорметану в соотношении 1:10 (временная экспозиция 35 минут).

Ps.s-27 УлГАУ: выделен из пробы почвы, индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность — 10^-8 (по методу Аппельмана) и 1,0±0,1х10⁹ БОЕ/мл (по методу Грациа), специфичность — 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; определено, что бактериофаг устойчив к воздействию температуры до 60⁰С в течение 30 минут и трихлорметана в соотношении 1:10 (время экспозиции составило 35 минут).

Произведен подбор технологических параметров изготовления биопрепарата на основе бактериофагов (разработаны количественные и качественные параметры культивирования – соотношение системы фаг/индикаторная культура: 1/1 – 0,2 мл/0,2 мл, подобрана оптимальная методики очистки фагового биопрепарата – многоступенчатая мембранная фильтрация, произведен контроль микробиологической чистоты, аномальной токсичности и определено отсутствие эндотоксина в фаговом биопрепарате).

Разработана пилотная технология получения экспериментального фагового биопрепарата, позволяющая нарабатывать средство для индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae с высоким титром фаговых частиц, включающая многоступенчатую схему контрольно-испытательных мероприятий. Таким образом, фаговый биопрепарат Pseudomonas syringae представляет собой прозрачную жидкость от светло-желтого до желтого цвета, розлитую в стеклянные флаконы под резиновую пробку и алюминиевый колпачок объемом 100-500 мл, титр фага не менее 10⁸ БОЕ/мл, условия хранения: 2-4 ⁰С в течение 12 месяцев при относительной влажности воздуха 70-80 %, при транспортировании необходимо учитывать хрупкость упаковки.

Далее при проведении исследований по разработке параметров практического применения фагового биопрепарата Pseudomonas syringae с целью индикации в пробах воды, почвы, в семенном материале и продуктах питания — товарных овощах (томатах, огурцах и цуккини) в реакции нарастания титра фага было определено, что культивирование системы: бактериофаг-проба при температуре 28 ± 1 ⁰С в течение 3,5 часов позволяет выявить в вышеназванных тест-объектах бактерии Pseudomonas syringae методом РНФ в концентрации 10³ м.к./г (мл). Увеличение экспозиционного времени не повышает качества реакции. Бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в монокультуре были использованы в экспериментах в концентрации 10³ БОЕ/мл.

При тестировании в РНФ полифагового биопрепарата на основе вышеназванных бактериофагов было установлено, что в исследованиях пробы воды речной и семенном материале (огурца) были получены результаты, сходные с данными эксперимента на пробах товарных томатов, огурцов и цуккини. Концентрация выявленных бактерий Pseudomonas syringae составила 10³ м.к./мл. Экспериментально было установлено, что снижение исходного титра полифагового биопрепарата до концентрации 10² БОЕ/мл позволяет провести индикацию бактерий Pseudomonas syringae в пробе почы в концентрации 10³ мк/г.

Полученные данные позволят в перспективе использовать реакцию нарастания титра фага в качестве ускоренного и методически простого метода тестирования продуктов питания (товарных овощей), семенного материала, проб почвы и воды на наличие фитопатогенного бактериального агента Pseudomonas syringae. В случае положительного результата разработать систему мероприятий по их санации специфичным и экологически чистым фаговым биопрепаратом.

На основании полученных данных разработана нормативно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Pseudomonas syringae» и «Методические рекомендации по индикации бактерий Pseudomonas syringae».

Сельскохозяйственным и перерабатывающим предприятиям предложен новый биопрепарат на основе консорциума 2 бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, специфичных для Pseudomonas syringae, для биоконтроля фитопатогена в объектах внешней среды и объектах растениеводства и разработана методика его применения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Xin X. F., Kvitko B., He S. Y. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen //Nature Reviews Microbiology. – 2018. – Т. 16. – №. 5. – С. 316.
2. Jones J. B. et al. Bacteriophages for plant disease control //Annu. Rev. Phytopathol. – 2007. – Т. 45. – С. 245-262.
3. Stone A., Baker B. Organic management of late blight of potato and tomato with copper products. – 2017. URL: https://eorganic.org/node/573
4. O’Leary B. M. et al. Early changes in apoplast composition associated with defence and disease in interactions between Phaseolus vulgaris and the halo blight pathogen Pseudomonas syringae pv. phaseolicola //Plant, cell & environment. – 2016. – Т. 39. – №. 10. – С. 2172-2184.
5. Moyano L. et al. Bacteriophytochromes from Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 modulate the early stages of plant colonization during bacterial speck disease //European Journal of Plant Pathology. – 2020. – Т. 156. – №. 3. – С. 695-712.
6. Hadley J., Radford P. The Use of Copper-based Formulations on Pseudomonas Syringae Pv. Actinidiae //Caribbean Journal of Science. – 2018. – Т. 51. – №. 2. – С. 380-383.
7. Monteil C. L. et al. Population-genomic insights into emergence, crop adaptation and dissemination of Pseudomonas syringae pathogens //Microbial genomics. – 2016. – Т. 2. – №. 10. Doi 10.1099/mgen.0.000089 URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5359406/
8. Durairaj K. et al. Characterization and assessment of two biocontrol bacteria against Pseudomonas syringae wilt in Solanum lycopersicum and its genetic responses //Microbiological research. – 2018. – Т. 206. – С. 43-49.
9. Xin X. F., Kvitko B., He S. Y. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen //Nature Reviews Microbiology. – 2018. – Т. 16. – №. 5. – С. 316.
10. Yoo S. J. et al. Aspergillus terreus JF27 Promotes the Growth of Tomato Plants and Induces Resistance against Pseudomonas syringae pv. tomato //Mycobiology. – 2018. – Т. 46. – №. 2. – С. 147-153.
11. Yu J. G. et al. Isolation and characterization of bacteriophages against Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing bacterial canker disease in kiwifruit //J. Microbiol. Biotechnol. – 2016. – Т. 26. – №. 2. – С. 385-393.
12. Rombouts S. et al. Characterization of novel bacteriophages for biocontrol of bacterial blight in leek caused by Pseudomonas syringae pv. porri //Frontiers in microbiology. – 2016. – Т. 7. – С. 279.
13. Pinheiro L. A. M. et al. Efficiency of Phage φ6 for Biocontrol of Pseudomonas syringae pv. syringae: An in Vitro Preliminary Study //Microorganisms. – 2019. – Т. 7. – №. 9. – С. 286.
14. Yu J. G. et al. Environmental Microbiology/Microbial Diversity: Isolation and Characterization of Bacteriophages Against Pseudomonas syringae pv. actinidiae Causing Bacterial Canker Disease in Kiwifruit //Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2016. – Т. 26. – №. 2. – С. 385-393.
15. Buttimer C. et al. Bacteriophages and bacterial plant diseases //Frontiers in microbiology. – 2017. – Т. 8. – С. 34.
16. Quiñones-Aguilar E. E. et al. Bacteriophages in the biological control of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, causal agent of halo blight in bean //Ecosistemas y Recursos Agropecuarios. – 2018. – Т. 5. – №. 14. – С. 191-202.
17. Jagdale S. et al. Green approach to phytopathogen: Characterization of lytic bacteriophages of Pseudomonas sp., an etiology of the bacterial blight of pomegranate //Microbiological research. – 2019. – Т. 228. – С. 126300.
18. Yin Y. et al. Isolation and characterisation of phages against Pseudomonas syringae pv. actinidiae //Acta Agriculturae Scandinavica, Section B—Soil & Plant Science. – 2019. – Т. 69. – №. 3. – С. 199-208.
19. Rombouts S. Management of the bacterial pathogens Xanthomonas campestris pv. campestris and Pseudomonas syringae pv. porri in cabbage and leek production using novel bacteriophages. – 2017.
20. James S. L. et al. Isolation, Characterisation and Experimental Evolution of Phage that Infect the Horse Chestnut Tree Pathogen, Pseudomonas syringae pv. aesculi //Current Microbiology. – 2020. – С. 1-10.
21. Valin H. et al. The future of food demand: understanding differences in global economic models //Agricultural Economics. – 2014. – Т. 45. – №. 1. – С. 51-67.
22. High Level Panel of Experts. Agroecological and other innovative approaches for sustainable agriculture and food systems that enhance food security and nutrition. – 2019.
23. Buttimer C. et al. Bacteriophages and bacterial plant diseases //Frontiers in microbiology. – 2017. – Т. 8. – С. 34.
24. Lugo A. J. et al. Copper resistance in Xanthomonas campestris pv. campestris affecting crucifers in Trinidad //European journal of plant pathology. – 2013. – Т. 136. – №. 1. – С. 61-70.
25. Bondarczuk K., Piotrowska-Seget Z. Molecular basis of active copper resistance mechanisms in Gram-negative bacteria //Cell biology and toxicology. – 2013. – Т. 29. – №. 6. – С. 397-405.
26. Bosmans L. et al. Efficacy of hydrogen peroxide treatment for control of hairy root disease caused by rhizogenic agrobacteria //Journal of applied microbiology. – 2016. – Т. 121. – №. 2. – С. 519-527.
27. Sundin GW, Wang N: Antibiotic resistance in plant-pathogenic bacteria. In Annual Review of Phytopathology, , vol 56. Edited by Leach JE, Lindow S. 2018:161-180.
28. van Lenteren J. C. et al. Biological control using invertebrates and microorganisms: plenty of new opportunities //BioControl. – 2018. – Т. 63. – №. 1. – С. 39-59.
29. Holtappels D. et al. Protection of phage applications in crop production: A patent landscape //Viruses. – 2019. – Т. 11. – №. 3. – С. 277.
30. Narayanasamy P. Detection and Identification of Viral Biological Control Agents //Biological Management of Diseases of Crops. – Springer, Dordrecht, 2013. – С. 431-469.
31. Vicente J. G., Holub E. B. X anthomonas campestris pv. campestris (cause of black rot of crucifers) in the genomic era is still a worldwide threat to brassica crops //Molecular plant pathology. – 2013. – Т. 14. – №. 1. – С. 2-18.
32. Ansaldi M. et al. Antibacterial applications of bacteriophages //Virologie. – 2020. – Т. 24. – №. 1. – С. 23-36.
33. Sundin G. W. et al. Bacterial disease management: challenges, experience, innovation and future prospects: challenges in bacterial molecular plant pathology //Molecular plant pathology. – 2016. – Т. 17. – №. 9. – С. 1506-1518.
34. Carstens A. B. et al. Unlocking the potential of 46 new bacteriophages for biocontrol of Dickeya solani //Viruses. – 2018. – Т. 10. – №. 11. – С. 621.
35. Zaczek-Moczydłowska M. A. et al. Phage cocktail containing Podoviridae and Myoviridae bacteriophages inhibits the growth of Pectobacterium spp. under in vitro and in vivo conditions //PloS one. – 2020. – Т. 15. – №. 4. – С. e0230842.
36. Carstens A. B. et al. A novel six-phage cocktail reduces Pectobacterium atrosepticum soft rot infection in potato tubers under simulated storage conditions //FEMS microbiology letters. – 2019. – Т. 366. – №. 9. – С. fnz101.
37. Buttimer C. et al. Novel N4-Like bacteriophages of Pectobacterium atrosepticum //Pharmaceuticals. – 2018. – Т. 11. – №. 2. – С. 45.
38. Voronina M. V. et al. Characterization of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum bacteriophage PP16 prospective for biocontrol of potato soft rot //Microbiology. – 2019. – Т. 88. – №. 4. – С. 451-460.
39. Wei C. et al. Developing a bacteriophage cocktail for biocontrol of potato bacterial wilt //Virologica Sinica. – 2017. – Т. 32. – №. 6. – С. 476-484.
40. Wang X. et al. Phage combination therapies for bacterial wilt disease in tomato //Nature biotechnology. – 2019. – Т. 37. – №. 12. – С. 1513-1520.
41. Elhalag K. et al. Potential use of soilborne lytic Podoviridae phage as a biocontrol agent against Ralstonia solanacearum //Journal of basic microbiology. – 2018. – Т. 58. – №. 8. – С. 658-669.
42. Rahimi-Midani A., Choi T. J. Transport of Phage in Melon Plants and Inhibition of Progression of Bacterial Fruit Blotch //Viruses. – 2020. – Т. 12. – №. 4. – С. 477.
43. Rahimi-Midani A. et al. Potential use of newly isolated bacteriophage as a biocontrol against Acidovorax citrulli //Archives of microbiology. – 2020. – Т. 202. – №. 2. – С. 377-389.
44. Kimmelshue C., Goggi A. S., Cademartiri R. The use of biological seed coatings based on bacteriophages and polymers against Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis in maize seeds //Scientific reports. – 2019. – Т. 9. – №. 1. – С. 1-11.
45. Holtappels D. et al. Preparing for the KIL: receptor analysis of Pseudomonas syringae pv. porri phages and their impact on bacterial virulence //International journal of molecular sciences. – 2020. – Т. 21. – №. 8. – С. 2930.
46. Ogunyemi S. O. et al. Identification and characterization of five new OP2-related Myoviridae bacteriophages infecting different strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae //Journal of Plant Pathology. – 2019. – Т. 101. – №. 2. – С. 263-273.
47. Pinheiro L. A. M. et al. Use of phage ϕ6 to inactivate Pseudomonas syringae pv. actinidiae in kiwifruit plants: In vitro and ex vivo experiments //Applied microbiology and biotechnology. – 2020. – Т. 104. – №. 3. – С. 1319-1330.
48. Flores O. et al. Characterization of Bacteriophages against Pseudomonas Syringae pv. Actinidiae with Potential Use as Natural Antimicrobials in Kiwifruit Plants //Microorganisms. – 2020. – Т. 8. – №. 7. – С. 974.
49. Rabiey M. et al. Phage biocontrol to combat Pseudomonas syringae pathogens causing disease in cherry //Microbial biotechnology. – 2020. – Т. 13. – №. 5. – С. 1428-1445.
50. Schwarczinger I. et al. Characterization of Myoviridae and Podoviridae family bacteriophages of Erwinia amylovora from Hungary-potential of application in biological control of fire blight //European Journal of Plant Pathology. – 2017. – Т. 149. – №. 3. – С. 639-652.
51. Born Y. et al. Engineering of bacteriophages Y2: dpoL1-C and Y2:: luxAB for efficient control and rapid detection of the fire blight pathogen, Erwinia amylovora //Applied and environmental microbiology. – 2017. – Т. 83. – №. 12.
52. Álvarez B., López M. M., Biosca E. G. Biocontrol of the major plant pathogen Ralstonia solanacearum in irrigation water and host plants by novel waterborne lytic bacteriophages //Frontiers in microbiology. – 2019. – Т. 10. – С. 2813.
53. Ibrahim Y. E., Saleh A. A., Al-Saleh M. A. Management of asiatic citrus canker under field conditions in Saudi Arabia using bacteriophages and acibenzolar-S-methyl //Plant disease. – 2017. – Т. 101. – №. 5. – С. 761-765.
54. Balogh B., Nga N. T. T., Jones J. B. Relative level of bacteriophage multiplication in vitro or in phyllosphere may not predict in planta efficacy for controlling bacterial leaf spot on tomato caused by Xanthomonas perforans //Frontiers in microbiology. – 2018. – Т. 9. – С. 2176.
55. Gašić K. et al. Complete genome of the Xanthomonas euvesicatoria specific bacteriophage KΦ1, its survival and potential in control of pepper bacterial spot //Frontiers in microbiology. – 2018. – Т. 9. – С. 2021.
56. Dong Z. et al. Isolation and characterization of a novel phage Xoo-sp2 that infects Xanthomonas oryzae pv. oryzae //Journal of General Virology. – 2018. – Т. 99. – №. 10. – С. 1453-1462.
57. Mahlein A. K. et al. Hyperspectral sensors and imaging technologies in phytopathology: state of the art //Annual review of phytopathology. – 2018. – Т. 56. – С. 535-558.
58. Abdullah A. S. et al. Host–multi-pathogen warfare: pathogen interactions in co-infected plants //Frontiers in plant science. – 2017. – Т. 8. – С. 1806.
59. Bergsma-Vlami M. et al. Phylogenetic Assignment of Ralstonia pseudosolanacearum (Ralstonia solanacearum Phylotype I) Isolated from Rosa spp //Plant disease. – 2018. – Т. 102. – №. 11. – С. 2258-2267.
60. Quibod I. L. et al. The Green Revolution shaped the population structure of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae //The ISME journal. – 2020. – Т. 14. – №. 2. – С. 492-505.
61. Timilsina S. et al. Xanthomonas diversity, virulence and plant–pathogen interactions //Nature Reviews Microbiology. – 2020. – Т. 18. – №. 8. – С. 415-427.
62. Ross A., Ward S., Hyman P. More is better: selecting for broad host range bacteriophages //Frontiers in microbiology. – 2016. – Т. 7. – С. 1352.
63. Hyman P. Phages for phage therapy: isolation, characterization, and host range breadth //Pharmaceuticals. – 2019. – Т. 12. – №. 1. – С. 35.
64. Svircev A., Roach D., Castle A. Framing the future with bacteriophages in agriculture //Viruses. – 2018. – Т. 10. – №. 5. – С. 218.
65. Labrie S. J., Samson J. E., Moineau S. Bacteriophage resistance mechanisms //Nature Reviews Microbiology. – 2010. – Т. 8. – №. 5. – С. 317-327.
66. Azam A. H., Tanji Y. Bacteriophage-host arm race: an update on the mechanism of phage resistance in bacteria and revenge of the phage with the perspective for phage therapy //Applied microbiology and biotechnology. – 2019. – Т. 103. – №. 5. – С. 2121-2131.
67. Gómez P. et al. The impact of resource availability on bacterial resistance to phages in soil //PLoS One. – 2015. – Т. 10. – №. 4. – С. e0123752.
68. De Sordi L., Lourenço M., Debarbieux L. “I will survive”: a tale of bacteriophage-bacteria coevolution in the gut //Gut microbes. – 2019. – Т. 10. – №. 1. – С. 92-99.
69. Wright R. C. T. et al. Resistance evolution against phage combinations depends on the timing and order of exposure //MBio. – 2019. – Т. 10. – №. 5.
70. Hernandez C. A., Koskella B. Phage resistance evolution in vitro is not reflective of in vivo outcome in a plant‐bacteria‐phage system //Evolution. – 2019. – Т. 73. – №. 12. – С. 2461-2475.
71. Meaden S., Paszkiewicz K., Koskella B. The cost of phage resistance in a plant pathogenic bacterium is context‐dependent //Evolution. – 2015. – Т. 69. – №. 5. – С. 1321-1328.
72. Born Y. et al. Protection of Erwinia amylovora bacteriophage Y2 from UV-induced damage by natural compounds //Bacteriophage. – 2015. – Т. 5. – №. 4. – С. e1074330.
73. Boulé J. et al. Isolation and characterization of eight bacteriophages infecting Erwinia amylovora and their potential as biological control agents in British Columbia, Canada //Canadian journal of plant pathology. – 2011. – Т. 33. – №. 3. – С. 308-317.
74. Parcey M. et al. Molecular profile of phage infection: A novel approach for the characterization of Erwinia phages through qPCR //International journal of molecular sciences. – 2020. – Т. 21. – №. 2. – С. 553.
75. Gitaitis R., Walcott R. The epidemiology and management of seedborne bacterial diseases //Annu. Rev. Phytopathol. – 2007. – Т. 45. – С. 371-397.
76. Nagy J. K. et al. Penetration and translocation of Erwinia amylovora-specific bacteriophages in apple-a possibility of enhanced control of fire blight //European Journal of Plant Pathology. – 2015. – Т. 142. – №. 4. – С. 815-827.
77. Iriarte F. B. et al. Soil-based systemic delivery and phyllosphere in vivo propagation of bacteriophages: two possible strategies for improving bacteriophage persistence for plant disease control //Bacteriophage. – 2012. – Т. 2. – №. 4. – С. e23530.
78. Ward R. L., Mahler R. J. Uptake of bacteriophage f2 through plant roots //Applied and Environmental Microbiology. – 1982. – Т. 43. – №. 5. – С. 1098-1103.
79. Thomas S. et al. Benefits of hyperspectral imaging for plant disease detection and plant protection: a technical perspective //Journal of Plant Diseases and Protection. – 2018. – Т. 125. – №. 1. – С. 5-20.
80. Pineda M., Pérez-Bueno M. L., Barón M. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data //Frontiers in plant science. – 2018. – Т. 9. – С. 164.
81. Simko I., Jimenez-Berni J. A., Sirault X. R. R. Phenomic approaches and tools for phytopathologists //Phytopathology. – 2017. – Т. 107. – №. 1. – С. 6-17.
82. Mommaerts V., Smagghe G. Entomovectoring in plant protection //Arthropod-Plant Interactions. – 2011. – Т. 5. – №. 2. – С. 81-95.
83. Abdulridha J., Batuman O., Ampatzidis Y. UAV-based remote sensing technique to detect citrus canker disease utilizing hyperspectral imaging and machine learning //Remote Sensing. – 2019. – Т. 11. – №. 11. – С. 1373.
84. De Smet J. et al. Pseudomonas predators: understanding and exploiting phage–host interactions //Nature Reviews Microbiology. – 2017. – Т. 15. – №. 9. – С. 517.
85. Morella N. M. et al. The impact of bacteriophages on phyllosphere bacterial abundance and composition //Molecular ecology. – 2018. – Т. 27. – №. 8. – С. 2025-2038.

РЕФЕРАТ

Отчет 96 страницы, 6 рисунков, 22 таблиц, 366 источников

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ, ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ, ОРГАНИЧЕСКАЯ ПРОДУКЦИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗАЩИТА.

Цель работы – разработка экологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животных для органического животноводства.

Рассмотрены вопросы:

1. Разработка экологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животных для органического животноводства;
2. Изучение продуктивных показателей цыплят-бройлеров;
3. Определение эффективности использования разработанной технологии.

В ходе опытов установленочто в группах цыплят, где санация воздуха осуществлялась с помощью биоцидных препаратов, что бактериальная контаминация воздуха при использовании технологии программирования окружающей микробиоты птицеводческих помещений имеет более низкое значение и обеспечивает микробную контаминацию на более низком уровне, что позволяет нам сделать заключение о возможности и целесообразности использования биоцидных препаратов для санации воздуха помещений.

Полученные положительные результаты позволяют рекомендовать птицеводческим хозяйствам, при выращивании цыплят-бройлеров, проводить профилактическую санацию воздуха птицеводческих помещений путем применения технологию программирования окружающей микробиоты птицеводческих помещений.

К убою на 35 сутки живая масса бройлеров была выше в группах, где применялась технология программирования окружающей микробиоты птицеводческих помещений. Это обеспечило в группах больший выход мяса птицы в живой массе с 1 кв. м площади пола по сравнению с группами, где санация не осуществлялась.

Расчеты показали, что на каждый вложенный рубль при использовании нового метода обеззараживания воздуха экономическая эффективность ветеринарных мероприятий составляет 25,5 руб.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Среди животного мира птица имеет ряд биологических особенностей. Куры дают такие важные продукты для человека как яйцо и мясо. В настоящее время резервы роста их производства используются недостаточно. Несоответствие условий содержания кур, а особенно племенного молодняка сопровождается прежде всего снижением жизнеспособности и их продуктивности. Создание и совершенствование условий содержания кур, как одного из самых скороспелых видов птицы, на сегодня остается проблемой. При этом в условиях интенсивного птицеводства каждый фактор среды (плотность посадки, световой климат, микроклимат и т.д.) и каждый технологический аспект (метод содержания, режим облучения и т.д.) приобретают важное биологическое и экономическое значение. Изыскание тонких и точных приемов улучшения среды обитания или других прямых воздействий факторов ухода и содержания позволяют достигать высокой продуктивности и сохранности птицы.

Существенное влияние на эффективность выращивания молодняка кур оказывает (среди других многочисленных факторов) «лучистое» голодание или неправильный режим использования источников лучистой энергии. Современная промышленность выпускает большое количество различных модификаций облучателей: ультрафиолетовых, инфракрасных и видимого света. Но комплексную проверку эти облучатели с позиции ветеринарной санитарии не проходят, поэтому данная работа и посвящена решению этих актуальных задач.

В современном мире актуальным направлением является изыскание безвредных в экологическом отношении дезинфицирующих веществ и способов дезинфекции при инкубации куриных эмбрионов.Эффективность мясного птицеводства зависит от оптимального функционирования всех звеньев технологического процесса получения продукции на предприятиях отрасли. Одним из важных звеньев этого процесса является микроклимат птицеводческих помещений. При обеспечении оптимального микроклимата в птичниках повышается сохранность поголовья птицы и её продуктивность.

Кроме этого, актуально корректировать технологические приемы выращивания молодняка птицы в зависимости от его стартового качества, особенностей оборудования и ассортимента кормов.

Для решения этой проблемы нами была следующая цель работы.

Цель и задачи научного исследования. Цель работы – разработать и испытатьсредства биологической защиты сельскохозяйственных животных, а также определить качествопроведенной дезинфекции помещений объектов ветеринарного надзора, где необходимо противодействовать высококонтагиозным болезням, ежегодно наносящим экономический ущерб животноводческой отрасли, в связи с чем поставлены следующие задачи:

1. Разработать экологически безопасные средства биологической защиты сельскохозяйственных животных для органического животноводства, разработать опытный образец приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений;
2. Изучить продуктивные показателей цыплят-бройлеров в результате применения средств биологической защиты;
3. Определить эффективности использования разработанной технологии.

Научная и практическая ценность работы. Результаты научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ создают теоретическую базу для усовершенствования механизмов повышения продуктивности и качества мяса бройлеров в зависимости от способов содержания, кормления, инактивации и деконтаминации микробиоты воздушной среды птицеводческих помещений с помощью аэрозольного применения сочетанных дезинфектантов формирующих пробиотический фон микробиоценоза птичника с целью реализации концепции органического сельского хозяйства. Позволяют глубже понять характер морфофункциональных изменений, проходящих в организме бройлеров, позволяют понять механизм повышения продуктивных показателей, таких как живая масса, среднесуточный прирост живой массы, затраты кормов на 1 кг прироста живой массы. Они расширяют сведения о регулировании микробного фона птицеводческих помещений комплексными биоцидными препаратами.

Разработка комплексной экологически безопасной технологии производства продукции птицеводства может быть использована в практической деятельности специалистов ветеринарно-санитарного и сельскохозяйственного профиля, в научных целях, являться дополнительным материалом при составлении учебных справочных пособий, чтении лекций и проведении практических занятий в учебных заведениях биологического и сельскохозяйственного профиля.

РАЗДЕЛ I. РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНЫХ СРЕДСТВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ОРГАНИЧЕСКОГО ЖИВОТНОВОДСТВА

Ускоренные темпы развития птицеводства, повышенный уровень концентрации птиц в фермерских хозяйствах промышленного типа напрямую способствуют биологическому загрязнению воздуха. Что в свою очередь связано с нарушением процессов, связанных с технологией выращивания или несоблюдением санитарно-гигиенических норм и требований.

Негативное влияние на животных оказывают следующие факторы воздействия внешней среды, а именно – внешний и внутренний климат помещений для содержания животных и птиц, условия содержания, несоблюдение правил плотности посадки, неправильная технология питания и т.д.

Микробиологическое загрязнение воздушного пространства выглядит как значительная опасность, в ветеринарном понимании, для животных и в свою очередь для человека, а именно – контаминация, обусловленная живыми и погибшими микроорганизмами.

Для создания комфортности и безопасности воздуха необходимо осуществление мероприятий, направленных наснижение содержания микрофлоры содержащейся в нем.

Невозможной задачей является максимальная ликвидация патогенной микрофлоры, которая не имеет смысла, посколькусанитарно-значимые микроорганизмы вместе с сельскохозяйственными животными представляют целую экологическую систему их существования, находящихся в полной и закономерной связи друг с другом. Иначе говоря, в условиях животноводческих ферм и предприятий создается индивидуальнаябиологическая связь и чрезвычайно широкий диапазон патогенных воздействий на макро организм сельскохозяйственных животных.

На основании проанализированных данных предоставленных по дезинфекции аэрозолями согласно «Правил проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» важно отметить, что сущность дезинфекции аэрозолями заключается в том, что водные растворы химических препаратов с помощью аэрозольных генераторов распыляются до туманообразного состояния – аэрозоля. Аэрозольную обработку применяют для профилактической и вынужденной дезинфекции объектов ветеринарного надзора.

Аэрозоль представляет собой газовую смесь, содержащую в немчастицы твердого или жидкого характера. Агрегатное состояние аэрозоля может быть представлено в виде тумана или пыли.

Таблица 1 – Классификация аэрозолей по размеру частиц

Дезинфекционные аэрозоли получают путем применения пневматических, дисковых и термомеханических генераторов аэрозолей̆. Одними из распространенных аппаратов для аэрозольной дезинфекции пневматического типа считаются: аэрозольный переносной аппарат – АПА-20; турбулирующая аэрозольная насадка – ТАН; струйные аэрозольные генераторы САГ-1, САГ-10; аэрозольные генераторы типа «Каскад», Аист-2м и др.

Воздух птицеводческих помещений дезинфицируют физическими и химическими методами.

Физический метод обеззараживания подразумевает коротковолновое УФ-излучение, озонирование и искусственную ионизацию воздуха, то есть биологические и физиологические процессы, осуществленные с помощью наноэлектрочастиц (электронов, протонов, ионов, фотонов) на уровне живых клеток и микроорганизмов.

В помещениях для выращивания молодняка птицы, содержания родительского и промышленного стада кур, уток, гусей и индеек с целью очистки, дезодорации и обеззараживания воздуха, а также предотвращения загрязнения окружающей среды используют установку «Кулон». Установка снабжена бактерицидной лампой ДБ-30 или ДБ-60, эритемой ЛЭ-30 и световой лампой ЛБ- 30. При напольном содержании птицы облучатели устанавливают в шахматном порядке на высоте 2, 3 м от пола на расстоянии 5-6 м друг от друга. Поток лучей от бактерицидных ламп ДБ-30 или ДБ-60 направляют в верхнюю зону помещения, от эритемных и световых – в нижнюю. Источники бактерицидного ультрафиолетового облучения работают в помещениях для выращивания молодняка 10-12 ч, а для взрослой птицы – 8-9 ч в сутки. При возникновении на птицефабрике аэрогенных инфекционных заболеваний (инфекционный ларинготрахеит, грипп, стафилококкоз и др.) бактерицидные лампы работают круглосуточно до полной ликвидации заболевания.

Химические методы дезинфекции воздуха заключаются в использовании аэрозолей дезинфицирующих веществ. В присутствии животных и птиц применяют высокодисперсные аэрозоли 40%-ой молочной кислоты, 20%-го резорцина или йодтриэтиленгликоля из расчета 0,1-0,5 мл на 1 м³, или аэрозоляхлорскипидара из расчета 2 г хлорной извести и 1 г скипидара на 1 м³, аэрозоли йодиноколя из расчета 1 мл/м3 5%-го раствора препарата при экспозиции 30 мин, антисептик Бактерицид в 0,5%-ной концентрации для аэрозольной дезинфекции птичников с помощью установки АИСТ-2.

Одной очистки воздуха без применения комплексных ветеринарно- санитарных мероприятий в животноводческих помещениях недостаточно. Потому что обработка воздуха, как правило, применяется в качестве заключительного этапа при подготовке животноводческого помещения к производству. Стоит учесть, что для предотвращения нарастания микрофлоры, вызываемой жизнедеятельностью животных и птицы или поступлением микрофлоры извне, особую значимость приобретают превентивные меры и дезинфицирующие вещества, которые можно применять в присутствии животных и птицы, не нарушая производственного процесса.

Воздух всех животноводческих помещений обеспечиваетподходящие условия для развития и формирования микроорганизмов. Микроорганизмымогут находитьсяна частицах пыли,а также содержаться в каплях жидких форм аэрозолей, которые витают в воздухе. Пыль – частица размером до 100 мкм. Пыль с размерными параметрами частиц до 10 мкм представлена взвешенной и витает в воздухе, те, что крупные оседают на поверхностях.

В России птицефабрики имеют одну из важных проблем – вытяжной системой вентиляции, одного из которых на 720 тысяч птиц, в течение часа в атмосферный воздух выбрасывалось только пыли порядком до 41,4 кг, около 174,8 млрд микроорганизмов

Вусловиях птицефабрик, в которых бактериальнаяконтаминация воздуха превышала 80-100 тыс. в 1 м³ воздуха, происходил процесс снижения продуктивности, который приводил к летальному исходу сельскохозяйственных птиц. При содержании птицы на поверхности пола в период осуществления процесса кормления в момент дачи комбикормов рассыпчатой формы в воздухе помещений, где содержится птица увеличивается содержание пыли, а также микроорганизмов в девять-десять раз в сравнении с фоновой концентрацией. Ежедневно в присутствии птицы количество микроорганизмов в воздухе помещений повышается. В нулевой день выращивания цыплят количество микроорганизмов составляло 45-65 тыс. КОЕ/м³, а в возрасте птицы 120-150 дней достигало миллиона в том же объеме воздуха.

Поэтомумероприятия, направленные на профилактику заболеваний, базируются на основном понимании референтного значения количества микроорганизмов в окружающей среде и их свойств.

Согласно методическому указанию 4.2.734-99 «Микробиологический мониторинг производственной среды», важно своевременное определениеколичества микробной контаминации. Существует два метода – пассивный и активный. Пассивный метод подразумевает использование плотных питательных сред в открытых чашках Петри. Микроорганизмы, витающие в воздухев течение пятнадцати минут,осаждаются на поверхность плотной питательной среды. Основным недостатком метода является выявление преимущественно крупных частиц и недостоверность в объеме исследуемой пробы. При активном методе микробиологического контроля воздуха является применение импакторов и центрифужных пробоотборников, с применением плотной агаровой питательной среды. Активный метод наиболее востребован на современном рынке. Широко применяются аэрозольные пробоотборники такие как Флора-100, ПУ-1Б, Biotest RCS и др.

Поэтому, своевременный контрольмикропопуляций микроорганизмовв воздухепредоставляет адекватно оценить степеньбезопасности и своевременно производить профилактику, и исключать возможность возникновения многих инфекционных аэрогенных заболеваний.

Известно, что микроорганизмы могут адаптироваться к различным экологическим, физико-химическим факторам, и поэтому не удивительно, что формируется устойчивость к широко используемым антисептикам и дезинфицирующим средствам. Из основных и защитных механизмов, является способность – образовывать споры и защитные биопленки. В этих случаях, защитные функции микроорганизмов формируют толерантность; развитие защитных функций, позволяет микроорганизмам выживать в присутствии активного агента. В свою очередь, при выборе методов борьбы по предотвращению инфекционных заболеваний необходимо учитывать все особенности микроорганизмов к самосохранению.

Существуют различные способы микробиологического анализа воздуха, которые используются как образцы биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений. Недостоверность способов может быть заключена в том, что существует риск неточной постановки анализа, за счет того, что посев осуществляют в процессе взятия пробы воздуха. Некоторые колониеобразующие единицы могут напрямую не контактировать с поверхностью плотной питательной среды, и могут остаться в своеобразном «дремлющем» состоянии, за счет чего процесс образования колоний может остановиться, что и приводит к неточности постановки анализа. Также некоторая часть микроорганизмов остается незамеченной, что также влияет на конечный результат анализа. Анализ известных способов и устройств позволяет построить приоритетное направление по разработке нового подхода контроля качества аэрозольной дезинфекции, а именно разработка опытного образца биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений.

Предложена разработка, которая сводится к повышению точности контроля качества аэрозольной дезинфекции воздуха животноводческих помещений. Точность исследований повышается за счет применения нового опытного образца биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений, включающего осаждение дезинфицирующих средств на поверхность питательных сред, содержащих в себе тест-культуры микроорганизмов с последующей доставкой проб в термостат и подсчетом результатов – наличие или отсутствие роста микроорганизмов.

Эффект достигается путем применения разработанных нами биотест-систем in vitro, содержащие тест-культуры микроорганизмов, например, группы кишечной палочки (бруцеллез, лейкоз, сальмонеллез и т.д., т.е. малоустойчивые (1-я группа) к хим. дез. средствам), стафилококки (туберкулез, ящур, орнитоз, чума, неклассифицированные вирусы и т.д. – устойчивые и высокоустойчивые (2-, 3-я группа)), микобактерии или спорообразующие аэробы рода Bacillus (сибирская язва, злокачественный отек, брадзот и т.д. – особо устойчивые (четвертая группа)) на питательных средах, например, мясопептонный агар, которые подбираются по группам устойчивости к химическим дезсредствам.

1. Опытный образец приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений (общий вид)

В условиях Учебно-научного вивария факультетов ветеринарной медицины и технологического менеджмента проведена дезинфекция животноводческого помещения объемом 75 м³ с целью испытания опытного образца приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений.

Дезинфекция проведена аэрозольным методом при помощи генератора холодного тумана SM B-100 (Южная Корея), дезинфицирующим препаратом «MAGOВиродекс». Концентрация препарата – 3 % по действующему веществу. Температура воздуха в помещении – 21-26^о С. Температура рабочего раствора составляла 19-20^о С. Расход дезинфицирующего раствора – 30 мл/м³. Время экспозиции – 3 ч. После дезинфекции помещение оставлено открытым на 1 ч. Остатки рабочего раствора разбавляли водой. Всего обработано 1 помещение для содержания животных, площадь – 30м², объем – 75 м³.

Приборно-лабораторный комплекс концентрации микроорганизмов (ПЛККМ) выдерживали в помещении после дезинфекции 1, 2, 3 ч с последующим термостатированием и проведением лабораторных испытаний.

1. Аэрозольная дезинфекция генератором холодного тумана SM B-100 (Южная Корея)

Для удобства проведения лабораторных испытаний нами произведена разметка и нумерация опытных образцов биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений (далее – биотест-систем). Нумерация представлена в таблице 2.

Таблица 2 Схема разметки опытных образцов биотест-систем и их расположения в опытном образце ПЛККМ

В опытный образец биотест-систем в лабораторном ламинарном шкафу (рисунок 14, 15, 16) нами нанесены тест-культуры E. coli шт. 1257 на поверхности скошенной среды Эндо (n=10 (10 (1а-е, 2a-e)), а также тест-культуры S. aureus шт. 209-P на поверхности скошенного солевого мясо-пептонного агара (n=10 (3a-e, 4a-e)), которые поместили в опытный образец ПЛККМ. Кратность испытаний составила 7 раз. Всего исследовано образцов – 420 (E. coli шт. 1257 – 210, S. aureus шт. 209-P – 2010).

Рисунок 3 — Нанесение тест-культур E. coli шт. 1257 и S. aureus шт. 209-P на поверхности скошенной среды Эндо и скошенного солевого мясо-пептонного агара

Таблица 3 — Результаты испытаний

Примечание:* – рост тест-культур в образцах биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений № 2d;

** – рост тест-культур в образцах биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений № 3c, 3e ,4a, 4c, 4d, 4e;

1а-е, 2a-e (Е. coli); 3a-e, 4a-e (Staph. aureus) – номера опытных образцов биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений.

Из таблицы 3 следует, что после 1 ч экспозиции опытного образца ПЛККМ наблюдается рост тест-культур E. coli шт. 1257 в образце биотест-системы in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений № 2d, через 2 и 3 ч экспозиции рост отсутствует. При этом после 1 ч экспозиции наблюдается рост тест-культуры S. aureus шт. 209-P в образцах биотест-систем № 3c, 3e ,4a, 4c, 4d, 4e, а после 2 и 3 ч экспозиции рост культур отсутствует.

Таблица 4 — Результаты испытаний

Примечание:* – рост тест-культур в образцах биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений № 2a, 1d;

** – рост тест-культур в образцах биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений № 3a, 3c, 3d, 3e, 4c, 4d, 4e;

1а-е, 2a-e (Е. coli); 3a-e, 4a-e (Staph. aureus) – номера опытных образцов биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений.

Результаты испытаний, приведенные в таблице 4 позволяют установить, что рост тест-культур происходил только после 1 ч экспозиции в образцах биотест-систем № 2a, 1d и № 3a, 3c, 3d, 3e, 4c, 4d, 4e.

Таблица 5 — Результаты испытаний

Примечание:* – рост тест-культур в образцах биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений № 3c, 4b;

3a-e, 4a-e (Staph. aureus) – номера опытных образцов биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений.

Из результатов испытаний, приведенных в таблице 5 установлено, что после 1, 2, 3 ч экспозиции рост тест-культур E. coli шт. 1257 в образце биотест-системы in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений отсутствует. Несколько иная картина наблюдается в образцах биотест-систем № 3c, 4b в которых после 1 ч экспозиции отмечен рост тест-культуры S. aureus шт. 209-P, при этом при других режимах экспозиции роста не было.

В результате лабораторных испытаний опытного образца ПЛККМ установлено, что эффективность контроля качества аэрозольной дезинфекции подтверждается через 2, 3 и более часов экспозиции. Так, например, трудно поддающимися обеззараживанию были тест-культуры S. aureus шт. 209-P менее устойчив к действию испытуемого препарата, чем E. coli шт. 1257, рост которых наблюдали через 1 ч экспозиции.

1. Результат лабораторных испытаний опытного образца ПЛККМ (1 – нет роста тест-культур E. coli шт. 1257; 2 – есть рост тест-культур S. aureus шт. 209-P)

По нашему мнению, опытный образец ПЛККМ, содержащий опытные образцы биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений, обладает высокой эффективностью по определению качества аэрозольной дезинфекции, применение которого позволяет более точно определить качество аэрозольной дезинфекции в труднодоступных местах объектов ветеринарного надзора.

Полученные результаты лабораторных испытаний опытного образца ПЛККМ согласуются с Правилами проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора (2002).

Микробиологические исследования по определению и влиянию экологически безопасных средств биологической защитысельскохозяйственных животных на условно-патогенную и патогенную микрофлору воздушной среды птичника проводили в условиях лаборатории кафедры эпизоотологии и микробиологии.

Для проведения испытаний было сформировано две группы цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8», контрольная и опытная.

Цыплят контрольной и опытной групп выращивали в аналогичных боксах объемом 6,8 м³, площадью пола – 3,5 м² с напольной технологией содержания. Каждый бокс содержит отдельный вход, санитарный пропускник, оснащенный дезинфицирующим ковриком, регулируемую приточно-вытяжную вентиляционную систему.В качестве подстилочного материала использовали резаную солому.

В определенные сроки выращивания цыплят-бройлеров (1, 7, 14, 21, 28 и 35 суток) был проведен контроль качества дезинфекции бактериологическим методом согласно «Правилам проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора»и «Рекомендациям по санитарно-микробиологическому исследованию смывов с поверхностей объектов, подлежащих ветеринарному надзору» а также при помощи опытного образца приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений.

Для бактериологического исследования в научно-испытательную лабораторию кафедры эпизоотологии и микробиологии из вивария кафедры частной зоотехнии, селекции и разведения животных факультета технологического менеджмента ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет» доставлены пробы воздуха из 2-х боксов для выращивания цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8».

Пробирки с образцами воздуха помещали в термостат для культивирования микроорганизмов при температуре 37°С на 24 часа, после чего производили идентификацию микроорганизмов из полученной культуры и вычисляли средний арифметический показатель по 3-м результатам.

Исследования уровня общей микробной обсемененности свидетельствует об одном из показателей микроклимата смонтированных боксов в зависимости от применения устройств для санации воздуха в присутствии цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8».

Проведение испытанийэкологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животныхпроводили в идентичных боксах при выращивании цыплят 1-35 дней.

Эффективность обеззараживания воздуха УФ-облучателем в отношении бактерий группы кишечной палочки, стафилококков и грибов, нами изучалась на 35 день исследований.

В начале были отобраны пробы воздуха из бокса для определения исходной бактериальной контаминации. Затем, проводили санацию воздуха

УФ-облучателем и повторно отбирали пробы воздуха. Из отобранных проб воздуха были сделаны бактериологические посевы на среды МПА,Эндо, солевой МПА и Чапека для определения бактериальной контаминации воздуха, а именно: общее микробное число (ОМЧ), бактерии группы кишечной палочки (БГКП), стафилококки и грибы.

Посевы выращивали в термостате при 37^оС в течение 24-48 часов, а грибы – при 22-25^оС в течение 5-7 суток, после чего проводили учет выросших колоний и расчет на 1 м³ воздуха. Результаты бактериологических исследований представлены в таблице 6.

Таблица 6 – Эффективность обеззараживания УФ-облучателя

Примечание: статистическая значимость различий данных достоверна с исходным фоном в боксе: * – p<0,05.

Из таблицы 6 видно, что в воздухе бокса общее микробное число составляло 48,25 тыс./м³. Количество бактерий группы кишечной палочки в 1 м³ воздуха составляло 6,99 тыс., а стафилококков и грибов соответственно 11,11 и 9,51 тыс. колоний.

Установлено, что после посадки суточных цыплят, последующей их жизнедеятельности, наличия подстилочного материала, комбикорма, воды и помета уже в первые сутки количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха в боксе I и II увеличилось до 2193 и 1706 микробных тел/м³ соответственно. Значительное снижение бактериальной обсемененности воздуха в опытной группе цыплят обеспечивалась УФ-облучателем.

В двух недельном возрасте цыплят – конец стартового периода выращивания мясного молодняка кур, отмечалось снижение общего микробного числа в воздухе боксаII, при работе устройств для санации воздуха, на 32,8% (p <0,05), соответственно, в сравнении с контролем.

В возрасте трех недель отмечалось уменьшение количества микроорганизмов в воздухе бокса II на 35,4% (p <0,05), соответственно, в сравнении с контролем.

На двадцать восьмой день – завершение условного периода роста бройлеров, отмечалось уменьшение количества микроорганизмов в воздухе боксаII на 35,9% (p <0,05), соответственно, в сравнении с контролем.

На тридцать пятый день или к возрасту убоя птицы зафиксировано снижение количество микроорганизмов в воздухе боксов II на 37,6% (p <0,05) соответственно в сравнении с контрольным.

Тем не менее, по нашим данным, в течение 35 дней во всех боксах – зонах выращивания цыплят, микробное давление естественным образом увеличилось от уровня до посадки птицы в среднем в 34 раза.

Полученные положительные результаты позволяют рекомендовать птицеводческим хозяйствам, при выращивании цыплят-бройлеров, проводить профилактическую санацию воздуха птицеводческих помещений путем применения УФ-облучателя.

Результаты исследований согласуются с действующими «Методическими рекомендациями по технологическому проектированию птицеводческих предприятий РД-АПК 1.10.05.04-13».

Так же нами были проведены исследования по влиянию биоцидного препарата МАГО ВИРОДЕКС на организм цыплят-бройлеров и микробный фон.

Так согласно «Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» при большинстве вирусных заболеваний показателем качества проведенной дезинфекции служит отсутствие и наличие роста стафилококков.

Результаты проведения микробиологических исследований представлены в таблицах 7-9.

Таблица 7 – Сравнительные данные определения общего микробного числа (ОМЧ) на поверхностях боксов для выращивания бройлеров (КОЕ/см²)

Примечание. Статистическая значимость различий данных (p<0,05) достоверна: * – опытного бокса до аэрозольной дезинфекции с контрольным; ^# – после дезинфекции с показателем до дезинфекции в опытном боксе.

По мере роста цыплят повышалась концентрация микроорганизмов как в опытном, так и в контрольном боксах. Однако в контрольном боксе увеличение ОМЧ происходило более быстрыми темпами. Так на 21, 28 и 35 сутки, до проведения аэрозольной дезинфекции, общее микробное число в опытном боксе было достоверно меньше в сравнении с контрольным боксом на 81,8, 76,7 и 71,1 %, соответственно.

После проведения аэрозольной дезинфекции опытного бокса поликомпозиционным дезинфицирующим средством Маго Виродекс / MAGOVirodex в 14-дневном возрасте цыплят изучаемый показатель снизился в 8 раз, в 21-дневном в 10,3 раза, а в 28-дневном в 4,8 раза. По отношению к контрольному боксу концентрация микроорганизмов в опытном боксе после аэрозольной дезинфекциибыла ниже на 92,4%, 98,2 и 95,2% в 14-дневном, 21-дневном и 28-дневном возрасте, соответственно.

Таблица 8 – Сравнительные данные определения концентрации энтеробактерий на поверхностях боксов для выращивания бройлеров (КОЕ/см²).

Примечание. Статистическая значимость различий данных (p<0,05) достоверна: * – опытного бокса до аэрозольной дезинфекции с контрольным; ^# – после дезинфекции с показателем до дезинфекции в опытном боксе.

Из данных таблицы 5 видно, что количество энтеробактерий на поверхностях в боксах с возрастом птицы увеличивается. Уже к 14-дневному возрасту цыплят их количество увеличилось в 10,9 раза в контрольном боксе и 8,3 в опытном. После проведения первой аэрозольной дезинфекции новым поликомпозиционным средством Маго Виродекс / MAGOVirodex в 14-дневном возрасте цыплят концентрация энтеробактерий в опытном боксе снизилась на 88,9%. После обработки в 21-дневном и 28-дневном возрасте бройлеров отмечено достоверное снижение количества энтеробактерий на 99,2% и 89,0%, соответственно.

Следует отметить, что в опытном боксе с 21 дня выращивания цыплят концентрация энтеробактерий была достоверно ниже, чем в контрольном. Так, в 21-дневном возрасте изучаемый показатель в контрольном боксе был выше на 52,6%, в 28-дневном на 34,8%, а в 35-дневном на 68%, в сравнении с опытным боксом до проведения аэрозольной дезинфекции.

Таблица 9 – Сравнительные данные определения концентрации стафилококков на поверхностях боксов для выращивания бройлеров (КОЕ/см²)

Примечание. Статистическая значимость различий данных (p<0,05) достоверна: * – опытного бокса до аэрозольной дезинфекции с контрольным; ^# – после дезинфекции с показателем до дезинфекции в опытном боксе.

Из таблицы 6 видно, что с момента посадки цыплят и до конца выращивания количество стафилококков на поверхностях контрольного бокса увеличилось в 84 раза, а в опытном боксе, где применялась аэрозольная дезинфекция воздуха новым поликомпозиционным средством Маго Виродекс / MAGOVirodex в присутствии птицы, их количество увеличилось в 28 раз.

При сравнении показателей до и после проведения аэрозольной дезинфекции в опытном боксе отмечается значительное снижение концентрации стафилококков в 14-дневном возрасте цыплят на 78,7%, в 21-дневном на 90,4% и в 28-дневном на 91,0%.

С 21-дневного возраста цыплят отмечена достоверная разница в концентрации стафилококков на поверхностях контрольного бокса и опытного до проведения аэрозольной дезинфекции. Так на 21, 28 и 35 день выращивания птицы, в опытном боксе изучаемый показатель был ниже, чем в контрольном боксе на 55,1, 59,0 и 69,0%, соответственно.

Таким образом проведенные исследования позволяют сделать вывод что применение экологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животных показывают бактерицидное на микрофлору воздуха животноводческих помещений, и их использование в процессе выращивания цыплят-бройлеров ведет к снижению бактерицидной нагрузки на их организм.

РАЗДЕЛ II. ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКТИВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ В РЕЗУЛЬТАТЕ ПРИМЕНЕНИЯ СРЕДСТВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ

Ускоренные темпы развития птицеводства, повышенный уровень концентрации птиц в фермерских хозяйствах промышленного типа напрямую способствуют биологическому загрязнению воздуха. Что в свою очередь связано с нарушением процессов, связанных с технологией выращивания или несоблюдением санитарно-гигиенических норм и требований.

Качество продукции является важным фактором, определяющим здоровье нации и сохранение ее генофонда.

Негативное влияние на животных оказывают следующие факторы воздействия внешней среды, а именно – внешний и внутренний климат помещений для содержания животных и птиц, условия содержания, несоблюдение правил плотности посадки, неправильная технология питания и т.д.

Микробиологическое загрязнение воздушного пространства выглядит как значительная опасность, в ветеринарном понимании, для животных и в свою очередь для человека, а именно – контаминация, обусловленная живыми и погибшими микроорганизмами.

Для создания комфортности и безопасности воздуха необходимо осуществление мероприятий, направленных на снижение содержания микрофлоры содержащейся в нем.

В настоящее время благодаря достижениям селекции в повышении яичной и мясной продуктивности, продолжительность эмбриогенеза кур яичных кроссов увеличилась, а мясных кроссов, наоборот, сократилась в среднем на 6 ч.

Процесс биоконтроля в полном объеме достаточно трудоемкий и без специальных знаний, навыков и оборудования, единообразия приемов, регулярности, оперативной связи с предприятиями, которые производят инкубационные яйца и выращивают молодняк, не всегда достоверно отражает конечные результаты. В связи с этим, он в основном проводится эпизодически, в сокращенном виде или вообще игнорируется.

В современной инкубации относительно температуры существует понятия: температура эмбриона (непосредственно внутри яйца), температура яйца (поверхности скорлупы), температура инкубации (режим работы инкубационной машины). На протяжении значительного периода времени считалось, что определяющим для развития эмбриона является температура инкубации (воздуха внутри машины), и поэтому все инкубационное оборудование было сконструировано именно по этому критерию. Но реальную значимость имеет ощущаемая эмбрионом внутренняя температура яйца. Поскольку измерение температуры эмбриона в процессе инкубации технически затруднительно, поэтому для контроля чаще прибегают к показателю температуры поверхности яйца.

Стоит обратить внимание, что в связи с глобализацией птицеводства, суточный молодняк подвергается транспортировке, длительность которой варьируется от нескольких до одних суток и более.

Факт перевозки даже при минимальной длительности может служить провокацией обезвоживания и развития мочекислого диатеза у суточного молодняка. Поэтому важно учитывать регламент всех манипуляций, особенности используемой тары, эффективность теплоизоляции, обогрева и вентиляции в транспорте – системы жизнеобеспечения птицы.

В случае несоблюдения гигиены яйца или плохой скорлупы, увеличивается возможность проникновения бактерий вовнутрь яйца и, следовательно, под угрозу ставиться безопасность цыпленка в яйце.

Из всех параметров микроклимата в менеджменте выращивания молодняка птицы наибольшее значение имеют температура и влажность воздуха. Отклонения от биологически обоснованных норм неизбежно вызывает средовые или технологические стрессы.

Повышенный уровень смертности стада в возрасте 3-4 дней после посадки при внимательном изучении, объясняется воспалением пупочного кольца (омфалит) и желточного мешка, болезни основными виновниками которых являются Е-коли или другие бактериальные инфекции.

Исследования проводились в виварии кафедры частной зоотехнии, селекции и разведения животных факультета технологического менеджмента ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет» в соответствии с актуальными зоотехническими, микробиологическими и физиолого-биохимическими методиками.

Материалом являются суточные клинически здоровые цыплята-бройлеры кросса «Смена — 8»,

Группы опыта формируются по методике ВНИИТИП по принципу аналогов методом случайной выборки с использованием шкалы оценки качества суточного молодняка сельскохозяйственной птицы «Оптистарт» (таблица 10).

Таблица 10 – Субъективно-объективные критерии качества суточных цыплят-бройлеров по 10-балльной шкале «Оптистарт»

За сутки до посадки цыплят в боксах произведена россыпь резаной соломенной подстилки из расчета 2 кг/м2 толщиной 3 см [РД-АПК] в трех термоизолированных боксах площадью 3,0 м2, высотой 1,95 м (по РДП 2,5 м), объемом 6,8 м3 (3,0х1,95=5,9), создание необходимой температуры (таблица 11), проверка работы технологического оборудования, заполнение системы поения и кормления.

Боксы оборудованы ниппельными поилками с каплеуловителями и круглыми бункерными кормушками с ограничительным бортиком по периметру поддона, а также автономной системой вытяжной вентиляции. Обогрев цыплят в стартовый период (1-14 суток) производится инфракрасными зеркальными лампами из красного стекла ИКЗК мощностью 250 вт. Освещение — энергосберегающими светильниками холодного белого света.

Для поддержания необходимого уровня влажности воздуха в течение первых 5-7 суток осуществлялось 1-2 раза в час его принудительное механическое увлажнение. Световой режим соблюдался по рекомендациям компании «KobbVantress».

Таблица 11– Рекомендуемые показатели в птицеводческих помещениях

Кормление птицыосуществлялось вволю по программе ООО «Агрокормсервис плюс» гранулированными комбикормами «Старт» (крупка, 1-14 дней), «Рост» (гранула, 15-28 дней), «Финиш» (гранула, 29-37 дней) в первые 24-48 часов — с подножной бумаги, до трех-четырех суток – из лотковых кормушек (чистая картонная прокладка для яиц), далее – из бункерных кормушек.

Таблица 12–Питательность рациона кормления цыплят-бройлеров,%

По мере роста и развития цыплят-бройлеров регулировался уровень поилок и кормушек. Верхний уровень бортика стационарной бункерной кормушки тарелочного типа был на уровне груди самых мелких цыплят. Наполнение кормушек на 75% объема кормового поддона для предупреждения россыпей.

На фоне постоянного наличия корма на подножной бумаге и в кормушках 6 раз или каждые 4 часа в первые 5 суток выращивания проводилосьпровокационное предстартовое кормление — добавка корма вручную на бумажную подложку или в кормушку в сочетании с голосовым сопровождением для привлечения цыплят к корму и побуждения его склевывания.

За птицей было установлено наблюдение с регистрацией общеклинического статуса и причин падежа. При наличии патологий, существенно снижающих рост и развитие цыплят (гипотрофия, хондродиплазия, перозис) осуществлялся вынужденный санитарный убой отдельных особей.

В 35 суток по методике ВНИИТИП после 8-часовой предубойной выдержки произведен контрольный убой и анатомическая разделка птицы — по 3 петушка и 3 курочки от каждой группы.

Перед посадкой цыплята-бройлеры были физиологически зрелыми. Средний балл по 10-балльной шкале «Оптистарт» в группе 1 и 2 составил 10,0 баллов, при норме не менее 8,5 баллов. По живой массе они относятся к «гипотрофикам» — средняя живая масса 42,9-44,1 г.

При напольной технологии в закрытых птичниках состояние подстилочного помета в совокупности с вентиляцией и кормлением напрямую влияют на параметры воздушной среды и продуктивность птицы. Азот в помете подвергается аммонификации и денитрификации с выделением аммиака. Аммиак ощущается при концентрации 5 мг/м³, а более 10 мг/м³ или 10 ppm угнетает рост и развитие птицы. Состояние ПП существенно зависит от исходной влажности и влагоемкости подстилочного материала, поголовья и возраста птицы, качества кормов и воды, производительности вентиляции.

Следует отметить, что по мере роста птицы и соответственно увеличением объема выделяемого помета за счет разной его консистенции, напрямую зависящей от эффективности переваримости питательных веществ комбикорма, абсолютная влажность подстилочного помета увеличилась в среднем в 4,8 раза или до 34,4% при оптимальном уровне не более 35,0%. Следует отметить, абсолютная влажность подстилочного помета в группе 2 ниже, чем в группе 1.

Уровень общей микробной обсемененности – один из показателей микроклимата смонтированных боксов.

Сравнительные испытания УФ-облучателяи контрольной группы проведены в идентичных боксах при выращивании цыплят 1–35дней.

Оценка эффективности устройства проводилась по воздействию на бактериальную контаминацию воздуха в боксах. Результаты исследований приведены в таблице 5.

Согласно «Методическим рекомендациям по технологическому проектированию птицеводческих предприятий РД-АПК 1.10.05.04-13» [32], в которых предельно допустимая концентрация микроорганизмов в 1 м³ воздуха составляет: для взрослой птицы 250 тыс. микробных тел, молодняка птицы в возрасте 5-9 недель – 50 тыс. микробных тел, в возрасте 10-14 недель – 100 тыс. микробных тел, а возрасте 15-22 недель – 150 тыс. микробных тел.

Таблица 13 – Бактериальная контаминация воздуха в боксах (тыс. КОЕ/м³) для содержания цыплят-бройлеров

Примечание. Статистическая значимость различий данных (p<0,05) достоверна: * – с I боксом.

Из таблицы 13 следует, что перед посадкой цыплят-бройлеров на выращивание микробный фон в боксах для I и II групп был практически одинаковым. В 1 м³ воздуха содержалось 3,20 и 2,73 тыс. КОЕ/м³ воздуха, что значительно ниже нормы (рисунок 4).

Рисунок 4 –Количество КОЕ/м³ воздуха при выращиваниицыплят-бройлеров

Уже в первые сутки, после поступления суточного молодняка, количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха в боксе I и II увеличилось до 21,93 и 17,06 тыс. КОЕ/м³соответственно. В боксе II, где работал УФ-облучатель бактериальная контаминация воздуха была ниже на 22,2 % в сравнении с контролем (бокс I).

На седьмой день исследований наблюдалось снижение количества микроорганизмов в воздухе боксе II на 33,8 %, соответственно, в сравнении с контролем.

В двух недельном возрасте цыплят – конец стартового периода выращивания мясного молодняка кур, отмечалось снижение общего микробного числа в воздухе бокса II на 32,8 %, соответственно, в сравнении с контролем.

В возрасте трех недель отмечалось уменьшение количества микроорганизмов в воздухе бокса II на 35,4 %, соответственно, в сравнении с контролем.

На двадцать восьмой день – завершение условного периода роста бройлеров — отмечалось уменьшение количества микроорганизмов в воздухе бокса II на 35,9 %, соответственно, в сравнении с контролем.

На тридцать пятый день, или к возрасту убоя птицы, зафиксировано снижение количество микроорганизмов в воздухе бокса II на 37,6 % соответственно в сравнении с контрольным.

А. Ф. Дмитриев и В. Ю. Морозов констатируют, что систематический контроль обсемененности воздушной среды микроорганизмами и снижение их пороговой численности представляет собой необходимое условие научной организации ветеринарно-санитарных мероприятий в птицеводстве.

Данные исследований Р. Р. Канифовой подтверждают сведения о том, что в промышленном птицеводстве с увеличением возраста птицы концентрация микроорганизмов в воздухе помещения повышается. Так, в возрасте птицы 120-150 дней она может достичь миллиона бактерий в 1 м³ воздуха.

В ходе проделанного исследования во II группе цыплят, где обеззараживание воздуха осуществлялось УФ-облучателем, при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8» установлено, что бактериальная контаминация воздуха имеет более низкое значение в сравнении с контрольной группой и обеспечивает микробную контаминацию на более низком уровне. Это позволяет нам сделать заключение о возможности и целесообразности использования устройства для обеззараживания воздуха птицеводческих помещений.

Полученные результаты согласуются с действующими «Методическими рекомендациями по технологическому проектированию птицеводческих предприятий РД-АПК 1.10.05.04-13».

При проведении сравнительных исследований, направленных на изучение влияния обеззараживания воздуха, при помощи экологически безопасных средств– II группа цыплят, была установлена зависимость темпов роста птицы по живой массе в сравнении с данными контрольной группы I, в которой обеззараживание воздуха не осуществлялась.

Результаты исследований по изучению влияния обеззараживания воздуха на продуктивность цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8» представлены в таблице 14.

Таблица 14 – Влияние обеззараживания воздуха на продуктивность бройлеров

Примечание. Статистическая значимость различий данных (p<0,05) достоверна: * – с I боксом.

Из данных таблицы 14 видно, что в недельном возрасте живая масса цыплят II группы в сравнении с I достоверно не отличалась.

На четырнадцатые сутки отмечена тенденция к увеличению живой массы цыплят II группы на 7,2 % а в 3-недельном возрасте цыплят живая масса была достоверно выше на 6,8 % по сравнению с контрольной группой.

На двадцать восьмые сутки живая масса цыплят II группы была выше на 8,9 % в сравнении с живой массой цыплят I группы.

К тридцать пятому дню живая масса цыплят-бройлеров II группы была достоверно выше на 13,5 %, соответственно, в сравнении с контролем.

Начиная с двух недельного возраста и до конца исследований, во II группе цыплят-бройлеров, где обеззараживание воздуха осуществлялась посредством «Рециркулятора вентилируемого воздуха» отмечено существенное увеличение живой массы цыплят в сравнении с контрольной группой» (рисунок 5).

Рисунок 5 – Динамика изменения живой массы цыплят-бройлеров, г

Известно, что увеличению продуктивных качеств цыплят-бройлеров способствует улучшение программы кормления и содержания птицы, включающие в себя, в том числе оптимизацию зоогигиенических условий и снижение микробиологической составляющей воздуха.

Снижение содержания микрофлоры в воздухе птицеводческих помещений, наряду с другими параметрами внутренней среды помещения– температура, влажность, газовый состав, освещенность, определяет его комфортность и безопасность.

На момент проведения исследований птица в двух группах до конца выращивания была клинически здоровой – охотно принимала корм и воду, признаков угнетения или возбуждения не было, и в совокупности с созданными условиями выращивания установлена 100 %-ная ее сохранность.

При создании биологической чистоты воздушной среды в боксе посредством применения устройства «Рециркулятор вентилируемого воздуха» и сбалансированного кормления, цыплята II группы имели высокую продуктивность: живая масса достигла 2233,08 г, а среднесуточный прирост за весь период выращивания – 62,72г, что в свою очередь больше на 13,7 % по отношению к I группе.

По нашему мнению, применение устройства «Рециркулятор вентилируемого воздуха» в сочетании с анолитом для обеззараживания воздуха, способствует формированию оптимального микроклимата в помещениях при выращивании цыплят-бройлеров – основных производителях мяса птицы в нашей стране.

Анализ полученных результатов исследований позволяет сделать заключение, что метод обеззараживания воздуха с использованием «Рециркулятора вентилируемого воздуха» обеспечивает высокую эффективность за счет снижения уровня бактериальной контаминации, что, по нашему мнению, оказало положительное влияние на продуктивность цыплят-бройлеров кросса «КОББ-500».

В созданных зоогигиенических условиях цыплята-бройлеры росли и развивались в группе 2более интенсивно, чем в группе 1, о чем свидетельствует содержание углекислого газа в воздухе, как показателя жизнедеятельности птицы (рисунок 6). При этом во всех группах (боксах) содержание углекислого газа в воздухе было ниже предельно допустимого уровня – не более 0,25 об%. Это указывает на эффективность приточно-вытяжной, особенной при максимальной производительности с 22 дней.

Рисунок 6 – Содержание в воздухе углекислого газа, об%

В результате вышеизложенного цыплята-бройлеры кросса «Смена — 8» в группе 2 росли и развивались лучше, чем при традиционной технологии в группе 1.

Таблица 15– Показатели продуктивности бройлеровкросса «Смена — 8»

Наибольшая в условиях опыта сохранность птицы была в группе 2, в которой использовали для дезинфекции воздуха экологически безопасные средства. Причинами падежа цыплят в группе 1 был асцит.

К убою в 35 суток живая масса бройлеров в группе 2 была равна 2113,6 г, что больше групп 1 на 52,8 г или на 2,6% соответственно. Это обеспечило в группе 2 больший выход мяса птицы в живой массе с 1 кв. м площади пола по сравнению с группой 1 на 7,2%. Реализация генетического потенциала бройлеров кросса «Смена — 8» в группе 1 был реализован на 96,1%, а в группе 2 98,6%. Уровень более 90% соответствует высокому уровню интенсивности производства.

Среднесуточный прирост живой масса за 35 дней выращивания в группе 2 составил 59,1 г, что больше групп 1на 2,6%.

С производственной точки зрения важно, что созданные технологические, зоогигиенические и кормовые условия обеспечили достаточно высокую конверсию корма в мясо птицы в живой массе – в среднем 1,60 кг/кг при норме кросса «Смена — 8» по рекомендации фирмы «Авиаген» 1,55 кг/кг. При этом в группе 2 затраты корма на 1 кг прироста живой массы были ниже, чем в группах 1 на 6,6 %.

В результате индекс эффективности выращивания цыплят-бройлеров, объединяющий сохранность птицы к убою, убойную живую массу, срок выращивания и затраты корма на 1 кг прироста живой массы (EPEF) в группе 1 по сравнению с группой 1 больше на 58 ед.

В соответствии с поставленной целью исследования заслуживают внимания данные о мясных качествах птицы (таблица 16).

Таблица 16– Мясные качества цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8»

Анализ приведенных данных показывает большее влияние на мясные качества цыплят-бройлеров пола птицы, чем технологических и зоогигиенических условий выращивания. Так по совокупности двух групп исследования убойный выход потрошенных тушек петушков и курочек находится в узком диапазоне – 70,3-72,3% и 71,4-72,3%.

Результаты сравнительных исследований по определению воздействия аэрозольной дезинфекции воздушной среды 0,1% раствором поликомпозиционного дезинфицирующего средства Маго Виродекс / MAGOVirodex в присутствии птицы на продуктивные показатели цыплят-бройлеров представлены в таблицах 13-14.

Таблица 17 — Зоотехнические показатели выращивания цыплят-бройлеров.

Средняя живая масса цыплят опытной группы была ниже, чем в контрольной на протяжении всего периода выращивания (таблица 2). Так, в 7-дневном возрасте цыплят разница по живой массе составила 4,7%, а к окончанию опыта – 3,6%, в пользу контрольной группы. Но разница в данном показателе во все периоды была не достоверной. Среднесуточный прирост живой массы цыплят опытной группы в сравнении с контролем был также ниже на 3,6%.

При разделении цыплят по полу в 35-дневном возрасте было установлено, что в опытной группе курочек было 61,8% от общего поголовья, а в контрольной группе — 56,3%. В связи с тем, что темпы роста курочек несколько ниже, чем у петушков, соответственно и средняя живая масса в группе была ниже. Это подтверждается и показателем среднего арифметического значения живой массы между петушками и курочками в 35-дневном возрасте, который в опытной группе был ниже лишь на 2,6%, в сравнении с контролем. Кроме того, отставание в приросте живой массы у цыплят опытной группы началось до проведения первой аэрозольной дезинфекции растворомМаго Виродекс / MAGOVirodex и было не достоверным, поэтому оно не связано с изучаемым фактором.

Цыплята опытной группы отличались более высокой жизнеспособностью. Сохранность поголовья в опытной группе была выше, чем в контрольной на 5,7%. В связи с этим абсолютный прирост живой массы опытной группы был выше на 2,5%, в сравнении с контрольной.Индекс эффективности производства мяса птицы в опытной группе превзошел данный показатель в контрольной группе на8 единиц.

В таблице 3 представлены данные по убойному выходу мяса и массе внутренних органов цыплят-бройлеров в опыте.

Убойный выход петушков опытной группы был незначительно ниже, чем в контрольной группе на 0,4%. Масса внутренних органов находилась в пределах физиологической нормы и значимых различий между группами по данному показателю отмечено не было.

Таблица 18 – Убойный выход и масса внутренних органов цыплят-бройлеров

Показатель	Контроль		Опыт
Предубойная живая масса, г	2270 ±4,8	1991 ±18,7	2168 ±28,1	1854 ±19,6
Масса потрошеной тушки, г	1643 ±7,8	1437 ±16,3	1562 ±23,0	1340 ±18,7
Убойный выход, %	72,4	72,2	72,0	72,2
Сердце, г % от живой массы	13,20 ±0,5 0,58	12,03 ±0,5 0,61	14,3 ±0,9 0,66	11,5 ±1,1 0,62
Печень, г % от живой массы	57,43 ±5,7 2,53	49,8 ±0,8 2,50	55,5 ±4,2 2,56	46,3 ±2,3 2,50
Мышечный желудок, г % от живой массы	26,83 ±1,8 1,18	21,7 ±0,4 1,09	26,3 ±1,2 1,21	19,2 ±0,5 1,03

Основной показатель проведенных сравнительных испытаний – продуктивность, характеристики которой определяются максимальными привесами живой массы мясных пород кросса «Смена — 8».

Известно, что увеличению продуктивных качеств цыплят-бройлеров способствует улучшение программы кормления и содержания птицы, включающее в себя, в том числе, оптимизацию зоогигиенических условий и снижение микробиологической составляющей воздуха.

Снижение содержания микрофлоры в воздухе птицеводческих помещений наряду с другими параметрами внутренней среды помещения: температура, влажность, газовый состав, освещенность – определяет его комфортность и безопасность.

В эксперименте птица во всех группах исследования до конца выращивания была клинически здоровой – охотно принимала корм и воду, признаков угнетения или возбуждения не было, и в совокупности с созданными условиями выращивания установлена 100 % ее сохранность.

При создании биологической чистоты воздушной среды в боксе посредством применения УФ-облучателяи сбалансированного кормления цыплята IIIгруппы имели высокую продуктивность: живая масса достигла 2233,08 г, а среднесуточный прирост за весь период выращивания – 62,72 г, что в свою очередь больше на 7,1 и 13,7 % по отношению к I и II группам, при показателях 55,16 и 58,12 г.

По нашему мнению, применение экологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животных способствует формированию оптимального микроклимата в помещениях при выращивании цыплят-бройлеров – основных производителей мяса птицы в нашей стране.

Анализ полученных результатов исследований позволяет сделать заключение, что экологически безопасные средства обеспечивают высокую эффективность за счет снижения уровня бактериальной нагрузки, что, по нашему мнению, оказало положительное влияние на продуктивность бройлеров кросса «Смена — 8».

Изучение влияния обеззараживания воздуха на качество мяса бройлеров

Для изучения влияния обеззараживания воздуха экологически безопасныхмсредств на качество мяса цыплят-бройлеров в возрасте 35суток был произведен контрольный убой птицы.

Из I и II групп отбирали по три тушки цыплят-бройлеров для подтверждения соответствия требованиям ТР ТС 021 «О безопасности пищевой продукции». Дополнительно были исследованы органолептические показатели тушек цыплят-бройлеров.

Одним из главных критериев оценки качества полученной продукции при изучении влияния обеззараживания воздуха, является исследование органолептических показателей мяса тушек цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8» по ГОСТ 31962–2013 (таблица 19).

Таблица 19 –Органолептические показатели тушек бройлеров
кросса «Смена — 8»по ГОСТ 31962–2013

При исследовании установлено, что органолептические показатели мяса тушек цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8» соответствуют требованиям нормативной документации согласно ГОСТ 31962–2013 и достоверных отличий в исследуемых группах не отмечалось.

Показатели пищевой ценности мяса птицы исследуемых цыплят-бройлеров кросса «Смена — 8» представлены в таблице 20.

Таблица 20 –Пищевая ценность мяса цыплят-бройлеров по ГОСТ 31962–2013

В соответствии с ГОСТ31962–2013 для реализации и производства продуктов питания немаловажными показателями являются массовая доля жира и белка в мясе птицы.

Из данных таблицы 20 следует, что массовая доля жира в мясе птицы контрольной группы была выше на 20,7 % в сравнении с содержанием жира в мясе цыплят II группы.

Массовая доля белка в мясе птицы контрольной группы была ниже на 1,6 % по сравнению с содержанием его во II группе.

Содержание жира в мясе птицы IIгруппы было ниже на 20,7 % чем в I группе, а массовая доля белка в мясе птицы IIгруппы выше на 3,1 %, чем в I группе. Отсюда следует, что мясо цыплят-бройлеров II группы является более полноценным.

Снижение уровня бактериальной контаминации воздуха способствует лучшему обмену веществ, уменьшению отложения жира в мясе и повышению продуктивных качеств за счет лучшего формирования мышечной массы. Результаты наших исследований совпадают с данными А. И. Мирошниковой (2016), Т. С. Александровой (2011) соответствуют справочным данным ГОСТ 31962–2013.

Таблица 21– Результаты микробиологического анализа тушек бройлеров кросса «Смена — 8» по ТР ТС 021/2011

Из таблицы 21 следует, что показатели бактериальной контаминации мяса цыплят-бройлеров при использовании устройства для обеззараживания воздуха соответствуют нормам ТР ТС 021/2011.

При анализе полученных результатов исследований мы можем предположить, что снижение бактериальной контаминации воздуха в птицеводческих помещениях при помощи новых экологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животных с применением нейтрального анолита при выращивании бройлеров кросса «Смена — 8» способствует интенсивному обмену веществ, повышению продуктивных качеств птицы за счет формирования мышечной массы посредством наибольшей массовой доли белка. Применение прибора для обеззараживания воздуха не оказывает отрицательного влияния на органолептические, микробиологические показатели и пищевую ценность мяса бройлеров. Следовательно, внедрение в технологию выращивания цыплят нового устройства для обеззараживания воздуха птицеводческих помещений, птицефабрик позволит получать экологически чистую и доброкачественную продукцию.

В связи с изученными показателями, полученными в ходе опытов при использовании новых экологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животных, применяемых в присутствии птицы в период полного цикла выращивания, мы сделали вывод, что устройство способствует повышению продуктивности и сохранности цыплят-бройлеров.

Раздел III. Определение эффективности использования разработанной технологии

Экономический эффект применения новых биоцидных препаратов в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденной Департаментом ветеринарии.

Эффективность оценивали по сумме полученной дополнительной стоимости продукции цыплят и себестоимости дезинфекционной обработки воздуха на базе птичника Ставропольского края после применения нового метода обеззараживания воздуха в корпусе в присутствии птицы (опытная группа) в сравнении с аналогичным корпусом без использования его (контрольная группа) (таблица 22).

Таблица 22 – Результат проведенных испытаний при выращивании цыплят-бройлеров

Экономическую эффективность оценивали в конце цикла выращивания, по истечению 35 дней.

Дс = (2,2 × 97,5 – 1,9 × 94,7) × 85 × 15000 ÷ 100 = 440767,5 руб.;

Зв = 937 + 303,6 + 14400 + 969,92 = 16610,5 руб.;

Эв = 440767,5 – 16610,5 = 424157 руб.;

Эв = 424157 × 1000 / 15000 = 28277,1 руб.

Таким образом, экономический эффект, полученный при применении новойтехнология по использованию новых биоцидных препаратов нового поколения, составляет 28277,1 руб. на каждые 1000 голов.

Эр = 424157 / 16610,5 = 25,5 руб.

Расчеты показали, что на каждый вложенный рубль при использовании нового метода обеззараживания воздуха экономическая эффективность ветеринарных мероприятий составляет 25,5 руб.

Таким образом, применение новой технология по использованию новых биоцидных препаратов нового поколенияв процессе выращивания цыплят бройлеров является целесообразным и экономически оправданным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате выполнения научно-исследовательских работ, впервые разработан опытный образец биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений. Изготовлен опытный образец приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений. Испытан в лабораторных условиях опытный образец приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений, получены положительные результаты и определена эффективность применении опытного образца приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений. Впервые разработана технология применения опытного образца приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений. Установлено, что применение приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений в производственных условиях позволяет наиболее быстро и точно проводить контроль качества аэрозольной дезинфекции, что способствует формированию наиболее лучших зоогигиенических условий на примере птицеводческих помещений, что в свою очередь благотворно отражается на продуктивности бройлеров. Инновацией разработки является новый экспресс метод контроля качества аэрозольной дезинфекции.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

– легко стерилизуется всеми общепринятыми способами;

– просто в изготовлении и эксплуатации;

– доступна возможность исследования без использования микробиологического бокса, тем самым, исключая необходимость использования лабораторных условий, что существенно сократит время на проведение исследований;

– обладает повышенной эффективностью проведения исследований (не менее 70 %);

– обладает высокой надежностью хранения и транспортировки биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции;

– обеспечивает экологическую безопасность окружающей среды, за счет расположения в герметичной камере;

– возможность работы с микроорганизмами 3–4 группы патогенности;

– низкие затраты на комплектующие;

– позволять проводить испытания при температуре от +2 до +40 ^оС.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при общепринятом методе определения качества аэрозольной дезинфекции отсутствует возможность проверить качество выполненных работ в труднодоступных местах, при этом применение опытного образца биотест-систем in vitro для определения качества аэрозольной дезинфекции помещений позволяет более точно и эффективно определить качество аэрозольной дезинфекции помещений.

Результаты исследований создают теоретическую базу для усовершенствования методов и способов контроля качества аэрозольной дезинфекции животноводческих помещений. Позволяют глубже понять характер микробиологических изменений, проходящих при проведении аэрозольной дезинфекции. Они формируют знания по безопасным методам и способам контроля качества аэрозольной дезинфекции помещений промышленного типа. Опытный образец приборно-лабораторного комплекса концентрации микроорганизмов из воздуха животноводческих помещений может быть использован в деятельности специалистов ветеринарно-санитарного профиля, для составления эффективных схем проведения профилактических ветеринарно-санитарных мероприятий.

Установлено, что снижение микробного числа воздуха в птицеводческих помещениях с помощью экологически безопасных средств биологической защиты сельскохозяйственных животных при выращивании бройлеров кросса «Смена — 8» способствует интенсивному обмену веществ, повышению продуктивных качеств птицы за счет формирования мышечной массы посредством наибольшей массовой доли белка. Применение разработанного прибора для обеззараживания воздуха не оказывает отрицательного влияния на органолептические, микробиологические показатели и пищевую ценность мяса бройлеров. Следовательно, внедрение в технологию выращивания цыплят нового устройства для обеззараживания воздуха птицеводческих помещений позволит получать экологически чистую и доброкачественную продукцию.

Поэтому приобретает актуальность вопрос изучения санитарно-микробиологической оценки качества воздушной среды животноводческих помещений. Объективная и всесторонняя оценка биологического фона воздушной среды может быть проведена при условии применения наиболее эффективных методов обнаружения и анализа бактериальных, вирусных и других аэрозолей.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Реферат

Отчет 50 с., 00 рис,14 табл., 103 источника, 00 прил.

БИОПРЕПАРАТЫ, КОРМОВЫЕ ДОБАВКИ, ЖИВОТНЫЕ, ПТИЦА, ПРОДУКТИВНОСТЬ, ПРОДУКЦИЯ

Объектом исследования является индюки, пороcята, телята, аквакультура.

Цель работы — научное обоснование, технологическая и эколого-экономическая оценка применения новых функциональных кормовых добавок и лечебно-профилактических препаратов биорегулирующей терапии в органическом сельском хозяйстве.

Работа выполняется на основании технического задания на проведение НИР за счет федерального бюджета по заказу МСХ РФ.

В результате проведенных лабораторных, научно-хозяйственных и клинических исследований для органического сельского хозяйства предложена система биорегулирующей терапии с использованием симбиотических препаратов на основепробиотических микроорганизмов B.subtilis и B.licheniformi, природных олигосахаридов, сорбентов и функциональной кормовой добавки«Асидо-Био-Цит» жидкий на основе растительных пептидно-белковых биорегуляторов.

Комплексные исследования позволили установить, чтофункциональная кормовая добавка «Асидо-Био-Цит» жидкий и препарат Стимул 2+ оказывают ростстимулирующее, иммуномодулирующее и гепатопротекторное влияние на организм молодняка индеек, поросят и телят, молоди стерляди, что улучшает физиологическое состояние, функциональную активность органов и тканей, усвояемость кормов и способствует увеличению энергии роста молодняка на 13,1-16,2%. Использование в технологической схеме производства мяса и аквакультурына органических фермах и промышленных комплексахпозволит повысить сохранность поголовья и конверсию корма, снизить применение химических средств защиты и улучшить качество получаемой продукции.

Введение

Пищевая безопасность — одна из актуальныхпроблем современности, так как загрязнение биосферы в последние годы достигло глобальных размеров. Наиболее сильная контаминация вредными и токсичными веществами воздушной и водной среды, почвы, продуктов питания наблюдается в регионах с развитой промышленностью и интенсивным сельским хозяйством. Традиционные способы индустриального производства сельскохозяйственной продукции истощают почву и водные ресурсы, наносят существенный вред окружающей среде и биологическим природным ресурсам [8]. Употребление человеком загрязненных различными ксенобиотиками продуктов питания, чрезмерное использование химических пищевых добавок, генномодифицированных и рафинированных продуктов — все это является причиной нарушения обмена веществ, онкологических, аллергических, кожных и других заболеваний, снижения продолжительности жизни населения. Ксенобиотики вызывают бесплодие и аборты у женщин, имеют отдаленный тератогенный и мутагенный эффект [8,24,65,72].

Единственный путь решения этой актуальнейшей проблемы – это биологизация земледелия и животноводства. Поэтому в начале2000 г. в ЕС возникла европейская инициатива органического сельского хозяйства. (TheEuropeanInitiativeforSustainableDevelopmentinAgriculture — EISA) [1,3,16,18,50].

Основные задачи органического сельского хозяйства: получение продуктов экологически безопасных для человека; охрана природных свойств почв, воды и воздуха; поддержание плодородия почвы; создание максимальных условий для сохранения энергии и сырья [77,78,80,96,97].

Органическое сельское хозяйство в мире развивается высокими темпами. С 2000 по 2018 год он вырос более чем в пять раз (с 18 до 97 миллиардов евро). По прогнозам GrandViewResearch рынок продолжит свой рост со скоростью 10 – 12 % в год и достигнет в 2025 г. порядка 212-230 млрд. долларов. Планируется, что к 2025 году объём рынка органических продуктов может составить от 3 до 5% от мирового рынка сельхозпродукции. Лидером по объёму рынка органической продукции являются США, на которые приходится 44% рынка. Далее идут страны ЕС и Китай.

Российский рынок органической продукции находится в самом начале своего развития. Ее доля в структуре продовольствия в России — около 0,1 %. Для производства «органики» в РФ используется всего 0,3 % пашни. Объем продаж «органики» составляет порядка 10 млрд. рублей при общей емкости рынка продуктов питания в 10 трил. рублей. По разным данным, от 80 до 90 % продаваемых в нашей стране органик-продуктов – импортные [85,92].

По прогнозу аналитиков, в ближайшие годы российский рынок органической продукции будет расти со средним темпом 10-12 %. С 1 января 2020 года вступил в силу федеральный закон об органической продукции, который определил принципы ее производства в РФ и стандарты маркировки. Утвержден и  введен в  действие ГОСТ Р 56508-2015 «Продукция органического производства. Правила производства, хранения, транспортировки», который гармонизирован с регламентами по органическому сельскому хозяйству ЕС.

К производству органической продукции применяются строгие требования. Производство органической продукции должно быть расположено вдали от источников загрязнения окружающей среды, объектов промышленной деятельности, территорий интенсивного ведения сельского хозяйства. Продукция может выращиваться только на чистой почве. Минимальное время для «очищения» земли от химикатов в растениеводстве составляет, в среднем 2–3 года, переходный период в животноводстве и аквакультуре равен 4–24 месяцам[32,93,98].

По требованиям ГОСТ Р 56508-2015 «Продукция органического производства. Правила производства, хранения, транспортировки» в органическом производстве запрещается применять генно-инженерно-модифицированные организмы (ГМО) и продукцию, изготовленную из ГМО или с помощью ГМО, антибиотики, гормоны, ограничен перечень химических средств защиты растений и животных[62,63,64].

В связи с этим, одним из перспективных направлений для органического сельского хозяйства является более широкое внедрение в практику достижений биотехнологии, использования экологически безопасных биологических препаратов, способствующих повышению объемов производства и качества сельскохозяйственной продукции. Весьма перспективным является применение в системе производства органических продуктов питания биологических средств защиты животных, в частности, полиферментных, пробиотических и симбиотических препаратов комплексного действия, созданных на основе биотехнологических приемов культивирования микроорганизмов и природных компонентов растительного и минерального происхождения [29,30,33,39,43,44].

Следует отметить, что производство органических продуктов питания запрещает использование гормонов роста и необоснованное применение антибиотиков. Из-за системного применения антибиотиков в животноводстве,  эффективность их воздействия на организм  заметно снизилась, так как патогенные и условно патогенные бактерии выработали устойчивость к ним. В организме животных развиваются негативные процессы — снижается  численность полезной кишечной микрофлоры. Генетические детерминанты антибиотикоустойчивости, попадая в геномы патогенных видов бактерий, делают вызываемые  ими инфекционные заболевания практически неизлечимыми существующими медикаментами. Нарушения физиологических, иммунологических механизмов защиты организма животных создают условия для развития инфекционных процессов, вызываемых его собственной  патогенной микрофлорой и бактериями-сапрофитами из окружающей среды.

Кроме того, микробный дисбаланс и негативные последствия в отношении здоровья и продуктивности связаны с промышленными приемами ведения животноводства [4,34,40,41,100,101]. Ограничен контакт с почвой, растениями, другими естественными факторами, которые в обычных условиях являются для животных донорами нормальной микрофлоры [2,7,13,15,36,47,48].

Поэтому ведется поиск альтернативных путей профилактики, лечения и кормления продуктивных животных, что предусматривает экологически безопасную коррекцию ветеринарных мероприятий, рационов питания на основе традиционных кормов, создание нового поколения функциональных продуктов, соответствующих требованиям современного животноводства. Особо актуально встает эта проблема при организации органического производства.

В настоящее время теоретическое обоснование получает актуальное направление – биорегулирующая терапия, в основе которой лежит повышение естественной резистентности сельскохозяйственных животных и птицы путем направленного воздействия естественными метаболитами (пептиды, пептоны, органические кислоты, олиго- и полисахариды)[12,45,57,86].

В повышении защитных сил организма важное значение имеют факторы, влияющие непосредственно на активизацию адаптационных способностей и иммунобиологической реактивности птицы, в частности, биологические стимуляторы различной природы. К ним относятся естественные метаболиты, витамины, адаптогены, хелатные соединения микроэлементов, а также бактериальные препараты комплексного действия [16, 17,46,52,53,59,67].

Поэтому при производстве лечебных препаратов и кормовых добавок в последнее время широко используют бактериальные вещества. Микроорганизмы содержат большое количество биологически активных веществ, регулирующих обменные процессы, влияющие на иммунную систему макроорганизма, что позволяет использовать их для созданияиммуномодулирующих препаратов. При этом показано, что действующим началом, полученных из препаратов микроорганизмов, являются соединения ферментной природы, глюканы и пептиды. Они активируют макрофаги, иммунокомпетентные клетки, гормональные процессы в организме [10,11,19,26,28,31,68,70,90,91].

В настоящее время на основе биомассы микроорганизмов непатогенных штаммов разработаны уникальные лечебно-профилактические препараты.Например, «Баксин-вет» [46], «Баксин-КД» [56]. Применение различных дозпрепарата «Баксин-вет» на курах-несушках яичных и мясных кроссов показало положительное влияние оптимальных доз препарата не толькона продуктивность родительского стада кур, естественнуюрезистентность, а также инкубационные качества яиц, вывод цыплят[56].

По данным Е.В. Бессарабовой и др. (2011), использование препарата ГидроЛактиВ, изготовленного из молочной сыворотки с добавлением лактобактерий, оказывает положительное влияние на зоотехнические показатели выращивания бройлеров. ГидроЛактиВ содержит легко усваиваемый кальций и другие микроэлементы в виде высокоэнергетических соединений – лактатов, которые служат источником энергии, способствуют усвоению углеводов и являютсятопливом для печени при производстве глюкозы и гликогена [9].

Перспективной группой являются пептидно-белковые биорегуляторы

с доказанным репаративным и протекторным действием. Многие из них имеют широкий спектр действия за счет восстановления биохимической нормы внутриклеточных процессов. Видонеспецифическое действие позволяет максимально увеличить сферы их применения[38, 61,83,84].

Одним из перспективных направлений является замена антибиотиков пробиотиками – препаратами, содержащими микроорганизмы и вещества микробного и иного происхождения, использующихся в терапевтических целях [5,55,58].

Применение пробиотиков в животноводстве и аквакультуреявляется реинтродуцированием полезной микрофлоры в виде чистой культуры без риска вызвать заболевание. Применение пробиотиков способствует возвращению организма в нормальное физиологическое и поведенческое состояние путём восстановления баланса кишечной микрофлоры и тем самым служит одним из факторов, поддерживающих их здоровье. Лечебный и профилактический эффект этих препаратов обусловлен высокой антагонистической активностью производственных штаммов микроорганизмов относительно патогенной и условно-патогенной микрофлоры, повышении функциональной деятельности иммунной системы и лучшем усвоении питательных веществ корма [14,16,25,36,76,102,103].

Пробиотики в отличие от антибиотиков, не приводят к привыканию со стороны условно-патогенной микрофлоры, продукты их жизнедеятельности не скапливаются в органах и тканях животных и не влияют на качество продукции. Поэтому применение пробиотиковспособствует получению животноводческой продукции высокого качества, безопасной в бактериальном в химическом отношении [24,36,101].

В состав пробиотических препаратов включают типичных представителей нормальной микрофлоры толстого отдела кишечника животных.

К пробиотикам относятся следующие микроорганизмы: лактобактерии (L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. bulgaricus, L. lactis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. fermentum, L. jonsonii, L. gassed); бифидобактерии (B. bifidum, B. infantis, B. longum, B. breve, B. adolescents); непатогенные разновидности EscherichiaColi; непатогенные разновидности Bacillus (В. subtilis); непатогенные разновидности Enterococcus (Enterococcifaecium, Е. salivarius); молочнокислый стрептококк (Str. thermophylus); дрожжевые грибки Saccharomycesboulardii.

Как показывает практический опыт, пробиотики могут быть использованы длястимуляции неспецифичного иммунитета животных; профилактики и лечения смешанных желудочно-кишечных инфекций, при расстройствах пищеварения алиментарной этиологии (дисбактериозы, острые ацидозы и др.); замены антибиотиков в кормах для молодняка животных и птицы, аквакультуры; повышения эффективности использования кормов и продуктивности животных, птицы и аквакультуры; преодоление следствий технологических стрессов, обусловленных вакцинацией, транспортировкам и др. [27,36,37,47,54,55,64,66,71,82,87,89,95].

Действие пробиотических препаратов может быть усилено за счет пребиотиков — веществ, которые не всасываются в тонкой кишке, но создают благоприятные условия и стимулируют рост нормальной микрофлоры толстого кишечника. Собственно к пребиотикам относятся следующие вещества: олигофруктоза, инулин, галактоолигосахариды, парааминобензойная кислота, пантотенат кальция, лактулоза, пищевые волокна (клетчатка), ксилит, хитозан и др.Пребиотики также нормализуют моторику кишечника, адсорбируют микотоксины.

В настоящее время ведутся исследования по разработке эффективных комплексов пробиотиков и пребиотиков (симбиотических препаратов) для животноводства[49,79,81,99].

Сотрудники ВНИИ мясного скотоводства ведут разработки симбиотического препарата, содержащего пребиотик инулин, носитель — пшеничные отруби, на которых адсорбированы живые бактерии Streptoccusfaecium и Lactobacilusacidofilus. Использование препарата при выращивании молодняка крупного рогатого скота способствовало развитию нормальной микорофлоры кишечника, которая уничтожает патогенные микроорганизмы, повышению продуктивности и эффективности производства говядины [66].

На экспериментальной базе ГНУ Всероссийский НИИТИ биологической промышленности РАН был осуществлен комплекс исследований по разработке технологии производства новых симбиотических препаратов — продуцентов лизина с использованием в качестве основы штаммов Е.соli. Симбиотический препарат получают периодическим управляемым глубинным культивированием штамма Е.соli VL 613 в питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрируют полученную культуру, бактериальную массу ресуспендируют в защитной среде и лиофильно высушивают для длительного сохранения биологических свойств симбиотического препарата. Исследована эффективность применения препарата при выращивании цыплят-бройлеров [37].

Установлена эффективность применения в промышленном птицеводстве пробиотических, пребиотических и симбиотических препаратов Ветом 4, Велес 6,59, Витал, Хлорелла, Микросорб. Препараты оказывают положительное влияние на формирование в организме здорового микробиоценоза, который способствует повышению переваримости и усвояемости кормов [79].

Однако в последнее время отмечают, что активность многих пробиотических препаратов не всегда соответствует заявленному эффекту [4]. Врачи не всегда знают о различиях пребиотиков, пробиотиков, симбиотиков. Не учитывают особенности механизма действия, который в первую очередь зависит от того, какие виды микроорганизмов включены в препарат. Негативный результат при работе с конкретным пробиотиком часто вызывает скептическое отношение ко всей группе. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования и разработка высокоэффективных средств биологической защиты животных и птиц.

Эффективность пробиотических препаратов определяется многими факторами: составом, направленностью селекции производственных штаммов, технологией производства. Не менее важна схема применения, которая для каждого препарата строго индивидуальна и в значительной степени определяет результативность [4, 6,73,74]. Одной из сложнейших проблем при изготовлении пробиотиков является отбор бактериальных штаммов, предназначенных для эффективной колонизации желудочно-кишечного тракта, так как штаммы должны выборочно подавлять рост патогенных культур, иметь высокую ферментативную, синтетическую и метаболическую активность, стимулировать иммунобиологические системы организма [25, 75, 76, 87, 88].

Таким образом, разработка эффективных функциональных кормовых добавок и биологических препаратов для биорегулирующей терапии при производстве органических продуктов животноводства и аквакультуры является актуальной.

Цель исследований – научное обоснование, технологическая и эколого-экономическая оценка применения новых функциональных кормовых добавок и лечебно-профилактических препаратов биорегулирующей терапии в органическом сельском хозяйстве.

Задачи исследований:

– изучение мирового опыта, информационных источников и проведение патентного поиска в тематическом поле биорегулирующей терапии и органического сельского хозяйства;

– разработка функциональных кормовых добавок и биологических лечебно-профилактических препаратов на основе пептидно-белковых биорегуляторов, пробиотических микроорганизмов с выраженными ростстимулирующими, иммуномодулирующими, репаративными и гепатопротекторными свойствами;

— оценка влияния кормовых добавок и биопрепаратов на физиологическое состояние, продуктивность животных и качество продукции;

— анализ результатов, оформление отчета по НИР, публикации результатов в ведущих отечественных и зарубежных журналах.

1 Собственные исследования

1.1 Материал и методы исследований

Исследования проводились в ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ, ООО «Агрофирма «Залесный» Зеленодольского района,ООО «Тукаш» Тюлячинского района, МПТК «Джалиль»Сармановского района, КФХ И. И. БатыршинЛаишевского районаРеспублики Татарстан.

Объекты иccледования: индюки, пороcята, телята, аквакультура.

В экспериментальных исследованиях изучалась эффективность применения функциональной кормовой добавки «Асидо-Био-Цит» жидкий(ООО «БИОПЛАЗМА» по ТУ ВY 391157257-011-2014 изм. №1,2,3) и симбиотического препарата Стимул 2+ (ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ)при выращивании сельскохозяйственных животных и птицы, аквакультуры. Препарат Стимул 2+ разработан на основе комплекса пробиотических микроорганизмов B.subtilis и B.licheniformi, природных олигосахаридов и сорбентов.Схема экспериментальных исследований представлена в таблице 1.

Таблица 1 — Схема экспериментальных исследований

Изучение эффективности применения препаратов при выращивании индюковпроводилось в ООО «Агрофирма «Залесный» Зеленодольского района Республики Татарстан. Для опыта были подобраны 150 индюшат самок кросса «Hybrid Converter» в возрасте 28 суток с живой массой 730-740 г, которых разделили по принципу аналогов на 3 группы [69]. Индюки всех групп получали полнорационный комбикорм (ОР+ основой рацион) в соответствии с зоотехническими нормами [42, 65]. Дополнительно к ОР индюки II подопытной группы получали препарат «Асидо-Био-Цит» жидкий, IIIподопытной группы препарат «Асидо-Био-Цит» жидкийи симбиотический препарат Стимул 2+ в дозировке 20 г на 1 кг комбикорма. Кормовую добавку «АсидоБио-ЦИТ жидкий»задавали посредством медикатора в питьевую воду в дозировке 1,0 г/голову в сутки.Продолжительность опыта составила 77 дней.

В течение опыта постоянно проводили наблюдения за физиологическим состоянием птицы, определяли динамику изменения живой массы по результатам индивидуального взвешивания в течение всего периода выращивания, сохранность поголовья. Ежедневно проводили учет заданного и съеденного корма. По результатам поедаемости корма и приростов живой массы была рассчитана конверсия корма.

В начале (фон) и в конце эксперимента у подопытной птицы были взяты пробы крови для определения морфологических и биохимических показателей.

В конце периода откорма индюков (в возрасте 105 суток) были проведены контрольный убой птицы с патологоанатомической оценкой органов и тканей, анатомическая разделка тушек, морфометрический анализ. Отбора проб был проведенсогласно ГОСТ 50396.0-92 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовки к микробиологическим исследованиям», подготовка проб к испытанию по ГОСТ 26669-87 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологического анализа».Качество мяса определяли в соответствии с ГОСТ 31473-2012 « Мясо индеек (Тушки и их части)».

Исследования мяса по микробиологическим показателям проводились согласноГОСТ 32031-2012 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeriamonocytogenes»,ГОСТ Р 50396.1-2010 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов», ГОСТ 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы метод выявления сальмонелл».

В пробах мяса определяли содержание сухого вещества, белка, жира по общепринятым методикам: сухого вещества — высушиванием навески в сушильном шкафу при температуре 105±5°С, белка – на приборе ДК-20; УДК-132 по методике Къельдаля, жира – в аппарате Сокслета.

Для оценки вкусовых качеств мяса проведена комиссионная дегустация мяса и бульона по методике, изложенной А.Т. Мысиком (1986). При органолептическом исследовании мяса определяли: внешний вид, запах, консистенцию, качество бульона при варке мяса (ГОСТ Р 51944-2002 Мясо птицы. Методы определения органолептических показателей, температуры и массы). Дегустационная оценка мяса и бульона проводилась после тепловой обработки (варки) по 9-ти бальной шкале.

Научно-хозяйственный опыт по определению эффективности применения «Асидо-Био-Цит» жидкийи симбиотического препарата Стимул 2+при выращивании поросят-отъемышей был проведён в ООО «Тукаш» Тюлячинского района. Для этих целей было подобрано 90 поросят — отъемышей в возрасте 21 день с живой массой 7,2 кг, которых по принципу аналогов разделили на три группы. Кормление и поение поросят в соответствии с зоотехническими нормами [68]. Поросята в соответствии с возрастным периодом получали полнорационный комбикорм СПК-5 и СПК-6 (ОР-основой рацион).ПоросятамIIи IIIподопытных группдополнительно c питьевой водой выпаивали препарат «Асидо-Био-Цит» жидкийв дозировке 1,0 г/голову в сутки, поросятам IIIподопытной группы –дополнительно добавлялив кормсимбиотический препарат Стимул 2+в дозировке 20 г на 1 кг комбикорма.Продолжительность опыта составила 33 дня.

В течение опыта постоянно проводили наблюдения за физиологическим состоянием поросят, консистенцией кала, определяли динамику изменения живой массы по результатам индивидуального взвешивания в начале и конце опыта, сохранность поголовья. Ежедневно проводили учет заданного и съеденного корма. По результатам поедаемости корма и приростов живой массы была рассчитана конверсия корма.

В начале (фон) и в конце эксперимента у подопытных животных были взяты пробы крови для определения морфологических и биохимических показателей.

Научно-хозяйственный опыт по определению эффективности применения препарата «Асидо-Био-Цит» жидкийпри выращивании телят молочного периода был проведен в МПТК «Джалиль»Сармановского района. Для опыта было отобран 21 животное в возpасте 5 суток, которых разделили по принципу аналогов на 3 группы. Во II подопытной группе на начало опыта было 3 теленка, больных с эймериозом и вирусной диареей крупного рогатого скота. Телята всех гpупп получали хозяйственный рацион, состоящий из ЗЦМ, сена, комбикорма-престартера, соли поваренной, мела кормового. Телятам II подопытной гpуппыи III подопытной группы дополнительно выпаивали c ЗЦМ препарат «Асидо-Био-Цит» жидкий в дозировке 40 мл в сутки на голову по 20 мл с утренним и вечерним кормлением соответственно.Продолжительность опыта составила 38 суток.

В течение опыта постоянно проводили наблюдения за физиологическим состоянием телят, поедаемостью кормов, консистенцией кала, определяли динамику изменения живой массы по результатам индивидуального взвешивания в начале и конце опыта, сохранность поголовья.

Зоотехнический анализ кормов был проведен по общепринятым методикам: сухое вещество — высушиванием навески в сушильном шкафу при температуре 105±5°С, содержание протеина – на приборе ДК-20; УДК-132 по методике Къельдаля, жира – в аппарате Сокслета, сырой клетчатки – по методу Геннеберга и Штоманаобработкой навеки смесью концентрированной азотной и 80%-ной уксусной кислот; сырой золы – методом сухого озоления; кальций – трилонометрическим методом с индикатором флуорексоном; фосфора – спектрофотометром УВ-1280.

В начале (фон) и в конце эксперимента у подопытных животных были взяты пробы крови для определения морфологических и биохимических показателей. Подсчет форменных элементов выполняли согласно методу, описанному в Справочнике по клиническим лабораторным методам исследования (М., 1975). Показатели средний объем эритроцита (MCV), содержание гемоглобина в отдельном среднем эритроците (MCH) и цветовой индекс определяли методом расчета по соответствующим формулам. Лейкоцитарную формулу подсчитывали на мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, СОЭ определяли по методу Панченкова.

Содержание кальция и глюкозы определяли колориметрическим методом, общего белка – биуретовым колориметрическим методом, мочевину – уреаза-глютамат-дегидрогеназный кинетическим методом, глюкозу – колоpиметpичеcким методом, холестерин – ферментным колориметрическим методом, аланинаминотpанcфеpазу (АЛТ), аcпаpтатаминотpанcфеpазу(АCТ), общий билиpубин – колоpиметpичеcким методом.

Научно-хозяйственный опыт по определению эффективности применения препарата Стимул 2+ при выращивании аквакультуры(молодняк стерляди) был проведен в КФХ И.И. Батыршина Лаишевского района. Базой для эксперимента служили аквариумы объемом 50-60 л. Температура воды в течение дней выращивания находилась в пределах +20°С. Во всех аквариумах применялась аэрация. Кормили рыбу комбикормом SteCoSUPRIME (произ. Нидерланды). Вторая подопытная группа дополнительно получала сухой пробиотик «Субтилис» из расчета 40 г на 1 кг комбикорма, третья подопытная группа дополнительно получала препарат Стимул 2+ из расчета 20 г на 1 кг комбикорма. Продолжительность опыта составила 30 дней.

В течение опыта постоянно вели наблюдения за состоянием рыбы, поедаемостью корма, изменение живой массы определяли путем взвешивания в начале и в конце эксперимента.

Цифровой материал, полученный в результате исследований, обработан по стандартным программам вариационной статистики. Разницу по средним показателям считали достоверной по t-критерию Стьюдента.

1.2 Результаты исследований

1.2.1 Изучение химического состава, органолептических показателей и токсикологических свойств препаратов

Изучение химического состава и органолептических показателей препарата «Асидо-Био-Цит» жидкий»показало, что препарат соответствует требованиям ТУВY 391157257-011-2014 (изм. №1,2,3) (таблица 2).

В составе «Асидо-Био-Цит» жидкий»содержатся:инозитольные, лецитиновые,эссенциальныеполиеновые кислоты, в т.ч. арахидоновая и омега-3антиоксиданты (кофермент Q10, каротиноиды); ферменты рибонуклеаза, протеаза, коллагеназа, полисахариды (маннаны, b-глюканы), органические кислоты, микроэлементы ( K, Mg, F и др.), витамины А, группы В, F, H [1].

Таблица 2 — Органолептические показатели и химический состав препарата

Изучение токсикологических свойств (острой токсичности) препарата проведены сотрудниками кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы академии. Опыты проводили на клинически здоровых лабораторных мышах в соответствии с «Методическимирекомендациями по токсико-экологическойоценкелекарственных средств, применяемых в ветеринарии» (Аргунов М.Н., Сафонова Л.Б., Василенко В.В., Воронеж, 1998).

Изучение острой токсичности было проведено на 5 группах белых мышей (n=10) , массой 18-20 г.

Мышам первой группы ввели натощак в желудок 0,5 мл 50% суспензии на крахмальном клейстере рабочего раствора препарата, что соответствует 12500 мг/кг массы животного. Мышам второй группы ввели натощак в желудок 0,25 мл 50% суспензии на крахмальном клейстере рабочего раствора препарата, что соответствует 6250 мг/кг массы животного. Мышам третьей группы ввели натощак в желудок 0,25 мл 25% суспензии на крахмальном клейстере рабочего раствора препарата, что соответствует 3125 мг/кг массы животного. Мышам четвертой группы ввели натощак в желудок 0,25 мл 12,5% суспензии на крахмальном клейстере рабочего раствора препарата, что соответствует 1562,5 мг/кг массы животного. Мышам пятой группы ввели натощак в желудок 0,5 мл крахмального клейстера. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней.

Результаты исследований показали, что в период опыта гибели животных не было. Обще состояние мышей было удовлетворительным, животные всех групп охотно принимали воду и корм. Поведенческие рефлексы не нарушены, реакция на внешние раздражители нормальная. Побочных явлений не наблюдалось. Среднесмертельная доза (LD 50) для лабораторных мышей препарата «Асидо-Био-Цит» жидкий»составляет более 25000 мг/кг массы тела, что согласно ГОСТ 12.1007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования» позволяет классифицировать препарат как малотоксичный – IV класс токсичности.

1.2.2Изучение эффективности применения биологических препаратов и функциональной кормовой добавки при выращивании индюков

Наши исследования показали, что использование препаратов «Асидо-Био-Цит» жидкий» и Стимул 2+ при выращивании молодняка индеек оказало положительное влияние на улучшение всех основных зоотехнических показателей у птицы. К концу опыта сохранность поголовья в контрольной группе составила 96%, во второй и третьей группе 98,0%.Живая масса птицы контрольной группы составила 8520 г, у индеек, получавших препараты, этот показатель увеличился на 12,2% и 13,5% и составил соответственно по группам 10377 г и 10500 г (р<0,001). Среднесуточные приросты живой массы индеек также были больше контроля: во второй группе на 13,1%, атретьей группе — на 14,6%, При этом затраты корма на 1 кг прироста живой массы у птицы, получавших препараты уменьшились на 11,8% и 13,0%, что связано с повышением усвояемости комбикорма (таблица 2).

Таблица 2 – Влияние препаратов «Асидо-Био-Цит» жидкий» и Стимул 2+на рост индеек и конверсию корма

Примечание: здесь и далее (р<0,05) *, (р<0,01) **, (р<0,001) ***

Физиологическое состояние экспериментальной птицы оценивалось по общему внешнему виду, поведению и результатам морфологического и биохимического исследования крови.Было отмечено, что в течение опытного периода все экспериментальные индейки были клинически здоровы, имели хороший аппетит, хорошую реакцию на внешние раздражители, не было никаких признаков заболеваний. Помет индеек всех групп имел нормальный внешний вид, цвет и консистенцию и не было признаков нарушения пищеварения, что указывало на нормальное функционирование желудочно-кишечного тракта.

Гематологический анализ относится к числу методов, которые могут способствовать выявлению некоторых изменений в состоянии здоровья и могут быть полезными для диагностики заболеваний у птиц.Морфологический состав крови индеек представлен в таблице 3.

Таблица 3 – Морфологические показатели крови подопытных индеек(n=5)

Анализ таблицы 3 показывает, что использование «АсидоБио-ЦИТ» жидкий» и Стимул 2+достоверно увеличивает по сравнению с контрольными показателями в крови экспериментальных индеек количество гемоглобина и эритроцитов: во второй группе на 8,15% и 8,29% , в третьей группе – на 3,7% и 10,6% соответственно. По содержанию нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов в крови между группами достоверной разницы не отмечено.

Биохимические показатели сыворотки крови индеек представлены в таблице 4. По сравнению с контрольной группой в крови индеек, получавших препараты «АсидоБио-ЦИТ» жидкий» и Стимул 2+достоверно увеличилось содержание кальция: в крови индеек второй подопытной группы на 4,0%, третьей группы на 3,3% соответственно.

Таблица 4 — Биохимические показатели сыворотки крови подопытных индеек(n=5)

Таким образом, увеличение количества эритроцитов и гемоглобина в крови индеек экспериментальных групп может свидетельствовать о том, что препарат стимулирует процессы эритропоэза и синтеза белка, что подтверждается более высокими темпами роста, продуктивности и развития птицы.

В конце опыта был проведен убой по пять голов индеек из каждой группы. Убой проводили после 12-тичасового голодания. Результаты исследований представлены в таблицах5 и 6.

Таблица 5 – Мясная продуктивность подопытных индеек(n=5)

Анализ данных контрольного убоя показал, что использование биологических препаратов при выращивании индеек положительно повлияло на мясную продуктивность птицы. Индейки второй и третьей подопытной групп имели большую предубойную массу, массу полупотрошенной и потрошенной тушек. У индеек, получавших «АсидоБио-ЦИТ» жидкий», эти показатели были больше контроля соответственно на 0,11% и 0,09%, препарат «АсидоБио-ЦИТ» жидкий» в сочетании с препаратом Стимул 2+ — на 0,35% и 0,29%(р<0,001).

При изучении морфометрических параметров массы тушек и некоторых внутренних органов выявили достоверное повышнеие абсолютноймассы печени, селезенки и сердца у индеек подопытных групп, что коррелирует с их большей предубойной массой (таблица 5). Однакоотносительная масса этихорганов находилась в пределах физиологической нормы для данного вида и возраста птицы.

Макроскопические данные показали, что морфология мышечной ткани белого и красного мяса, а также внутренних органов (селезенка, печень, почки, желудочек, желудок и сердце) не имеет существенных различий и без патологических изменений.

Таблица 6 – Масса внутренних органовподопытных индеек(n=5)

Как известно, микробиологическое исследование является одним из важнейших показателей качества мяса.Как правило, в мышцах и внутренних органах любого здорового животного, которые были забиты по асептическим правилам, нет микроорганизмов. Однакоиз-за посмертной инфекции убойных животных на мясоперерабатывающих заводах продукты убоя могут содержать различные сапрофитные микроорганизмы (гнилостные бактерии, бактерии семейства Escherichiacoli, споры плесени, актиномицеты и т. д.), а иногда и сальмонеллы, листерии и др.

Результаты оценкимяса всех групп показали, что микробиологические показатели не превышают допустимый предел (таблица 7). Однако по сравнению с первой контрольной группой в мясе индеек второй и третьей подопытных групп уменьшилось количество КМАФАнМ.

Таблица 7 — Микробиологическая оценка мяса подопытныхиндеек(n=3)

Качество мяса по органолептическим и физико-химическим показателям соответствует требованиям ГОСТ.

Таким образом, использование «АсидоБио-ЦИТ» жидкий» и симбиотического препарата Стимул 2+ при выращивании индеек приводит к улучшению общего состояния здоровья птиц и повышению продуктивности. Добавление в питьевую воду препарата «АсидоБио-ЦИТ» жидкий»предотвращает размножение в воде патогенных микроорганизмов, увеличивает «кислотосвязывающую способность» корма,поддерживает уровеньpH по всей длине пищеварительного тракта за счет синергетического действия органических кислот, которые функционально дополняют друг друга, что укрепляет иммунную систему птицы и уменьшает количество патогенных бактерий в пищеварительном тракте, улучшает усвояемость корма, положительно влияет на рост и развитие птицы. Действие препарата Стимул 2+ дополняет положительный эффект, который обусловлен еговысокой антибактериальной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и выраженными иммуномодулирующими свойствами.

1.2.3 Изучение эффективности применения биологических препаратов и функциональной кормовой добавки при выращивании поросят

Исследованиями установлено, что использование препаратов «Асидо-Био-Цит» жидкий» и Стимул 2+ оказало положительное влияние на рост и развитие поросят-отъемышей(таблица 8). К концу опыта сохранность поголовья в контрольной и подопытных группах, получавших биопрепараты, составила 100%.

Живая масса поросят контрольной группы к концу эксперимента составила 18,41 кг, у животных второй подопытной группы 19,81 кг и третьей подопытной группы — 20,20 кг. По сравнению с контролем использование препарата «Асидо-Био-Цит» жидкий»увеличило живую массу поросят на 7,6%(р<0,001), использование препарата «Асидо-Био-Цит» жидкий»в сочетании с препаратом Стимул 2+ на 9,7%(р<0,001). Среднесуточные приросты живой массы поросят также были больше контроля: во второй группе на 14,0%, ав третьей группе — на 15,9%,

Таблица 8 – Влияние препаратов «Асидо-Био-Цит» жидкий» и Стимул 2+ на рост подопытных поросят и конверсию корма

При этом затраты корма на 1 кг прироста живой массы у животных, получавших препараты уменьшились на 11,4% и 12,8%, что связано с повышением усвояемости комбикорма.

Физиологическое состояние экспериментальных животных оценивалось по общему внешнему виду, поведению и результатам морфологического и биохимического исследования крови.Было отмечено, что в течение опытного периода все подопытные поросята были клинически здоровы, имели хороший аппетит, хорошую реакцию на внешние раздражители, не было клинических признаков заболеваний. Кал у животныхподопытных групп имел нормальный внешний вид, цвет и консистенцию, не было выявлено клинических признаков нарушения пищеварения, что указывало на нормальное функционирование желудочно-кишечного тракта.

Следует отметить, что использование препарата «Асидо-Био-Цит» жидкий» способствует уменьшению выделения газов в помещении, где содержались поросята.

Анализ данных морфологических и биохимических показателей крови показал, что в конце опыта у поросят контрольной и опытных групп все биохимические показатели крови были в пределах физиологической нормы (таблица 9).

Нами установлено, что в крови поросят, получавших препараты, увеличилось содержание гемоглобина и эритроцитов. Так, в крови животных второй подопытной группы содержание этих показателей составило 98,8 г/л и 7,46*10¹²/л, третьей подопытной группы — 90,4 г/л и 7,22*10¹²/л, что больше контроля соответственно на 14,6% (р<0,01) и 8,7%, 4,8%(р<0,05)и5,2%.

Анализ крови на лейкоциты проводят для диагностики состояния организма, так как лейкоциты – это важная составляющая иммунной системы человека и животных. Повышение лейкоцитов свидетельствует о воспалительном процессе в организме. По нашим данным, в крови животных второй группы, получавших препарат «Асидо-Био-Цит» жидкий», количество лейкоцитов составило 8,16*10⁹/л, а у поросят третьей группы, получавших «Асидо-Био-Цит» жидкий» в комплексе с препаратом Стимул 2+, этот показатель составил 7,79*10⁹/л, что на 20,4% и 24,1% достоверно меньше контрольных показателей.

Аналогичная тенденция была установлена и по СОЭ. Как известно, скорость оседания эритроцитов можетпоказать на воспалениев организме. Нами установлено, что применение препаратов способствовало уменьшению СОЭ в крови поросят второй и третьей подопытных групп. Однако разница была недостоверной.

Таблица 9 – Морфологические показатели крови подопытных поросят(n=5)

Биохимический анализ крови – исследование, которое используется для выявления сведений о функциональном состоянии организма в целоми органов в отдельности. Комплексное исследование основных биохимических показателей крови, позволяет оценить особенности кроветворения, функцию печени, поджелудочной железы и почек, белковый, липидный и углеводный обмен, обмен нуклеиновых кислот, а также баланс железа и кальция в организме. Биохимические показатели крови подопытной птицы представлены в таблице 10.

Нами установлено, что в крови поросят второй и третьей групп, получавших препараты,довостоверно повысилось содержание глюкозына 1,63 ммоль/л и 1,03 ммоль/л (р<0,001)и уменьшилось содержание холестерина на 0,72 ммоль/л и 0,76 ммоль/л(р<0,05).

Глюкоза является показателем состояния обмена веществ у животных. Вероятно, более высокое содержание глюкозы в крови подопытных поросят свидетельствует о повышении эффективности использования углеводов комбикорма и получении большего количества обменной энергии, что способствует повышению интенсивности роста.

Таблица 10 — Биохимические показатели сыворотки крови поросят(n=5)

По анализу показателей, характеризующих гепатопротекторные свойства препарата «Асидо-Био-Цит» жидкий», можно сказать, что у поросят второй и третьей группы улучшились некоторые изученные биохимические показатели крови, в частности, содержание ферментов аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, общего билирубина.

Как известно, показатели АЛТ и АСТ являются своеобразными маркерами функционального состояния печени [2]. Аспартатаминотрансфераза (АСТ) – фермент, который находится во всех клетках организма, но главным образом в клетках сердца и печени и в меньшей степени в почках и мышцах. В норме активность АСТ в крови очень низкая. При повреждении тканей печени или мышц она высвобождается в кровь. Таким образом, АСТ является показателем повреждений печени.

Аланинаминотрансфераза (АЛТ, АлАт)– это эндогенный фермент из группы трансфераз, подгруппы аминотрансфераз (трансаминаз), широко используемый в практике для лабораторной диагностики повреждений печени. АЛТ синтезируется внутриклеточно, и в норме лишь небольшая часть этого фермента попадает в кровь. При повреждении печени (при гепатитах, циррозе печени) в результате цитолиза (разрушения клеток) этот фермент попадает в кровь. В нашем эксперименте по сравнению с контролем наблюдалась тенденция к уменьшению содержания ферментов в крови поросят второй и третьей группы: АЛТ на 0,54ед/л (9,31%) и 0,46 ед/л (7,93%), АСТ на 0,47 ед/л (8,30%) и 0,51 ед/л (9,01%), что вероятно, свидетельствует об улучшении функции печени.

Метаболизм билирубина – это сложный химический процесс, постоянно происходящий в организме, при его нарушении на каком-либо этапе и появляется изменение уровня этого вещества в сыворотке крови. Поэтому билирубин является важным показателем работы сразу нескольких систем организм, в первую очередь, функционирования печени и процесса распада гемоглобина. Повышение общего и прямого билирубина свидетельствует о клинических нарушениях функции печени. В нашем экспериментепо сравнению с контролем у поросят, получавших препараты, содержание билирубина уменьшилось (однако разница была недостоверной). Для подтверждения данного предположения необходимо определение фракций билирубина.

Экономическая эффективность применения функциональной кормовой добавки «Асидо-Био-Цит» жидкий» при выращивании поросят-отъемышей составила в расчете на 1 рубль дополнительных затрат 2,57 руб., «Асидо-Био-Цит» жидкий» и препарата Стимул 2+ — 1,50 руб.

Таким образом, результаты экспериментальных исследований показали, что применение препаратов «Асидо-Био-Цит» жидкий» и Стимул 2+ улучшает физиологическое состояние, положительно влияет на функциональную активности печени и иммунитет, повышает продуктивность поросят.

1.2.4 Изучение эффективности применения биологических препаратов и функциональной кормовой добавки при лечении и выращивании телят

Для изучения эффективности применения биологических препаратов при выращивании телят в качестве элементов биорегулирующей терапии было сформировано три группы. В третьей подопытной группе на начало эксперимента былотри теленка, больных эймериозом и вируcной диареей крупного рогатого скота.

В начале опыта телятам второй подопытной группы однократно была сделана инъекция антикокцидийного препарата Толтрекс в дозе 3 мл суспензии на 10 кг массы животного; телятам третьей подопытной группы однократно была сделана инъекция антикокцидийного препарата Толтрекс в дозе 3 мл суспензии на 10 кг массы животного и Тетравитферонв дозе 1,0 см³/10 кг(комбинированный препарат для профилактики и лечения гиповитаминозов и вирусных заболеваний).

Исследованиями установлено, что использование препарата«Асидо-Био-Цит» жидкий»в целях профилактики заболеваний и укрепления иммунитета эффективно, препарат оказывает положительное влияние на улучшение физиологического состояния, рост и развитие животных (таблица 11). По нашим данным, живая масса телят контрольной группы к концу эксперимента составила 45,86 кг, у животных второй подопытной группы — 53,8кг и третьей подопытной группы — 51,22 кг. Среднесуточные приросты живой массы телят в контрольной группе за период опыта составили 381,1 г, второй подопытной группы — 677,8 г, третьей подопытной группы – 573,9 г.

Физиологическое состояние подопытных телят оценивали по общему внешнему виду, поведению, выраженности рефлексов, а также результатам морфологического и биохимического исследования крови.

Таблица 11- Влияние препарата «Асидо-Био-Цит» жидкий» на рост подопытных телят

Нами установлено, что в третьей подопытной группе на начало эксперимента было три теленка, больных эймериозом и вируcной диареей крупного рогатого скота. Результаты эксперимента показали эффективности примененных методов профилактики и лечения телят. К концу опыта животные второй и третьей подопытных групп были клинически здоровы, имели хороший аппетит, хорошую реакцию на внешние раздражители, не было клинических признаков заболеваний. Кал у животныхподопытных групп имел нормальный внешний вид, цвет и консистенцию, что указывало на нормальное функционирование желудочно-кишечного тракта.

Анализ данных морфологических и биохимических показателей крови показал, что в конце опыта у телятвторой и третьей подопытных групп все изученных показатели крови были в пределах физиологической нормы (таблицы 12,13). Нами отмечено повышение в крови гемоглобина 6,8 г/л и 14,2 г/л, что на 6,88% и 14,3% больше, чем в крови поросят контрольной группы. Следовательно, применение препаратов позволило улучшить физиологическое состояние телят, активизировать процесс гемопоэза, что способствовало увеличению снабжения кислородом органов и тканей подопытных животных.

Таблица 12 – Морфологические показатели крови подопытных телят(n=5)

Таблица 13 — Биохимические показатели сыворотки крови телят (n=5)

В тоже время к концу эксперимента в контрольной группе у трех телят наблюдались клинические признаки вирусной диареи. В крови телят первой группы было отмечено выше физиологической нормы количества лейкоцитов, СОЭ, общего белка, ферментов АЛАТ и АСАТ, а также уменьшении содержания мочевины. Изменение этих показателей свидетельствует о воспалительном процессе и снижении уровня функциональной активности печени.

Экономическая эффективность выпаивания «Асидо-Био-Цит» жидкий» илечения с применением препаратов Толтрекс и Тетравитферонсоставила в расчете на 1 рубль дополнительных затрат во второй подопытной группе 0,18 руб., в третьей подопытной группе — 0,63 руб.

Таким образом, результаты экспериментальных исследований показали, что применение препарата в комплексной профилактике и терапии заболеваний телят молочного периода улучшает физиологическое состояние, положительно влияет на функциональную активность печени и иммунитет, повышает продуктивность телят.

1.2.5 Изучение эффективности применения пробиотических препаратовпри выращивании аквакультуры

При выращивании молоди стерляди использовали комбикорм SteCoSUPRIME (произ. Нидерланды).По нашим данным, комбикорм содержал 59,1% сырого протеина, 16,3% жира, 3,3% сырой клетчатки, 7,4% сырой золы, 1,21% фосфора. Кормление рыбы производили 4раза в сутки, норма кормления 10% от массы тела.Результаты выращивания молоди стерляди на продукционном комбикорме с добавлением пробиотиков «Субтилис» и Стимул 2+ представлены в таблице 14.

Таблица 14 -Результаты выращивания молоди стерляди на продукционном комбикорме SteCoSUPRIMEс добавлением пробиотиков «Субтилис» и Стимул 2+

Как видно из данных таблицы 14, включение в состав корма пробиотических препаратов способствовало повышению сохранности рыбы, среднесуточных приростов живой массы. В первой контрольной группе среднесуточный прирост рыбы составил 0,45 г, во второй подопытной группе — 0,48 г, в третьей подопытной группе 0,49 г. К концу эксперимента живая масса рыбы второй и третьей подопытных групп составила 36,4 г.

Потребление корма во всех группах было одинаковым, так как кормление проводили нормировано. Соответственно массе рыб уменьшились и затраты кормов на 1кг прироста, по сравнению с контролем, во второй группе на 3,3%, в третьей — на 5,8%.

Таким образом, применение пробиотических препаратов при кормлении молоди стерляди эффективно, так как повышаются среднесуточные приросты живой массы и снижаются затраты корма.

Следует отметить, необходимо проведение эксперимента более продолжительное время и на большем поголовье, чтобы было возможно оценить и проанализировать скорость роста и массонакопление у рыбы, а также необходимо изучение механизмов влияния пробиотических препаратов на организм и микробиом желудочно-кишечного тракта рыбы.

Заключение

В результате проведенных исследований впервые для органического сельского хозяйства предложена система биорегулирующей терапии с использованием симбиотических препаратов на основе пробиотических микроорганизмов B.subtilis и B.licheniformi, природных олигосахаридов и сорбентов и функциональной кормовой добавки«Асидо-Био-Цит»жидкий на основе растительных пептидно-белковых биорегуляторов.

Комплексные исследования позволили установить, что биопрепараты и функциональная кормовая добавка оказывают ростстимулирующее, иммуномодулирующее и гепатопротекторное влияние на организм молодняка индеек, поросят и телят, молоди стерляди, что улучшает функциональную активность органов и тканей, переваримость кормов и способствует увеличению энергии роста молодняка на 13,1-16,2%. Использование биопрепаратов и функциональной кормовой добавки в технологической схеме производства мяса на органических фермах и промышленных комплексах позволит повысить сохранность поголовья и конверсию корма11,4-13,0%, снизить применение химических средств защиты и улучшить качество получаемой продукции.

Таким образом, применение симбиотического препарата Стимул 2+ и функциональной кормовой добавки «Асидо-Био-Цит» жидкий позволит увеличить объемы производства молочной и мясной продукции, соответствующей по качеству требованиям органических продуктов класса «био-органик».

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Аварский, Н.Д. Рынок органической продукции России: современное состояние и потенциал развития / Н. Д. Аварский [и др.] // Экономика сельского хозяйства России.- 2014.- № 5. С. 29–37.
2. Андреева, С.Д. Клиническое и биохимическое исследование печени у животных / С.Д.Андреева, Ж.В. Вараксина.- Киров, 2000. 29 с.
3. Акимова, Ю.А. Перспективы развития органического сельского хозяйства в России / Ю.А. Акимова, Т.М. Полушкина // Современные проблемы науки и образования. — 2015. — № 2-1. (Элект. журнал).
4. Алямкин, Ю. Пробиотики вместо антибиотиков – это реально / Ю. Алямкин // Птицеводство. – 2005. – №2. – С. 17-18.
5. Андрусенко, С.Ф. Обогащенные безлактозные продукты из козьего молока / С.Ф. Андрусенко, П.А. Омельченко // Молочная промышленность.- 2008. — №11. – С.78-79.
6. Антипова, Л. Прослеживаемость безопасности птицепродуктов / Л. Антипова, С. Полянских, З. Ибрагимова // Птицеводство. – 2010. — № 3. – С.43-44.
7. Бевзюк, В. Н. Целловиридин вкомбикормахнестандартной рецептуры / В. Н. Бевзюк, Т. М.Околелова// Комбикорма. — 2003. — №5. – С. 46-47.
8. Берестенко, Е.Д.Факторы среды обитания и состояние здоровья населения / Е.Д. Берестенко, Ю.И. Григорьев // Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова. — 2011. — №4. — С.147-153.
9. Бессарабова, Е.В. Влияние кормовой добавки «Гидролактив» на рост и развитие бройлеров/ Е.В.Бессарабова, Л.П.Гонцова, Ю.В. Краснобаев// Птица и птицепродукты.- 2011.- №2.- С.46-48.
10. Билалова, В.А. Рост и развитие гусят при использовании ферментов / В.А. Билалова, Д.Д. Хазиев // Интеграция аграрной науки и производства: состояние, проблемы и пути решения: Матер. Всеросс. научно-практ. конф. Ч.III. – Уфа, 2008. – С. 322-323.
11. Бодров, Д. Влияние ферментных препаратов на мясную продуктивность бычков /Д. Бодров // Молочное и мясное скотоводство. — 1998. — №3. -С.9-11.
12. Борук, В.В. Эффективность применения комплексных препаратов аминокислот («абиопептид») и микроэлементов («ферропептид») на различных стадиях онтогенеза бройлеров: дис. …канд.биол.наук/ В.В.Борук, Москва — 2012.
13. Булгаков, А.М. Эффективность кормления ферментными препаратами за счет усвоения питательных веществ животными / А.М. Булгаков.- Барнаул, 2009.-175 с.
14. Бурдаева, К. Кормовые пробиотики / К. Будаева // Корма и кормовые добавки. – 2015. – №2. – С. 37-41.
15. Влияние ферментных препаратов на физиолого-продуктивный потенциал цыплят- бройлеров на фоне замены зерновой части пшеницы на тритикале /А.Ю. Никитин [и др.] // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2017. – №8 (208). – С. 65-69.
16. Волкова, И. Пробиотики как альтернатива кормовым антибиотикам / И. Волкова // Комбикорма. – 2014. – №2. – С. 63-64.
17. Волчкова, Л. Применение адаптогенов для бройлеров/ Л. Волчкова, Н.Калюжный, М.Тотоева// Животноводство России.-2006. — №3.- С.23-24.
18. Волынкина, М.Г. Ферментные препараты в кормлении коров в период раздоя / М.Г. Волынкина, В.А. Хлыстунова // Аграрный вестник Урала.- 2009.- №19- С.88-89.
19. Гайнуллина, М.К. Влияние скармливания премикса на продуктивность, состав и свойства молока коров черно-пестрой породы / М.К. Гайнуллина, А.Р. Фахрутдинова // Мат. междунар. науч.-прак. конф. «Инновационные пути импортозамещения в АПК», Донской ГАУ, апрель 2015, пос . Персиановский, 2015.С.12-17.
20. ГОСТ 25179-90 Молоко. Методы определения белка. Межгосударственный стандарт. – М.: Стандартинформ, 2006. — 6 с.
21. ГОСТ 5867-90 Молоко и молочные продукты. Методы определения жира. Межгосударственный стандарт. – М.: Стандартинформ, 2006. -15 с.
22. ГОСТ 3626-73 Молоко и молочные продукты. Методы определения влаги и сухого вещества. Межгосударственный стандарт. – М.: ИПК Издательство стандартов, 2006. -14 с.
23. Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы ФГБНУ «Росинфомагротех». М., 2012. — 204 с.
24. Гущин, В.В. Безопасность продуктов питания – одна из основных проблем птицепромышленности / В.В. Гущин, Г.Е. Русанова, Н.И. Риза-Заде // Птица и птицепродукты. – 2012. — №1. – С. 53-56.
25. Данилевская, Н.В. Фармакологические аспекты применения пробиотиков / Н.В. Данилевская //Ветеринария. – 2005. — № 11.
26. Данилова, Н. Эффективность ферментного препарата «Гимизим» / Н. Данилова // Птицеводство. – 2005. — №3. – С. 25.
27. Данилов, И. ПробиотикСубтилис в промышленном птицеводстве / И. Данилов, О. Сорокин, М. Сафонов // Птицеводство. – 2010. – №5. – С. 23.
28. Дзагуров, Б. Подкормка для цыплят / Б. Дзагуров, И. Джелиева, З. Псхациева // Животноводство России. – 2009. — № 10. – С.23-24.
29. Добрук, Е.А. Влияние добавки «МиксОптима К» на продуктивность крупного рогатого скота : дис…. канд. с.-х. н./ Е.А.Добрук, 2013.- 136 с.
30. Егоров, И. Ферменты для рационов с повышенным вводом ячменя /И. Егоров // Комбикорма.- 2004.- №8.- С.73.
31. Ежова, О. Ферментный препарат в ячменном рационе уток / О.Ежова, А. Сенько, А. Лукьянов // Птицеводство. – 2004. — №12. – С. 14-15.
32. Елисеева, Л.Г. Международная интеграция в области обеспечения безопасности и повышения конкурентоспособности продукции агропромышленного производства /Л.Г. Елисеева // Техника и технология пищевых производств.- 2011.- №3.- С. 46-51.
33. Ефрюшин, А.Д. Влияние ферментного препарата Мацеробациллин ГЗХ в сочетании с витаминно-минеральным премиксом на переваримость питательных веществ дойными коровами / А.Д. Ефрюшин, А.М. Булгаков // Кормление сельскохозяйственных животных и кормопроизводство.- 2014.- №12.-С.53-58.
34. Зорикова, А.А. Специальные ферментные добавки в стартерных комбикормах для поросят /А.А. Зорикова / Материалы международного симпозиума, С.-Пб., 2005. —С. 132-134.
35. Зоотехнический анализ кормов / Е.А. Петухова [и др.]. – М.: Колос, 1981. – 256 с.
36. Илиеш, В.Д. Пробиотики в животноводстве — путь к качеству и безопасности продуктов питания / В.Д. Илиеш, М.М. Горячева // Свиноводство.- 2017.- №6.
37. Использование симбиотического препарата в кормлении цыплят-бройлеров / И.В. Павленко [и др.] // Птица и птицепродукты. – 2013.- № 1.- С. 45-46.
38. Изучение эффективности использования подкислителя кормового «АсидоБио-ЦИТ» жидкий» в рационах поросят группы доращивания / В.В Богомолов [и др.] /Генетика и разведение животных .- 2016.-№3.- С.64-68.
39. Кислухина, О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов / О.В. Кислухина//М.: Делипринт, 2002. — 336 с.
40. Кислюк, С. Оптимальный набор кормовых добавок в условиях повышения цен на сырье / С. Кислюк // Птицеводство. – 2008. — № 7. – С. 21-22.
41. Комаров, А. Стандартизация методов определения активности ферментных препаратов / А. Комаров, Л. Телишевская, А. Панин // Комбикорма. – 2007. — № 3. – С. 64-65.
42. Кормление сельскохозяйственной птицы / В.И. Фисинин [и др.]. – Сергиев Посад.: Загорская типография, 2001. – 281 с.
43. Кормозим ферментный препарат нового поколения в рационах животных / В.Г. Гугля [и др.] // Сельские новости. -2004. -№12.-С. 46-49.
44. Корнилова, В. Влияние ферментного препарата на продуктивность индюшат/ В. Корнилова, М. Маслов// Комбикорма. – 2008. — № 3. – С. 79.
45. Костомахин, Н.М. Использование ферментных препаратов в кормлении сельскохозяйственных животных и птицы /Н.М. Костомахин // Главный зоотехник.- 2006.- № 8. — С. 20-22.
46. Кочиш, И.И. Влияние кормовой добавки «Баксин-КД» на естественную резистентность и продуктивность бройлеров/ И.И.Кочиш, М.С.Найденский, В.В.Нестеров [и др.]// Птица и птицепродукты.- 2011.- №5. — С.20-22.
47. Кузнецов, А. Универсальный фермент в рационах с люпином / А. Кузнецов, П. Кундышев, Е. Краевская // Комбикорма. 2012. — №3. – С. 75-76.
48. Корниенко, С.И. Влияние ферментных препаратов на продуктивность / С.И. Корниенко // Научный журнал КубГАУ.- 2013.- №87(03).- С. 1–28.
49. Кузнецова, В.Ф. Использование пробиотиков, пребиотиков и симбиотиков в птицеводстве / В.Ф. Кузнецова // Сергиев Посад, 2007. — С. 27.
50. Кундиус, В. И. Организационно-экономические предпосылки развития органического сельского хозяйства в условиях вступления России в ВТО / В. И. Кундиус, О Ю. Воронкова // Вестн. алтайского гос. аграр. ун-та. — 2014. — № 6. — С. 140–144.
51. Кощаев, А.Г. Экологизация продукции птицеводствапутем использования пробиотиков как альтернатива антибиотикам / А.Г. Кощаев // Юг России: экология, развитие.- 2007.- №3.- С.94-98.
52. Ленкова,Т.Н. Мультиэнзимы в комбикормах для бройлеров / Т.Н. Ленкова // Птицеводство. – 2007. — № 2. – С.15-16.
53. Ленкова, Т.Н. Новый отечественный энзим / Т.Н. Ленкова, Т.А. Егорова, И.Г. Сысоева // Птицеводство. — 2016. — №6. – С. 17-20.
54. Лысенко, С. Пробиотики для цыплят-бройлеров / С. Лысенко, А. Бараников, А. Васильев // Птицеводство. – 2007. – №5. – С. 31 – 32.
55. Лыско, С. Влияние пробиотиков на иммунную систему цыплят-бройлеров /С. Лыско // Птицеводство. – 2008. – №7. – С. 15 – 16.
56. Макаров, С.В. Влияние биологически активной добавки «Баксин-КД» на резистентность, продуктивность бройлеров и репродуктивную способность кур: дисс. … канд.биол.наук/ С.В.Макаров,Москва, 2012.- 122с.
57. Марков, Ю. О роли ферментов в свиноводстве / Ю. Марков // Свиноводство.- 2000.- №4.- С. 13–16.
58. Мастерских, Д.Г. Свойства молока коз зааненской породы разного возраста / Д.Г. Мастерских, А.С. Шувариков // Овцы, козы, шерстяное дело.- 2004.- №3.- С. 39-40.
59. Молоскин, С. Универсальный фермент для зерновых рационов/ С. Молоскин // Комбикорма.- 2003. — №1. — С. 56-57.
60. Мысик, А.Т. Справочник по качеству продуктов животноводства / А.Т. Мысик, С.М. Белова – М.: Агропромиздат, 1986. – 239 с.
61. Надаринская, М.А.Выпаивание добавки «АсидоБио-ЦИТ» жидкий телятам о рождения / М.А. Надаринская, О.Г. Голушко// Мат. национальной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Заслуженного работника высшей школы РФ, Почетного профессора Брянской ГСХА, доктора ветеринарных наук, профессора А. А. Ткачева «Актуальные проблемы ветеринарии и интенсивного животноводства, Брянск, 20–21 сентября 2018 года. Кокино: Брянский государственный аграрный университет, 2018. — С. 11-114.

62. Национальный доклад «О ходе и результатах реализации в 2013 году Государственной программы развития сельского хозяйства и  регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013–2020 годы». М., 2014 [Электронный ресурс].

63. Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 56508-2015. Продукция органического производства. Правила производства, хранения и транспортировки. М.: Стандартинформ, 2015 [Электронный ресурс].

64. Новые экологически безопасные препараты для бройлерного производства / И.В. Павленко [и др.] // Птица и птицепродукты. – 2015.- № 1.- С. 55-57.

1. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных / А.П. Калашников [и др.] – М.: КолосС, 2003. – 456 с.
2. Нуржанов, Б.С. Использование симбиотиков в животноводстве / Б.С. Нуржанов, Ю.И. Левахин, И.М. Агеев // Вестник мясного скотоводства.- 2013.- № 4.- С. 107-110.
3. Нуртдинов, М.Г. Ферментные препараты в животноводстве / М.Г. Нуртдинов. – Казань: Фэн, 2002 – 96 с.
4. Нуртдинов, М.Г. Ресурсосберегающая технология производства свинины с использованием ржи и полиферментного препарата «Универсал» : дис…. д-ра. с.-х. н.: 06.02.02/ М.Г. Нуртдинов. — Казань, 2006.- 192 с.
5. Овсянников, А.И. Основы опытного дела / А.И.Овсянников. М.: Колос. – 1976. — 302 с.
6. Околелова, Т.М. Включение комплексных ферментных препаратов в комбикорма с повышенным содержанием трудногидролизуемых компонентов / Т.М. Околелова, Э.В. Удалова // Сергиев Посад, 1996.-7 с.
7. Олькова, А.С. Влияние новых пептидных биорегуляторов на активностьDaphniamagna в чистых и загрязненных тяжелыми металлами водах [электронный ресурс] / А.С.Олькова, М.С.Краснов, В.П.Ямскова и дор.// Современные проблемы науки и образования.- 2015. — №5. URL^http^//www/science-education.ru/ru/article/view?id=21927.
8. Османов, Р.О. Современное состояние и перспективы оценки влияния факторов окружающей среды на состояние здоровья детского населения страны / Р.О. Османов, З.Г. Мусаева, С.О. Курбиева // Медицинская экология. Юг России: экология, развитие. — 2008. -№2. — С.119-122.
9. Околелова, Т. Определение эффективности добавок в комбикормах для птицы / Т. Околелова, О. Просвирякова // Птицеводство.- 2008. — № 9. – С. 26-27.
10. Околелова, Т. Актуальные вопросы в кормлении птицы/ Т. Околелова// Животноводство России. – 2009. — № 5. – С.21-22.
11. Панин, А.Н. Иммунобиология и кишечная микрофлора / А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик // Аграрная наука, ИК «Родник». — 1998.- 48 с.
12. Панин, А.Н. Пробиотики в промышленном птицеводстве/ А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик // Материалы 1 Международного конгресса по птицеводству. — 2005.
13. Папцов, А. Г. Органическое сельское хозяйство ЕС: тенденции развития и опыт регулирования / А. Г. Папцов, Л.Г. Ахметшина // Агропродовольственная политика России. — 2014. — № 8 (20). — С. 80–84.
14. Перспективы органического сельского хозяйства в России. Генное редактирование на службе у человека (подг. по итогам Научно-методического семинара Аналитического управления Аппарата Совета Федерации Федерального Собрания РФ,10 ноября 2016 г.) // Аналитический вестник. — 2016. — № 49 (648). — 77 с.
15. Подчалимов, М.И. Эффективность использования разных пробиотиков и пребиотиков в кормлении цыплят-бройлеров / М.И. Подчалимов, Е.М. Грибанова // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии.- 2013.- № 4.- С. 53-55.
16. Пономарев, С.В. Биологические и технологические аспекты применения методов органического сельского хозяйства для получения продукции аквакультуры / Пономарев С.В. [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2015. -Т.17, №4(3). -С. 557-564.
17. Потгютер, Р. Пути оптимизации кормления птицы/ Р. Потгютер// Животноводство России. – 2011. –№ 2. –С. 19-21.
18. Применение ферментативного пробиотика в кормлении цыплят-бройлеров / В.А. Манукян [и др.] // Птица и птицепродукты. – 2013. – №5. – С. 22 – 24.
19. Протасова, Д.Г. Свойства козьего молока / Д.Г. Протасова // Молочная промышленность. -2001. -№8. -С.25-26.
20. Птицеводство и технология производства яиц и мяса птиц / Б.Ф. Бессарабов [и др.].- СПб.: Лань, 2005. – 352 с.
21. Рынок органической продукции России: современное состояние и потенциал развития / Н. Д. Аварский [и др.] // Экономика сельского хозяйства России.- 2014.- № 5.- С. 29–37.
22. Сапай, А.Н. Влияние бульона белкового концентрированного сухого кормового на рост, развитие и мясную продуктивность молодняка крупного рогатого красной степной породы скота: автореф. дис. …канд.с-х.наук/ А.Н,Сапай, Барнаул, 2009.
23. Субботин, В.В. Биотехнология пробиотиков ветеринарного назначения/ В.В. Субботин // Аграрная наука. – 1998.- № 3.
24. Субботин, В.В. Опыт применения пробиотикалактобифадол в различных отраслях животноводства и в птицеводстве/ В.В. Субботин, Н.В. Данилевская // Эффективное животноводство. – 2009.- № 4 (62).- С. 40-41.
25. Тедтова, В. Пробиотический препарат для бройлеров / В. Тедтова // Птицеводство. – 2007. — №10. — С. 28.
26. Ферментная активность как реальный показательпитательностирационов животных/ Р.У. Бикташев [и др.]//Кормопроизводство.- 2005. — №7.- С. 19-20.
27. Ферментные препараты для улучшения усвояемости корма и снижения его стоимости / И. Егоров [и др.] // Комбикорма. – 2010. — №7. – С. 73-76.
28. Фисинин, В.И. Современные подходы к кормлению птицы / В.И. Фисинин, И.А. Егоров // Птицеводство. – 2011. — № 3. – С. 7-10.
29. Фисинин, В.И. Стратегия инновационного развития птицеводства России/ В.И. Фисинин // Комбикорма. -2012. -№ 4. –С. 3-6.
30. Хорошевская, Л. Эндогенный фермент в рационах цыплят-бройлеров/ Л. Хорошевская, А. Хорошевский, О. Ларичев, К. Масловский // Комбикорма. -2009. -№ 1. –С. 73-74.
31. Швыдков, А. Обоснование применения пробиотиков в бройлерном птицеводстве / А. Швыдков [и др.] // Птицеводство. – 2012. – №12. – С. 44-48.
32. Шульце, Э. Традиционное и органическое сельское хозяйство: анализ сравнительной эффективности с позиции концепции устойчивого развития / Э. Шульце [и др.] // Вестник С.-Пб. университета. — 2015. -Сер.5. Вып.4. -С. 4-39.
33. Шванская, И.А. Проблемы и перспективы развития органического сельского хозяйства в России / И.А.Шванская//http://nf-innovate.com
34. Шульга, Е.А. Эффективность применения пробиотика «Субтилис» в составе полнорационных комбикормов для осетровых рыб / Е.А. Шульга, Ю.А. Лапухин / Материалы первой ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН.- Ростов на Дону, 2005.- С.340-341.
35. Эффективность нового симбиотического комплекса для птиц Авилакт форте/ Л.А. Неминущая[и др.] // Птицеводство. — 2010. — №1. – С. 45-
36. Biernasiak, J. The effect of a new probiotic preparation on the performance and faecal microflora of broiler chickens / J. Biernasiak, K. Slizewska // VeterinarniMedicina. – 2009. — № 11. — Р. 525-531.
37. Korosi, L. Effects of natural products for broiler production parameters. / L. Korosi // 11th Europen Poultry Conference. Abstracts. — Bremen, 2002. -P. 106.
38. Luo, J. Effect of probiotic Propionibacterium jensenii 702 supplementation on layer chicken performance / J. Luo, S.King, M.C.Adams // Benef. Microbes. — 2010. — V.1. — N 1. — P. 53 — 60.
39. Vargas-Rodriguez, L.M. Effect of Probiotic and Population Density on the Growth Performance and Carcass Characteristics in Broiler Chickens / L.M. Vargas-Rodriguez, L.A. Duran–Melendez [е.а.] // International Journal of Poultry Science. – 2013. — №7. — Р. 390-395.

Реферат

Отчет содержит: 3 раздела,56 страницы, 5 таблиц, 8 рисунков, 61 литературных источников.

В настоящее время вопрос восстановления почвенного плодородия в нашей стране стоит особенно остро. За последние 20-25 лет отмечено снижение содержания гумуса по стране на 0,4 % на площади, превышающей 20 млн. га. Для обеспечения бездефицитного баланса гумуса в пахотных почвах России требуется ежегодно 1,5 млрд. тонн органических удобрений в пересчете на подстилочный навоз. Основными видами органических удобрений являются навоз, помет и различные компосты на их основе. Несмотря на высокую питательную ценность навоза и помета объемы использования органических удобрений остаются низкими(менее 1т/га или 10 % от потребности) и не обеспечивают даже простое воспроизводство плодородия пашни. Внесение навоза и помета опасно в связи с наличием возбудителей инфекционных и инвазионных заболеваний человека и животных,нативный навоз содержат семена сорняков, отличаются высоким содержанием аммиака, сероводорода, фенола, меркаптана, солей тяжёлых металлов и других опасных веществ[1].

Цель работы: разработка биотехнологических способов обезвреживания и переработки навоза и помета, а также очистки и детоксикации сточных вод животноводческих ферм и птицеводческих хозяйств.с получением практически ценных продуктов, обеспечивающих повышение урожайности полевых и кормовых культур, их фунгицидную и бактерицидную защиту.

Результаты исследования имеют практическую значимость позволяют повысить эффективность использования органических удобрений, сократить дефицит гумуса и в конечном итоги повысить урожайность возделываемых культур .

Ключевые слова: животноводческие стоки, навоз, биотехнологическая подготовка, аборигенные микроорганизмы, консорциум.

Введение

В настоящее время вопрос восстановления почвенного плодородия в нашей стране стоит особенно остро. По данным Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, за последние 5 лет вынесено из почвсельскохозяйственных культур в 2,5 раза больше питательных веществ, чем было внесено. За последние 20-25 лет отмечено снижение содержания гумуса по стране на 0,4 % на площади, превышающей 20 млн. га. В большинстве пахотных почв России сложился отрицательный баланс гумуса. Ежегодные потери гумуса в РФ достигают 0,62 т/га, или 81,4 млн т. Наибольшие потери гумуса наблюдаются в республиках, краях и областях, расположенных в степной зоне. Пашня, расположенная в степной зоне, ежегодно теряет 0,8–1,0 т/ га гумуса [2]. Установлено, что снижение содержания в почве гумуса только на один процент приводит к снижению урожайности сельскохозяйственных культур на 0,5 ц/га зерновых единиц. Следовательно, ежегодный недобор урожая может составлять не менее 40 млн. тонн зерновых единиц. По расчетам Почвенного института им. В.В. Докучаева, ВИУА, ЦИНАО, ВНИПТИОУ, ВНИИЗиЗПЭ для обеспечения бездефицитного баланса гумуса в пахотных почвах России требуется ежегодно 1,5 млрд. тонн органических удобрений в пересчете на подстилочный навоз.

По данным ФГНУ «Росинформагротех» общее количество отходов в АПК достигает 1500 млн.т., из них сельскохозяйственных отходов — 630-650 млн т. отходы лесо- и деревообработки — 700 млн т., отходы пищевых и пищеперерабатывающих — в среднем 30 млн т в год [3]. Основными видами органических удобрений используемых в сельскохозяйственном производстве являются навоз, помет и различные компосты на их основе. Выход в России навоза и помета во всех категориях хозяйств в пересчете на подстилочный навоз в настоящее время составляет 294 млн. т., или 211 млн. т в пересчете на подстилочный навоз. Навоз содержит большое количество биогенных веществ, которые определяют его как ценное органическое удобрение. Так навоз крупного рогатого скота содержит от 4 до 23% сухого вещества, из них азота – от 2,4 – 6,5 кг/т, фосфора от 0,4 до 1,8 кг/т, калия – от 2,0 до 5,8 кг/т, магния от 0,2 до 0,6 кг/т навоза; свиной навоз от 5 до 25% сухого вещества, в том числе азота – от 6 до 6,8 кг/т, фосфора – от 0,6 до 2,1 кг/т, калия – от 1,7 до 3,6 кг/т, магния – от 0,3 до 0,7 кг/т; птичий помет содержит от 23 до 68% сухого вещества, в том числе азота — от 9,6 до 23 кг/т помета, фосфора — от 2,4 до 12 кг/т, калия – от 3,8 до 11,6 кг/т, магния – от 1,2 до 2,2 кг/т.. Несмотря на высокую питательную ценность навоза и помета объемы использования органических удобрений остаются низкими и не обеспечивают даже простое воспроизводство плодородия пашни. Ежегодное внесение органических удобрений за последние годы составляет менее 1т/га или 10 % от потребности [4]. Внесение навоза и помета в свежем виде в почву без предварительной обработки опасно связи с наличием возбудителей свыше 100 видов инфекционных и инвазионных заболеваний человека и животных (ящур, бруцеллёз, сибирская язва, лептоспироз и др.), яиц гельминтов, плесеней, медикаментозных препаратов [5]. Навоз и помет имеют, как правило, высокую влажность, неприятный запах, содержат семена сорных растений, отличаются высоким содержанием аммиака, сероводорода, фенола, меркаптана, солей тяжёлых металлов и других опасных веществ [6]. Таким образом, являясь ценным органическим удобрением, использование навоза без предварительной подготовки представляет серьезную экологическую опасность для окружающей среды, животных и людей. Ввиду несовершенства технологий, особенно при бесподстилочном способе содержания животных, часть навоза и помета разбавляется водой в 12-14 раз, что значительно осложняет и обработку и транспортировку этих отходов.Дополнительных емкостей, хранилищ, очистных сооружений для сбора и переработки жидких стоков. В результате навоз и помет на фермах накапливается, занимает большие площади, загрязняя грунтовые воды и атмосферу. Неиспользованный навоз и помет сбрасывают в овраги, спускают в водоемы, захоранивают [7]. Перспективными направлениями по утилизации и обезвреживанию отходов животноводства и птицеводства являются развитие российских биотехнологий аэробного и анаэробного биотермического компостирования, при использовании которых отходы органического происхождения обезвреживаются и превращаются в ценное органическое удобрение (биогумус, компост), а также получение биогаза, твердого топлива и производство строительных изделий [8].

Целью работы явилось разработка биотехнологических способов обезвреживания и переработки навоза и помета, а также очистки и детоксикации сточных вод животноводческих ферм и птицеводческих хозяйств с получением практически ценных продуктов, обеспечивающих повышение урожайности полевых и кормовых культур, их фунгицидную и бактерицидную защиту.

Задачами исследований явилось:

1. Выделить наиболее активные деструкторы высокомолекулярных органических соединений из числа аборигенной микрофлоры навоза и помета, провести их идентификацию;
2. Подобрать условия для роста и развития штаммов –деструкторов в условиях непрерывного потока и разработать двух стадийную технологию очистки стоков животноводческих ферм с получением практически ценных продуктов.
3. Подбор микроорганизмов из числа аборигенной микрофлоры или интродуцированных штаммов для ускорения утилизации, переработки и обезвреживания навоза и помета и получению органический продуктов, обладающих свойством удобрения.

I Обзор литературы

1.1 Современное состояние использования органических удобрений.

Согласно данным FAOSTAT, объем внесенных удобрений на основе животного сырья в мире вырос с 26,7 млн. тонн в 2013 году до 27,6 млн. тонн в 2016 году. Согласно данных Росстата, в России в 2018 году сельскохозяйственными организациями было внесено 68,8 тыс. тонн органических удобрений, что на 23,5 % по сравнению с 2013 годом. Из общего объема используемых органических удобрений наибольшая доля приходится на зерновые и зернобобовые культуры (без кукурузы) — 45-50 %. и кормовые культуры — около 30 % от всего объема органических удобрений. Под подсолнечник вносилось чуть более 4-6 % , сахарную свёклу 3 %, картофель около 1-1,5 %, под овощи и бахчевые культуры – менее 0,5 % (рисунок 1).

В 2017 году наибольшая доля внесения органических удобрений приходится на Центральный федеральный округ – 37 % от всего объема органических удобрений в России. На втором месте Приволжский федеральный округ – 24 %. На третьем месте находится Северо-Кавказский федеральный округ – 13 % (рисунок 2).

В Центральном ФО, лидере по внесению органических удобрений, за период 2013-2017 гг. наблюдается наращивание объемов внесения сельскохозяйственными организациями органических удобрений. В 2014 году показатель составил 23 235 тыс. тонн, что на 18,3 % больше, чем в 2013 году (19 647 тыс. тонн). В 2015 году этот показатель остался практически на уровне 2014 года (+0,03 %, 23 242 тыс. тонн). В 2016 году в Центральном федеральном округе объем внесения органических удобрений замедлился на 0,5 % (23 117 тыс. тонн).

На следующий год произошло увеличение объемов внесения на 7,2 % (24 773 тыс. тонн). Следует отметить, что в 2016 году только Приволжский федеральный округ, Уральский федеральный округ и Дальневосточный федеральный округ сократили объемы внесения органических удобрений в 2017 году на 2%, 2 % и 0,7 % соответственно).

Рисунок 1 Внесено сельскохозяйственными организациями органических удобрений по видам сельскохозяйственных культур в 2013-2017 гг., тыс. т

В остальных округах показатель незначительно увеличился: Северо-Западный (+0,7 %), Южный ФО (+0,4 %), Северо-Кавказский ФО (+0,3 %), Сибирский ФО (+0,3 %) (рисунок 2).

В 2017 году наибольшая доля вносимых удобрений пришлась на Белгородскую область – 13,6 %, опередившую Ставропольский край, который по результатам спустился на вторую строчку – 12,8 %. На третьем месте находится Воронежская область – 7,7 % (рисунок 2).

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что несмотря на увеличение объемов использования органических удобрений, значительное количество отходов животноводства и птицеводства остается невостребованным и требует соответствующей подготовки к применению в качестве удобрения.

Рисунок 2 Внесено сельскохозяйственными организациями органических удобрений в регионах РФ, тыс. т

1.2 Проблемы и пути утилизации и переработки твердых и жидких отходов животноводства и птицеводства

На крупных фермах Российской Федерации ежегодно образуется 200-250 млн.т навоза и 20-25 млн.т помета, жидких стоков в совокупности достигают 700-800 млн. т приводит к накоплению больших запасов навоза и помета.

В соответствии с Федеральным классификационным каталогом отходов навоз классифицируется следующим образом: навоз КРС перепревший (хранение не менее шести месяцев) – V класс опасности; навоз КРС свежий – IV класс опасности; навоз от свиней свежий – III класс опасности; навоз от свиней перепревший (хранение не менее одного года) – IV класс опасности. Птичий помет рассматривается как токсичные отходы производства III класса опасности [9]. Основными направлениями утилизации твердых и жидких отходов животноводства и птицеводства является использование в качестве органического удобрения. Ранее, когда концентрация скота и птицы на единицу земельных угодий была очень низкой, навоз и помет накапливали около фермы или вывозили на поля, где он постепенно превращался в перегной [10].В почве навоз и помет разлагаются медленно. Избыточное количество навоза и помета нарушает структуру почвенного сообщества и подавляет активность почвенной микрофлоры, поэтому для безущербной утилизации навоза необходимы большие земельные площади. Транспортировка на дальние расстояния, как правило, экономически не оправдана, требует значительного количества техники, затрат труда и денежных средств и не окупается прибавками к урожаю. что ограничивает его применение [11].

Остановимся поподробнее на некоторых методах получения удобрений из навоза и помета:

1.3 Сушка и гранулирование помета

Эффективным способом сохранения питательных веществ помета является его термическая обработка. Сушка помета при температуре 600-800° уничтожает возбудителей болезней и семена сорняков [12], [13]. Снижение влажности с 75-80 % до 20-25 % уменьшает массу конечного продукта в 3-4 раза. Высушенный помет представляет собой высококонцентрированное органическое удобрение, лишенное зловонного запаха, с благоприятными физическими свойствами. Высокотемпературная сушка также имеет недостатки: термически высушенный навоз и птичий помет может содержать канцерогенные вещества, при сушке наблюдаются значительные потери питательных веществ, высоки затраты на энергоносители. Учитывая, что рыночная цена продуктов из переработанных продуктов низкая, использование сушки – чаще всего нерентабельный метод. Российские ученые института машиноведения РАН создали технологию получения органического удобрения из птичьего помета Гуано путем низкотемпературного обезвоживания помета в вакууме. Однако, при низкотемпературной сушке получают обезвоженный, но не полностью обеззараженный продукт. В нем сохраняются некоторые патогенные микроорганизмы и семена сорных растений [14].Такой продукт нежелательно использовать на полях в качестве удобрения. Кроме того, установки для низкотемпературной сушки сложны в изготовлении, дороги для приобретения, и неэкономичны в эксплуатации. В нашей стране и за рубежом для сушки навоза и помета в основном используются вращающиеся барабанные сушилки. Технологические схемы и. компоновка оборудования этих сушилок отличаются типами топок, барабанов, конструкциями пылеулавливающих устройств. Барабанные сушилки экономичны по расходу тепла и энергии, а также имеют сравнительно большую производительность [15].

1.4 Сушка навоза и помета энергией сверх высокой частоты (СВЧ)

Монолаков В.А. в соавторстве (1995), предложил способ производства сухого птичьего помета воздействием на птичий помет (сырой) электромагнитным излучением на сверх высокой частоте (СВЧ) с одновременной обдувкой горячим воздухом в ограниченном пространстве (рисунок 3). Особенность нагрева СВЧ — близость или совпадение резонансной частоты электромагнитного поля, возбужденного в камерах СВЧ — установках. Вследствие чего происходит быстрое нагревание материала по всему объему, и сильнее нагреваются те участки, где влажность сырья выше. Более сухие места нагреваются медленнее, происходит своеобразное регулирование нагрева. Процесс сушки идет при сравнительно низких температурах порядка 80-120°С, благодаря чему в помете полностью сохраняются все питательные вещества, включая аминокислоты. Кроме того, при указанном виде сушки достигается стерилизующий эффект готовой продукции, что обусловлено, как термическим действием энергии СВЧ, так и нарушением электромагнитного равновесия микробной клетки, находящейся в высушиваемом материале [16]. Установка сушки на СВЧ содержит: СВЧ — камеру, источники излучения, конвейер, герметичные загрузочные и накопительные бункеры, системы подачи горячего воздуха и сырья. Использование герметичных, загрузочных и накопительных бункеров, исключает паразитное СВЧ — излучение в окружающую среду. Однако, стоимость СВЧ -генераторов сравнительно высока. Поэтому способ пока не получил широкого применения.

Рисунок 3 Способ производства сухого органического удобрения в СВЧ камере: 1 — излучатель СВЧ — энергии; 2 -СВЧ камера; 3 — конвейер; 4 -трубки для подачи и откачки воздуха; 5 — загрузочный бункер; 6 — накопительный бункер; 7 — люк для загрузки сырья и выемки продукта; 8 — заслонка; 9 -виброполка; 10-вибратор.

Компанией «ЛЕСИНТЕХ», которая была создана в 2006 г. разработана технология и оборудование, позволяющие без перенастройки получать из навоза и помета на одном оборудовании продукт, который может быть использован как топливо, почвообразующее удобрение и добавка к корму крупного рогатого скота и рыб. Технология компании «ЛЕСИНТЕХ» сводится к следующему: Условно технологический цикл разделяется на 3 участка.

1. Приём, складирование, подготовка и подача сырья.

2. Участок сушки – сушка и обеззараживания сырья, и очистка выбросов.

3. Участок гранулирования – получение готовых гранул, фасовка, упаковка.

Высокотемпературная сушка также имеет недостатки: термически высушенный навоз и птичий помет может содержать канцерогенные вещества, при сушке наблюдаются значительные потери питательных веществ, высоки затраты на энергоносители. Учитывая, что рыночная цена продуктов из переработанных продуктов низкая, использование сушки – чаще всего нерентабельный метод [17].

1.5 Производство микроэлементсодержащего органического удобрения

Существуют и другие способы переработки навоза и птичьего помета. Удобрения производят с любым набором макро- и микроэлементов, их можно использовать под любые сельскохозяйственные культуры и на любых почвах, при этом прирост урожайности составляет 20-25 %[18]. Исследованиями ученых Всероссийского научно-исследовательского и проектно-технологического института химизации сельского хозяйства доказана перспективность производства органических удобрений на основе навоза и птичьего помета, древесных опилок, торфа, лигнина и других местных органических компонентов. Использование полученных удобрений (50 т/га) в районах Севера позволяет увеличить урожайность картофеля с 7,2 до 17,1 т/га (или в 2,4 раза), рапса — с 12,5 до 18,4 т/га, или на 47,2 % [19]. Например, потери азота при длительном хранении птичьего помета можно предотвратить, если химически связывать выделяемый аммиак при помощи порошковидного суперфосфата, фосфоритной муки и фосфогипса. Так, на Томилинском птицеводческом производственном объединении Люберецкого района Московской области отработали технологии приготовления компостов с различным соотношением торфа, помета и фосфогипса. Оптимальной оказалась технология, предусматривающая соотношение торфа к помету 1:2с добавлением 10 % фосфогипса. Эта технология позволяет сэ­кономить торф и улучшить физические свойства компоста. Благоприятное действие фосфогипса объясняется тем, что сера, входящая в его состав, связывает выделяющийся аммиачный азот в сульфат аммония [20].

1.6 Биоконверсия отходов животноводства и птицеводства

Экологически и экономически более эффективно использование биотехнологических методов.

Отдельное место среди технологических схем переработки и утилизации навоза занимают биореакторы (биостанции), или биогазовые установки. Они представляют собой комплекс по переработке навоза, помета и навозной жижи, вырабатывающий электричество, тепло и высококачественные органические удобрения. После очищения биогаза получается биометан, который может быть использован для освещения, отопления и заправки автомобилей. Возле биогазовых установок выгодно ставить теплицы. Однако стоит отметить, что биогазовые установки не нашли широкого применения в России, что связано с их высокой стоимостью. Так, средняя стоимость биогазовой станции зарубежного производства под ключ составляет 2,5-4 млн. € за 1 МВт Возможна комплектация биогазовой установки линией сушки и фасовки удобрений (плюс 25%). Для производства биометана (аналог природного газа), годного для заправки в автомобили или подачи в газовую сеть, установка оснащается системой очистки (плюс 25–30% от базовой комплектации) [21]. Кроме того, доказано, что устанавливать биогазовую установку экономически целесообразно лишь на крупных животноводческих и птицеводческих хозяйствах с численностью животных или птиц более 10 тыс. голов [22], [23] .

1.7 Аэробные методы ферментации навоза и помета

В результате получают удобрения со свойствами, отличными от свойств исходных материалов. В частности компостирование навоза и помета с торфом, древесными опилками, соломой, сапропелем, почвой резко снижает потери азота. При этом значительно уменьшается неприятный запах и загрязнение окружающей среды [24],[25].

Компостирование – это экзотермический процесс биохимического окисления, в котором органический субстрат подвергается аэробной деструкции специфической популяцией микроорганизмов в определенных условиях. Компосты, как правило, состоят из двух основных компонентов, неодинаковых по степени устойчивости к разложению микроорганизмами. Один из них – легкоразлагающийся компонент – это птичий помет (или навоз и т.д.) – который богат питательными веществами, преимущественно азотсодержащими, микрофлорой. Другой компонент — торф, лигнин, солома, опилки и т.д. – обладает высокой влагоемкостью, содержит преимущественно сложные полисахариды и слабо разлагается в природе. Компостированием получают ценные для сельского хозяйства органические удобрения и средства, улучшающие структуру почвы. Большое распространение получило получение искусственной почвы с помощью компостирования и её использование в биоинтенсивном земледелии. Компосты можно использовать для выращивания грибов, в качестве основного удобрения на огородах, садовых участках. Тепло, выделяемое при компостировании, можно применять для нагрева воздуха и воды до температуры 50-55 ⁰С и отопления парников [26].

В зависимости от составляющих компонентов можно выделить следующие виды компостов: торфонавозные, торфожижевые, сборные (приготовленные из твердых бытовых и промышленных отходов), навозно-почвенные, торфопометные, пометноопилочные, пометнолигниновые, пометопочвенные и другие [27]. Длительность компостирования зависит от климата, продолжительности хранения компостной массы, влажности, условий аэрации. Полевое компостирование в кучах и буртах требует больших площадей и длится в зависимости от биодоступности субстрата, применяемой механизации и системы аэрации от 3 недель до 1, 5 лет. В крупных масштабах этот метод невозможно применять вблизи населенных пунктов. По окончании компостирования степень переработки органического вещества составляет 40-60%, влажность массы снижается до 25-50%, зольность увеличивается до 25-70% и существенно уменьшается её объем, а оставшийся органический субстрат претерпевает физические и химические превращения, сопровождающиеся образованием гумифицированного конечного продукта. Выделяют 4 стадии компостирования.

I стадия — мезофильная (развиваются мезофильные микроорганизмы, температура внутри смеси начинает постепенно повышаться с 10-15 до 30-40 ⁰С); II стадия – термофильная (температура смеси достигает 40-45⁰С), когда начинают развиваться термофилы и температура продолжает возрастать, достигая максимальных значений 70-80⁰С). Из-за протекания процессов аммонификации рН начинает повышаться. Условия, благоприятные для развития термофильных бактерий сохраняются недолго, термофильные бактерии спорулируют и в таком состоянии сохраняют жизнеспособность. Скорость окисления начинает падать, рН убывать, но все еще остается щелочным. III стадия – остывания. По мере остывания сначала начинают восстанавливаться популяции спорообразующих бактерий, актиномицетов и грибов. Бурно развиваются актиномицеты, которые выделяют антибиотики, подавляющие микобактерии и гнилостные бактерии, сохранившиеся после термостадии, что способствует обеззараживанию компостированного материала. Продолжительность первых трех стадий составляет несколько суток и недель. IV стадия – созревание. На этой заключительной стадии наблюдается дефицит питательных веществ, смена доминирующей микрофлоры приводит к лизису части микробных клеток, появляются почвенные животные. Идет образование гумусового вещества. Продолжительность последней четвертой стадии длится несколько месяцев. При соблюдении технологии получают биогумус хорошего качества; органические вещества – 25-80%; углерод – 8-50%; азот – 0,4 – 3,5%; фосфор – 0,1-1,6%; калий – 0,4 -1,6%; кальций в виде CaO – 0,7-1,5%; рН компоста – 6,5 – 7,5%. Ускоряют переработку помета штаммы бактерий или грибков под общим названием «эффективные микроорганизмы» — это микроорганизмы, выделенные из компоста или специально селекционированные штаммы-деструкторы на основе термофильных актиномицетов, бактерий, грибов. Добавки на основе аборигенной микрофлоры получают методом накопительных культур на компостируемых субстратах, например, в аппаратах с принудительным перемешиванием и аэрацией. Полученную закваску вносят в основную компостную массу. Добавление стартовых культур может сократить сроки компостирования до 4-15 суток [28], [29]. В институте сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) под руководством И.А. Архипченко была разработана технология переработки бесподстилочного помета (навоза), основанная на микробио-трансформации исходного отхода в гранулированные биоудобрения. Резуль­таты исследований, проведенных в с 1996 года по 2003 год, свидетельствуют, что получаемые удобрения (бамил, омуг, пудрет, экуд) по действию на продуктивность растений и агрохимические свойства почвы существенно превосходят действие традиционных органических и минеральных удобрений [30].

В настоящее время на российском рынке представлен достаточно широкий круг различного рода биоактиваторов и ферментных препаратов, предназначенных для глубокой переработки навоза и биологической очистки сточных вод и отстойников на свинофермах. Среди наиболее известных можно отметить такие, как Липастар, Микрозим, Оксидол, Водограй, Абсолют-Агро, Тамир и другие [31].

Применение биоактиваторов способствует снижению затрат на откачку и/или перемешивание навоза, сокращению сроков его обеззараживания и созревания в хранилищах, улучшению усвоения питательных веществ растениями, сохранению содержания азота на безопасном для растений и почвы уровне, снижению количества выбросов cероводорода и аммиака в атмосферу, уменьшению неприятного запаха и количества мух в стойлах. Все большее распространение приобретают комплексные технологии переработки свиного навоза. Одной из них является технология «Биохлев», представляющая собой комплекс анаэробных и аэробных бактерий для переработки навоза и прочих продуктов жизнедеятельности животных, производимая английской компанией Bio-SystemsEurope [32].

Механизированным компостированием (в биореакторах, биотуннелях, ферментационных барабанах, траншеях) можно уменьшить сроки компостирования до 2-3 недель и даже 2-7 суток. Объемы биореакторов для компостирования достигают 100-500 м³, производительность от 0,5 до 300 т компоста в сутки. В комплекты оборудования таких систем входят контейнеровозы, погрузчики, транспортеры, прессы, барабанные грохоты, магнитные сепараторы, установки для измельчения отходов, смесители, биофильтры или компостные фильтры для рыхления и перемешивания, компостной массы грейферного, лопастного, шнейкового и других типов. Компостирование с использованием механизированных технологий проводится в два этапа: первый – ускоренное разложение органического материала в условиях контролируемой температуры, влажности, аэрации; второй – дозревание полученной компостной массы в течение 3-4 недель в буртах или штабелях на площадках или в реакторах, где она стабилизируется, обеззараживается и высушивается. Однако процесс компостирования помета как способ его утилизации имеет ряд недостатков. Компостирование обычно связано с добавлением большого количества органических и минеральных веществ, что весьма трудоемко, требует соответствующей механизации и большого количества транспортных средств. Кроме того, компостирование не исключает возможность распространения различных заболеваний, загрязнения грунтовых вод и окружающей территории. Недостатком механизированных технологий компостирования – высокая стоимость сооружений, в 5-10 раз превышающая стоимость сооружений для компостирования в штабелях, сложность эксплуатации. Затраты электроэнергии на приготовление 1 т продукта составляет 20-200 кВт*ч. Цена высококачественного компоста составляет 30-50 долл. За 1 т сухой массы [33].

Известен такой способ переработки навоза как вермикомпостирование, основанный на способности дождевых червей потреблять любые органические отходы, выделяя при этом ценнейшее гумусодержащее удобрение [34]. Многочисленные исследования проведенные за рубежом показывают, что применение технологии переработки навоза с помощью дождевых червей имеет ряд преимуществ перед традиционной технологией утилизации органосодержащих отходов, а именно: гранулированные гумусодержащее удобрения как продукт жизнедеятельности вермикультуры превосходит навоз и компосты по содержанию гумуса в 4…8 раз, причем характерной особенностью является небольшой разрыв в показателях отношения С:N, это в 2-3 раза выше чем у компостов традиционного способа приготовления [35].

Большое количество гуминовых кислот в вермикомпост вызвано повышенной ферментативной активностью, в частности по пероксидазе и полифенолоксидаз. Пероксидазы окисляют органическое вещество за счет кислорода, перекиси водорода или органических перекисей образующихся в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Полифенолоксидаза катализируют окисление фенолов в присутствии кислорода воздуха, их активность отражает интенсивность процессов образования гумусовых соединений [36].

Повышение активности нитратедуктазы, в свою очередь способствует снижению содержания нитратов в растениях при применении в качестве удобрения биогумуса [37]. Кроме того, вермикомпост представляет собой структурные отдельности, прочные и водостойкие, т.к. в кишечнике червей происходят процессы полимеризации продуктов распада органического вещества и формируются молекулы гуминовых кислот. Эти молекулы образуют комплексные соединения с минеральными компонентами (прежде всего с биогенным кальцитом), что позволяет долго сохраняться в виде стойких образований [38]. Это дает возможность использовать биогумус для улучшения агрофизических свойств почв, предназначенных для выращивания сельскохозяйственных культур и совмещать посев с внесением биогумуса или вермикомпост сеялками.

Одна из отличительных особенностей биогумуса или вермикомпост в том, что он не содержит жизнеспособных семян сорных растений, в навозе и компосте традиционного приготовления количество сорняков достигает нескольких миллионов в одной тонне. При неправильном хранении количество жизнеспособных семян в бурте за летний период может возрасти в 10-15 раз за счет вторичного засорения [39], [40]. После вермикомпостирование то есть прохождения материала через мускулистый желудок и кишечник червей, семена перетираются с частицами песка повреждается семенная оболочка и они теряют жизнеспособность.

Из одной тонны органосодержащих отходов при переработке ее червями получается 100 кг биомассы червей и 600 кг гумусового удобрения, с более высокой питательной ценностью, чем навоз. В связи с этим можно выделить еще один положительный момент в сравнении с другими способами приготовления компостов — это меньшие нормы внесения, что безусловно экономически более выгодно. Численность полезных микроорганизмов в биогумус выше, чем у исходных компостов. Состав микрофлоры зависит от состава пищи, как уже было сказано выше, влияет на многие свойства вермикомпостов [41]. Известно, что микроорганизмы, грибы, актиномицеты закрепляют химические элементы вермикомпост [42]. Анализ микробиологических свойств готового вермикомпост, показал, что это — продукт с достаточно стабильным микробным сообществом. При естественной влажности (около 74%) он характеризуется определенной пропорцией микробной биомассы: 63-71% — грибной мицелий; 21-28% — споры грибов и дрожжеподобные организмы; 5,6-6,7% — бактерии; 2,3-3,2% — мицелии актиномицетов. В отличие от исходного субстрата и навоза в вермикоспосте снижается доля грибного мицелия, но возрастает доля функционально активного мицелия актиномицетов; в группе бактерий доминируют представители актиномицетов. Среди грибов преобладают активные целлюлозоразрушающие виды, которые не токсичны и не патогенны для растений, а напротив обладают антагонистическим эффектом по отношению к фитопатогенным микроорганизмам [43].

Таким образом, вермикомпост или биогумус превосходит по многим параметрам традиционные органические удобрения, а реутилизация органических отходов с помощью вермикультуры позволяет решить следующие проблемы:

— комплексную утилизацию сельскохозяйственных отходов органосодержащих отходов;

— получение ценного органического удобрения биогумуса и кормового белка в виде биомассы червя;

— получение экологически чистой сельскохозяйственной продукции и повышение урожайности;

— получить экономический эффект от применения биогумуса в связи с небольшими дозами внесения, продолжительностью действия и быстрыми темпами прироста биомассы.

Метод вермикомпостирования вышел на волну популярности из-за активного развития органического земледелия в мире.

Евросоюз активно продвигает органическое сельское хозяйство, оно является юридически определенной и сертифицированной устойчивой системой производства продовольственной продукции с доказанными преимуществами для окружающей среды и благополучия животных, а также устоявшейся и прибыльной для фермеров, переработчиков и розничной торговли. Ассоциация органического сельского хозяйства IFOAM EU предполагает, что, как минимум, 20% сельхоз площадей в Европе перейдет на этот тип хозяйствования. Однако этот способ утилизации больше подходит для фермерских хозяйств и хозяйств с небольшим выходом навоза

1.8 Пути подготовки и утилизации стоков животноводческих и птицеводческих предприятий

Сточные воды животноводческих комплексов отличаются высокой концентрацией веществ во взвешенном и растворенном состоянии и высоким бактериальным обсеменением, в частности, возбудители бруцеллеза жизнеспособны в жидком навозе 108-174 суток, сальмонеллеза – 90-160, рожи свиней 92-157, ящура 42-192, туберкулеза 457 суток; яйца аскарид – свыше 6 месяцев. С повышением влажности навоза и особенно попадании его в почву возбудители инфекций сохраняемость продлевается. Поэтому использование необеззараженных навоза и стоков опасно в эпизоотическом и эпидемическом отношении сальмонеллы, возбудители туберкулеза и других инфекций. В связи с этим, сточные воды представляют эпидемиологическую опасность и могут быть использованы для орошения сельскохозяйственных угодий только после карантина, который длится от 6 до 12 месяцев. Современные промышленные технологии производства животноводческой продукции предусматривают безподстилочное содержание животных и широкое применение гидравлических систем навозоудаления. Это приводит к накоплению в хозяйствах больших объемов жидкого навоза и стоков, которые из-за отсутствия безопасных способов обработки и утилизации создают угрозу возникновения эпизоотий и загрязнения окружающей среды [44].

Навозные и пометные стоки отличаются высоким показателем БПК₅ — от 7200 до 13600 мг/л. Этот показатель свидетельствует о высокой удобрительной ценности навозных стоков. При внесении навозных стоков на полях достигается полная переработка их в биомассу сельскохозяйственных растений. Этому способствует микрофлора, почва и солнечная энергия. Исследованиями установлено, что при инфильтрации жидкой фракции навозных стоков через почвенный слой толщиной 50 см степень очистки достигает 99% .

Из существующих способов обеззараживания животноводческих стоков – химический, физических, биологических. Последнему уделяется все большее внимание.

Из новых промышленных технологий переработки жидкого навоза применяется анаэробная биоконверсия в биоэнергетических установках, в которой использован многолетний опыт анаэробного сбраживания осадков отстойников и избыточного или аэротенков очистных сооружений коммунальных стоков. Процесс анаэробного сбраживания стоков животноводческих и птицеводческих ферм и в метантенке ведется при избыточном давлении биогаза от 0,2 – 0,4 Мпа. Число биореакторов должно быть не менее двух, что обеспечит оптимальные условия для анаэробной ферментации жидкого навоза и позволит при возникновении эпизоотий инфекционных болезней животных перевести работу метантенков с проточного на цикличный термофильный режим. Анаэробную ферментацию осуществлять в биоэнергетических установках при термофильном режиме работы метантенков (53-56°С) с выдерживанием в них навоза в течении трех суток без добавления свежих порций необработанной массы. Метантенки работают в термофильном режиме поочередно. Чтобы обеспечить шестисуточное карантинирования навоза на очистных сооружениях при наличии двух и более метантенков или других сооружений (биофильтров, аэротенков, отстойников, накопителей), нужно учитывать продолжительность прохождения массы последовательно по всем этапам обработки. В технологиях с одним метантенком для шестисуточного карантинирования (а в случае эпизоотий и обеззараживания) жидкого навоза на очистных сооружениях навозонакопители должны быть рассчитаны на шестисуточный объем получаемых органических удобрений. При выдерживании жидкого навоза с рН 8,0 – 8,5 в анаэробных условиях с температурой 36-38°С обеззараживание достигается через 10-15 суток при контаминации его неспорообразующей патогенной микрофлорой, контролируемой по выживаемости бактерий группы кишечной палочки и стафилококкам, и 20 суток при наличии возбудителя туберкулеза. При выдерживании его с температурой 40-42°С для обеззараживания от аспорогенной микрофлоры необходимо 7-9 сут. При попадании инфицированного переброженного навоза в фермерские накопители обработанную массу нужно выдерживать в секциях навозохранилищ 6 месяцев [45].Из аэробных способов переработки и утилизации жидких отходов животноводства и птицеводства, обеспечивающих получение обеззараженных органических удобрений, получили распространение: сооружения полной биологической очистки, на которых проходит биоокисление в искусственных условиях на биофильтрах, в аэротенках, в биологических прудах. Полного обеззараживания стоков система рыбоводно-биологических прудов не обеспечивает и на случай эпизоотий предусмотрено длительное выдерживание стоков в отстойниках – накопителям с последующим использованием по принятой технологии очистки [46]. Таким образом, специфичность сточных вод животноводческих и птицеводческих хозяйств ограничивает использование традиционных методов очистки и ставит задачу совершенствовать существующие и изыскивать новые методы и схемы очистки и обеззараживания [47]. Для выхода из этой тупиковой ситуации Е.Г. Борисенко еще в конце 70-х годов прошлого века была предложена схема двухстадийной микробной биоконверсии свиноводческих стоков — выращивание дрожжей на первой стадии и доочистка активным илом [48].

II Материал и методы исследований

2.1 Селекция аборигенных микроорганизмов свиного навоза и птичьего помета проводилась в несколько этапов:

2.1.1 Объектами исследований служили выделенные селекционным путем накопительные и чистые культуры микроорганизмов, выделенные из загрязненных свежим свиным навозом и птичьим пометом почв: птицефабрика ОАО «Спутник» Соль-Илецкого района Оренбургской области и свиноферме хозяйства ООО «СГЦ «Вишневский» Сакмарского района Оренбургской области.

2.1.2 Выделение чистых культур, изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств. Идентификация микроорганизмов.

Для получения изолированных колоний использовали метод последовательных разведений, для этого стерильную водопроводную воду разливали стерильной пипеткой по 9 мл в стерильные пробирки. Затем переносили стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материала в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Если исследуемый материал (почва) уже был разведен в 100 раз, получали разведение 1:10³. Суспензию этого разведения тщательно перемешивали с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру повторяли 3-5 раз, что обеспечивало перемешивание суспензии и уменьшало адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой взяли 1 мл полученного разведения и перенесли его во вторую пробирку – это разведение 1:10⁴. Аналогичным способом готовили и последующие разведения. Выделение накопительных культур микроорганизмов получали рассевом разведений накопительных культур на чашках Петри с элективными агаризованными средами [49] , где в качестве источника углерода использовали 1% свиного навоза или 1% птичьего помета. В качестве исходной суспензии использовали 1 мл накопительной культуры в 100 мл стерильной среды. Далее наносили 0.1 мл разведенной культуры на поверхность среды в чашках Петри и затем равномерно распределяли шпателем по чашке, стараясь покрыть всю ее поверхность. Чашку закрывали крышкой, на крышке делали надпись, характеризующую данное испытание. Далее чашку не помещали в термостат, где выдерживали для инкубирования микроорганизмов при температуре 26-28оС в течение 3 и 7 суток. Для каждого разведения микроорганизмов проводили три параллельных посева и инкубирования. После окончания инкубирования чашки вынимали из термостата и помещали вверх дном для счета колоний визуально. По числу колоний, выросших на среде трех чашек для одного разведения, рассчитывали среднее арифметическое значение, которое принимали как основную исходную величину для дальнейшего расчета. Число колоний, выросших на среде каждой из трех чашек не должно отличаться от среднего арифметического значения более чем на 10% относительных, рассчитанных и округленных до целого числа. Чистые культуры получали рассевом разведений накопительных культур. В качестве исходной суспензии использовали 1 мл накопительной культуры в 100 мл стерильной среды. Далее наносили 0.1 мл разведенной культуры на поверхность среды в чашках Петри и затем равномерно распределяли шпателем по чашке, стараясь покрыть всю ее поверхность. Далее чашку, не переворачивая, помещали в термостат, где выдерживали для инкубирования микроорганизмов при температуре 26-28^оС в течение 3 и 7 суток. Для каждого разведения микроорганизмов проводили три параллельных посева и инкубирования. После окончания инкубирования чашки вынимали из термостата и помещали вверх дном для счета колоний визуально. По числу колоний, выросших на среде трех чашек для одного разведения, рассчитывали среднее арифметическое значение, которое принимали как основную исходную величину для дальнейшего расчета. Число колоний, выросших на среде каждой из трех чашек не должно отличаться от среднего арифметического значения более чем на 10% относительных, рассчитанных и округленных до целого числа.

Микроскопированием определили морфологические особенности микроорганизмов. При изучении морфологии бактерий учитывали: форму клеток (кокк, палочка и т.д.); характер взаимного расположения; размеры клеток; наличие спор; капсул; подвижность; окраска по Граму.

Изучение культуральных свойств проводили по характеру роста на плотных и жидких питательных средах. Описание поверхностных колоний, выросших на плотных питательных средах проводили по следующим признакам: а) форма колонии (округлая, неправильная, ризоидной и т.д.); б) поверхность колоний (гладкая, бугристая, морщинистая, блестящая; в) профиль (плоский, выпуклый, кратерообразный и т.д.); г) цвет колонии; д) размер (диаметр) колонии измеряется с помощью линейки; е) край колонии (ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый); ж) структура (мелко-, крупнозернистая, однородная); з) консистенция (мягкая, плотная, слизистая, тягучая). При росте культуры на скошенном агар-агаре: а) рост (пышный, скудный, умеренный); б) характер налета колонии (сплошной, диффузный); в) характер края штриха (ровный, волнистый); г) поверхность штриха (блестящая, матовая, мучнистая); д) профиль штриха (плоский, выпуклый); е) консистенция культуры (сочная, сухая, слизистая); ж) оптические признаки штриха (прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная); з) цвет налета и изменение окраски среды. При росте культуры на жидких средах: а) интенсивность роста; б) характер (муть, осадок, пленка); в) мутность среды и степень мутности; г) характер осадка; д) характер пленки (гладкая, сухая, морщинистая, плотная); е) появление запаха и изменение цвета среды. Изучение биохимических свойств проводили с учетом способности ферментации углеводов на цветных средах Гисса, восстановления нитратов, характера роста на желатине. Для определения ферментации углеводов готовили среды Гисса: к 100 мл дистиллированной воды прибавляли 1 г пептона и 0,5 г NаС1. Растворяли при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтровали через бумажный фильтр до совершенно прозрачного раствора, устанавливали рН= 7,0-7,4, а затем прибавляли 0,5-1,0 г одного из углеводов и индикатор Андреде в количестве 1 мл на 100 мл среды. Готовую среду разливали по 3 мл в пробирки, стерилизовали вместе с поплавками, расположенными запаянным концом вверх текучим паром три дня подряд по 30 минут, при 112 °С. Среды Гисса имеют соломенно-зеленый цвет (рН= 7,0-7,2). В результате роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углеводов с образованием кислых продуктов распада, цвет среды меняется. Образование газа в среде определяли по наличию пузырьков в поплавке. Для выяснения способности восстанавливать нитраты делали посев в МПБ с 0,1% нитратом калия. Через несколько дней определяли наличие нитратов реактивом Гисса и наличие аммиака – реактивом Несслера. При малом содержании аммиака окраска желтая, при значительном оранжево-желтая, при большом – красно-бурая. Для определения нитратов реактив Гисса употребляли в сухом виде. На каплю, культуры скальпелем насыпали немного реактива. Окраска менялась до густо-малинового цвета сразу при большом количестве нитратов и постепенно – при малых количествах. Определение сероводорода проводили на плотной среде следующего состава: к 1 л стерильного 1,7—2 %-ного МПА добавляли сернокислое железо (FeSO₄) — 0,2, гипосульфит (тиосульфат Na₂S₂O₃) натрия -0,3, глюкозу -1 г, индикатор фенолрот водный 0,3 %-ный -12 мл. Среду разливали в стерильные пробирки по 5-6 мл, стерилизовали текучим паром 20 мин. Перед употреблением среду расплавляли и охлаждали в наклонном положении пробирки. Посев делали на скошенную поверхность агар-агара, а затем уколом в нижнюю часть столбика среды. При наличии сероводорода под действием растущей бактериальной культуры столбик среды краснеет, нижняя часть окрашивается в черный цвет. Протеолитическую способность – на желатиновой среде. Делали посев уколом в столбик МПЖ, после чего пробирки инкубировали в термостате, при температуре 28-30 °С. На другой день помещали пробирки на 60 минут в холодильник и отмечали наличие разжижения и его характер:1) равномерное, начиная с поверхности (строгие аэробы); 2) кратеровидное, воронковидное, реповидное (менее строгие аэробы);3) мешковидное (факультативное, анаэробы); 4) пузыревидный рост в глубине среды (строгие анаэробы). Использование органических соединений азота. Индол устанавливали с помощью реактива Эрлиха: в пробирку с 5 мл 2-3-суточной бульонной культуры бактерий добавляли 2 мл эфира, содержимое встряхивали и дали отстояться. Затем под слой эфира пастеровской пипеткой подслаивали 0,5-1 мл реактива Эрлиха. При наличии индола в течение 3—5 мин на границе между эфиром и бульонной культурой образовывался интенсивно-розовое кольцо [50]. Молекулярно-биохимическую идентификацию штаммов микроорганизмов проводили с использованием полимеразной цепной реакции по видоспецифическому гену штамм. Выделение ДНК и ПЦР анализ проводили согласно [51]. Построение древа родства RibosomalDatabaseProjectII [52] .

2.1.3 Выращивание отобранных чистых культур аборигенных микроорганизмов проводили в режиме накопительной биомассы с применением проточной системы культивирования, работающей в режиме хемостата, также методом твердофазного культивирования [53].

2.2 Использование для обезвреживания и утилизации свиного навоза и птичьего помета интродукции специальных штаммов-деструктов.

• • 1. Объектами исследований служили:

1. Штамм бактерии Bacillussubtilis 534 (депонирован в ВКМ Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под номером В1666 D). Посевной материал штамма бактерии Васillussubtilis 534 выращивали на известной питательной среде, разработанной для данного штамма [54]: (в %): калий фосфорно-кислый однозамещенный 0,2-0,4, сульфат аммония — 0,1-0,3, цитрат натрия — 0,2-0,4, цитрат аммония -,03%% 0,5, глутаминовая кислота — 0,2-0,4, молочная кислота — 0,5-1,5, диализат дрожжей — 5,0-9,0, сернокислое железо — 0,00005-0, 00015, сернокислый магний — 0,0025-0,0075, лактат кальция — 0,0005-0,0015, глюкоза — 0,3-0,5, картофельно-глицериновый бульон — 20-30, остальное – вода. В качестве воды мы использовали, разведенную в 2 раза сточную воду птицефабрики состав которой представлен в таблице 2.

2.Штамм Hypomycesrosellus КМ- 400 хранится в музее чистых культур кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова как продуцент протеолитических ферментов и антибиотически активного препарата антибактериального и фунгицидного спектров действия. Выращивание штамма проводили на ранее разработанной питательной среде [55]. в ферментерах мешалочного типа емкостью 10 л с подачей воздуха с подачей воздуха 0,2-0,4 л/л в мин., при перемешивании 300 об/мин. в течение 48-72 часов при температуре 25-260 С. Состав питательных сред и способ культивирования гриба описаны ранее [55]. В качестве индуктора синтеза ферментов вносили навоз свиной или куриный помет в количестве 1%.

2.2.2 Определение физиологически активных соединений, образуемых интродуцированными штаммами в лабораторных условиях.

Амилолитическуюи протеолитическую активности определяли согласно [56]. В качестве тест – микроорганизмов использовали бактериальные и дрожжевые культуры: Escherichiacoli К12 (АТСС 25922), Escherichiacoli 354, StaphylococcusaureusP 209 (ATCC 6538- 452, Pseudomonasaeruginosa (АТСС 27853), Pseudomonasfluorescens ВКПМ №В-350, Pseudomonasputida КМ МГУ №95, Candidaalbicans (получены с кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет») и фитопатогенные грибы: Alternariatenius, Moniliafructigena, Botrytiscinerea, Rhizoctoniasolani, Fusariumroseus, Fusariumoxysporum, Helmintosporumsativum, Microsporumcanis, Mucorsp., Candidaalbicans, Pucciniagraminis, Cladobotriumcladobotrium из музея чистых культур кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

2.2.3 Определение веса сухой биомассы. Этот метод широко применяется для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Мицелий с колбы, содержащей 100 мл культуральной жидкости, перемешивали и фильтровали в воронке через бумажный фильтр, предварительно доведенный до постоянного веса. Осадок троекратно промывали дистиллированной водой. Фильтр с мицелием доводили до постоянного веса в сушильном шкафу при t=1050C и охлаждали 2 часа при комнатной температуре. Вес сухой биомассы ( г/100 мл ): M = (A-B) 100/V, где A – вес фильтра с мицелием, г. B — вес фильтра без с мицелия, г. V – объем культуральной жидкости при фильтровании, мл.

Количественное определение белка по методу Лоури. Основан на измерении интенсивности окраски раствора, в котором осуществляется цветная реакция на белок (реакция Фолина) с тирозиновым и цистеиновым радикалами белковой молекулы, состоящая в восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комплексного соединения синего цвета. Указанной реакции восстановления способствуют комплексные соединения меди, возникшие при взаимодействии белка со щелочным раствором медного купороса. Реакция Фолина очень чувствительна, поэтому метод Лоури позволяет вести определения в сильно разбавленных растворах. Перед проведением определения смешивали 49 мл раствора A с 1 мл раствора B. К 1 мл исследуемого белкового раствора, содержащего от 10 до 100 мг белка, добавляли 4 мл смеси растворов A и B. Встряхивали и оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Затем быстро приливали из пипетки 0.2 мл реактива Фолина, энергично перемешивали и оставляли на 30 минут для развития окраски. При этом желтая окраска постепенно переходит в синюю. Оптическую плотность раствора измеряли на фотоэлектроколориметре при 750 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см. Содержание белка в испытуемой пробе устанавливали по калибровочной кривой, построенной заранее по раствору чистого белка с точно известной концентрации, в данном случае альбумину. Для этого готовили серию растворов альбумина с содержанием от 20 до 400 мг в 1 мл. [57].

2.2.4 Обезвреживание и переработку жидкой, полужидкой и твердой фаз навоза и помета проводили с использованием интродукции штаммов деструкторов на территориях животноводческого и птицеводческого хозяйств. Для этого твердую фракцию навоза или птичьего помета предварительно отделяли от жидкой путем центрифугирования и каждую фракцию обрабатывали путем распыления суспензии биомассы интродуцируемого штамма микроорганизмов концентрацией 2*10⁵-2*10⁶ микробных тел/мл на 1 тонну навоза или помета. Жидкую фракцию периодически переносили в специальную емкость, оборудованную тонкослойным отстойником, где в течение 1 часа отставляли отстаиваться. Осветленную часть дренажной воды далее с помощью насоса переносили в аэробный биореактор и засевали посевной культурой интродуцированного штамма с титром 10⁸кл/мл. Полужидкую (влажность 90-93%) и твердую (влажность 75-80%) фракции птичьего помета с общим микробным числом (ОМЧ) 9*10⁶ КОЕ/мл и коли-титром равном ≥0,001 мл обрабатывали суспензией культуры активного из расчета 1 млрд клеток на 1 т птичьего помета на площадке, оборудованной снизу каналами для подачи воздуха. Под воздействием воздуха, поступающего снизу в твердую фракцию помета, происходил рост штаммов и синтез гидролитических ферментов и антимикробных веществ, подавляющих болезнетворные микроорганизмы птичьего помета. В таком виде твердую фракцию помета, периодически переворачивая, подвергали компостированию при участии аборигенной микрофлоры. Процесс компостирования вели при контроле температуры и определенной влажности бурта и в конце ферментации наблюдали снижение аммиачного запаха, изменение цвета и агрегатного состояния содержимого буртов.

2.3. Влияния полученных органических продуктов на урожайность и качество ячменя и нута.

Объектами исследований являлись районированный сорт нута «Краснокутский-36» и ячмень яровой селекции Оренбургского государственного аграрного университета.Полевые опыты с использованием органических продуктов на основе полученных нами продуктов будут заложены в мае месяце 2021 года на учебно-опытном участке Оренбургского государственного аграрного университета. Влияние предпосевной обработки семян на всхожесть, энергию прорастания и биометрические показатели семян нута и ячменя определяли согласно [58].

Все опыты проводили в трехкратной повторности. Результаты обрабатывали статистически [59].

III Результаты и обсуждение

Использование способов очистки навозо- и пометсодержащих сточных вод и переработки навоза/птичьего помета с внесением культур микроорганизмов в условиях контролируемой температуры, влажности и аэрации с участием аборигенной микрофлоры позволяет получать эффективные биоудобрения, кормовые добавки и значительно сократить сроки обеззараживания навоза- и пометосодержащих масс.

Одной из задач нашего исследования являлось выделение из загрязненных свиным навозом и птичьим пометом грунтов наиболее активных штаммов микроорганизмов, способных использовать навоз или помет в качестве единственного источника углерода и энергии. В процессе работы было выделено около 100 накопительных культур на питательных средах, содержащих 1% свиного навоза и 1% птичьего помета, в которых регистрировался рост представителей следующих родов. Результаты позволили выделить следующие бактерии, обладающие способностью утилизировать навоз и помет: Pseudomonas, Proteus, Enterococcus, Micrococcus, Bacillus, Xanthomonas, Rhodococcus, Stenotrophomonas, Lactococcus, Lactobacillus и микроскопические грибы рода Penicillium, Mucor, Aspergillus(таблица 1). При выращивании в режиме глубинного культивирования в хемостатедо снижения концентрации загрязняющих веществ уровня ниже ПДК, оставались лишь виды, совмещающие высокую скорость размножения с высокой биопродуктивностью. Таким образом, из 100 микробных культур, в которых был зарегистрирован рост, утилизация и обезвреживание свиного помета и навоза было отобрано первоначально 10-12 наиболее активных культур, а затем отобраны только 2 наиболее активные культуры, имеющие высокую скорость размножения и наибольшую продуктивность. В дальней работе была проведена их идентификация до вида с использованием метода полимеразной цепной реакции.

Таблица 1

Накопительные культуры почвенных микроорганизмов, утилизирующих отходы животноводства

Список использованных источников литературы

1. Микробиологические риски в промышленном птицеводстве и животноводстве /В.И. Фисинин, В.И. Трухачев, И.П. Салеева, В.Д. Морозов, Е.В. Журавчук, Р.О. Колесникова, А.В. Иванов //Сельскохозяйст.биология. – 2018. – Т. 53. — № 6. – С. 1120 – 1130.

2. Рациональное природопользование и кормопроизводство в сельском хозяйстве России / В. М.Косолапов, И. А.Трофимов, Л. С.Трофимова, Е. П.Яковлева.– М.: РАН, 2018. – 132 с.

3. Справочная книга по органическим удобрениям. –Владимир:ВНИПТИОУ, 2001.– 495 с.

4. Инновационные технологии производства биотоплива второго поколения: науч. изд./В.Ф. Федоренко, Д.С.Буклагин, А.Н.Зазуля, И.Г. Голубев и др. – М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2009. – 68 с.).

5. Лукин, С.М. Биологизация земледелия – научная и технологическая основа экологически устойчивого сельского хозяйства/С.М. Лукин, И.В. Русакова //Сборник научных трудов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологически устойчивое земледелие: состояние, проблемы и пути их решения»:. – ВНИИОУ – филиал ФГБНУ «Верхневолжский ФАНЦ», 22-24 июня 2018 г. Иваново: ПресСто, 2018. С.- 3-10

6. Структура условно-патогенной микрофлоры на животноводческих предприятиях различного профиля / И.М.Донник, А.Г.Исаева, Н.Б.Мусихина, К.В.Моисеева, А.А.Гордеев // Ветеринария Кубани. — 2019.- № 5.- С.50 -53.

7. Воздействие пометохранилища бывшей птицефабрики «Снежная» Мурманской области на поверхностные воды / Е.В.Левин, Р.Ф.Сагитов, Т.А. Гамм, В.Д.Баширов, Р.Н.Касимов, С.П.Василевская, А.Д. Буракаева //Известия Оренбургского государственного аграрного университета. — 2017.- № 3(65).- С. 210-212.

8.Суржко, О. А. Экологическая безопасность при переработке и утилизацииконцентрированных по биогенным элементам жидких отходов промышленных пред-приятий: монография /О. А. Суржко, М. А. Куликова //Юж.-Рос. гос.техн. ун-т (НПИ). — Новочеркасск: ЮРГТУ (НПИ), 2011. – 140 с.

9. Стратегия развития промышленности по обработке, утилизации и обезвреживанию отходов производства и потребления на период до 2023 года. //Распоряжение ПравительстваРоссийской Федерации от 25.01.2018 года № 84-p, Москва.

10. Приказ Федеральной службы понадзору в сфере природопользования от 22.05.2017 №242.

11. Дабахова, Е.В. Эколого-агрохимическая оценка применения различных систем удобрения на светло-серой лесной почве автореф. дис. … канд. с.-х. наук / Елена Владимировна Дабахова.-М.: ВНИИ«Анроэкоинформ», 1998. -21 с.

12. Запевалов, М. В. Переработка птичьего помета с получением электрической, тепловой энергии и комплексного органо­минерального удобрения / М. В. Запевалов // Вестник ЧГАА. ­ 2014. — №1.– С. 45­49.

13. Щеткин, Б.Н. Утилизация отходов птицеводства — решение проблем экологической безопасности и ресурсосбережения / Б.Н. Щеткин. -Пермь: ОГУП «Соликамская типография»,2002.-135с.

14. Щеткин, Б.Н. Утилизация отходов птицефабрик и получение чистого высокоэффективного удобрения /Б.Н. Щеткин. -Калининград: Вестник Балтийского научного центра РАЕН, 2002. — №7. — с.34-35.

15. Оценка прямоточного и промышленного способов сушки птичьего помета в барабанных сушильных установках В.И./ Малофеев В.И. и др//Эффективные приемы технологии в птицепроизводетве. — М, 1974.-с.80-83

16. Автоматизация процессов сушки в промышленности и сельском хозяйстве //под ред. А.М. Берлинера.- М: Машиздат, 1961.-291с.

17. Щеткин, Б.Н. Птичий помет и технологии его переработки в высокоэффективные удобрения /Б.Н. Щеткин. -Санкт-Петербург: Издательство СПбГАУ,2000.-256с.

18.Щеткин, Б.Н. Экологически чистая технология приготовления компостов с использованием термического воздействия /Б.Н. Щеткин //Актуальные проблемы инженерного обеспечения АПК. Сборник материалов международной научной конференции. — Ярославль.: ЯГСХА, 2004.-Ч. З.- С.34-35.

19. Малофеев, В.М. Органические удобрения: способы подготовки и внесения / В.М. Малофеев. -М.: Знание, 1988 г.-160c.

20. Мерзлая, Г.Е. Биологические факторы в системах удобрения / Г.Е. Мерзлая //Агрохимия.-2017.-№ 10. — С. 24 — 36.

21.Эффективность длительного применения органических и минеральных удобрений на дерново-подзолистой легкосуглинистой почве / Г.Е. Мерзлая,  Г.А.Зябкина,  Т.П. Фомкина //Агрохимия. -2012. — № 2.-С. 37-36.

22.Бирюков, К. Н. Использование биоценозов для обеззараживания органических отходов животноводства при анаэробной ферментации / К.Н. Бирюков // Ветеринария. — 2017. — № 6 . — С. 35-38.

23. Суржко, О. А. Экологическая безопасность при переработке и утилизацииконцентрированных по биогенным элементам жидких отходов промышленных предприятий: монография /. А. Суржко, М. А. Куликова //Юж.-Рос. гос.техн. ун-т (НПИ). -Новочеркасск: ЮРГТУ (НПИ), 2011. – 140 с.

24. Образование биогаза микробными сообществами при разложении целлюлозы и пищнвых отходов /Е.А.Цавкелова, М.А.Егорова, Е.В.Петрова, А.И.Нетрусов//Прикладная биохимия и микробиология. — 2012.- Т.48.- №4.-С.412-424.

25. Лысенко, В.П. Перспективные технологии переработки помета путем ферментации под влиянием присутствующих в помете микроорганизмов / В.П. Лысенко //Птицеводство. — 2011.- №1.- С.52-54

26. Бондаренко, А. М. Теоретико-технологические подходы к переработке жидких органических отходов /А. М. Бондаренко, Л. С. Качанова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. — 2017. — № 6 (68). — С. 114-117.

27. Способ приготовления компоста /В.Н.Афанасьев, В.В.Миллер,И.А. Архипченко, О.Я.Вайнберг, Т.Л.Клявина, Н.С.Федорова, Г.М.Юрина, 1988. — заявка № 1371960,опубл. бюл.5.

28. Лысенко, В.П. Биопрепараты для компостирования птичьего помёта / В.П. Лысенко, Г.Е. Мерзлая, Р.А.Афанасьев //Птицеводство. — 2014.- № 3. — С. 39–44.

29.Кутровский, В.Н. Биоконверсия отходов агро­промышленного комплекса / В.Н. Кутровский, О.Д.Сидоренко.- М.:НИИСХ ЦРНЗ, 2009.- 160 с.

30. Зеников, В. И. Методика расчета состава смеси при компостировании / В. И. Зеников //Вестник Российской сельскохозяйственной науки. — 2016. — № 1. — С. 47-48.

31.Получение высококачественных биокомпостов / И.А.Архипченко, О.В.Орлова, Ю.М.Лихачев, М.Я.Федашко //Экология и промышленность России. — 2000.- № 7.- С.16 – 22.

32. Кулинич, О. А. Биодеструктор свиного навоза. МикрозимВэйстТрит — биотехнология очистки, обезвреживания и деодоризации свиных стоков / О. А. Кулинич, В. В. Ларченко // Свиноводство. — 2016. — № 2. — С. 38-40.

33. Сидоренко, О. Д. Использование продуктов биоконверсии отходов животноводства в качестве органических удобрений (концепция) / О.Д. Сидоренко // Агрохимия. — 2018. — № 4. — С. 36-.

34. Орлова О.В. Биоорганические добавки для ускорения дозревания компоста из ТБО / О.В. Орлова, Н.А. Петухова, И.А.Архипченко //Экология и промышленность России. — 2008.- №10.- С.38 – 40.

35. Fester, C.F. Organic amendment effects on physical and chemical properties of a sands Jail / C.F. Fester // Soil Sc. Soc. American .– 1990.- №5.- P.827-831.

36.Азимов, Д.А. Биогумус позволит оздоровить почву и повысить урожай / Д.А. Азимов //Земледелие. — №7.- 1991. — С.22.

37. Мозженин, Н.М. Стимуляция образования физиологически активных веществ в почве органическими удобрениями / Н.М. Мозженин//Использование торфа и торфяников в сельском хозяйстве Западной Сибири. — Новосибирск, 1985.- с.55-61.

38. Умпелев, В.Л. Ферментативная активность вермикомпоста /В.Л. Успелов, Н.А.Сафронова //Ивано-Франковск ЦНТИ ассоциации «Биоконверсия», 1993.- с.13.

39. Пономарева, С.И. Скорость образования в почве кальцита дождевыми червями / С.И. Пономарева //Доклад ы АН СССР.- 1948.- Т.61.- №3.- с.505-507.

40.Касатиков, В.А. Эффективность действия вермикомпоста на агробиологические свойства почвы / В.А. Касатиков, М.Е.Кравченко, С.М.Куленичев //Тез. доклад II конгресса «Биоконверсия органических отходов народного хозяйства и охрана окружающей среды Ивано-Франковск. — 1992.-с.71.

41. Обезвреживание навоза от жизнеспособных семян сорняков / В.А.Андреев, А.В.Быкова, П.Д. Попов.- М.: Росагропромиздат, 1988.- 40 с.

42. Терещенко, Н.Н. Качественный состав микроорганизмов и сапрофитов в вермикоспосте разной биотехнологии / Н.Н. Терещенко, В.Н.Гучак //Проблемы экологии в сельском хозяйств. – 1993. -Ч.I.- С.31-33.

43.Слободян, В.А. Влияние вермикомпоста на микробиологические процессы в почве / В.А. Слободян, Н.С. Слободян//Химия в сельском хозяйстве. -1994.- №4.- С.8.

44. Васильев В.А. Органические удобрения в интенсивном земледелии / В.А. Васильев,И.И. Лукьяненко, В.Г.Минеев.- М:. Колос, 1984.- С.309.

45. Архипченко, И.А. Микробиологические основы безотходной технологии переработки стоков свинооткормочных комплексов. автореф…докт.биол.наук / Ирина Александровна Архипченко. -Ленинград, 1991.- 350 с.

46. Ильин, С.Н. Ресурсосберегающая технология переработки свиного навоза с получением биогаза: автореф. дис. … канд. техн. Наук/ Сергей Николаевич Ильин.- Улан-Удэ, 2005. — 23 с.

47.ПоздняковВ.М. Оптимизация биоценозов активного ила очистных сооружений животноводческих комплексов для снижения антропогенной нагрузки на водные экосистемы. дисс….. канд. биол. наук / Виктор Михайлович Поздняков .- Москва, 2000. – 239 с.

48. Очистка сточных вод промышленных животноводческих комплексов/ В.Ю.Трекало,А.Н. Волкова, А.И.Лукин, Н.Б.Федотова, В.И.Яковлев //Химия и технология воды.-1985.-Т.7.- № 2.- С.72-74.

49.Борисенко, Е.Г. Разработка комплексной технологии белковых препаратов на основе нетрадиционного сырья / Е.Г. Борисенко.- М.- 1990.- 474 с.

50. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. М.: Наука, 2004.-528 с.

51. Практикум по микробиологии: учебн. пособ. для студ. высш. учеб. заведений /Нетрусов А.И., Захарчук Л.М. и др. под ред. НетрусоваА.И. Москва: Академия, 2005.– 608с.

52. Irmis, M. A Guide to methods and applications /M.Irmis, D.Gelfand, J. Sninsky//PCR Protocols.- 1998.-P.14-15

53.Pavlicek, A., et al. Fre-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap jackknife analysis of tree robustness / A. Pavlicek. //Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol (Praha).-1999.- V. 45(3).-P. 97–99/

54. Твердофазное и поверхностно-мембранное жидкостное культивирование микромицетов, особенности их развития и образования ферментов /А.А.Осмоловский, Н. А. Баранова, В. Г. Крейер, Н.С. Егоров//Прикладная биохимия и микробиология. -2014.- Т.50.- №3.-С. 245 — 255.

55. Никитенко, М.В. Препарат споробактерин жидкий / М.В. Никитенко, В.И.Никитенко //Патент РФ №2217154. — 27.11.2003.

56. Буракаева, А.Д. Микофильные грибы — продуценты практически важных продуктов: монография / А.Д. Буракаева.-Оренбург: Экспресс-печать, 2013. –160с.

57. Manachini, P.L. TermostablealkalineproteaseprodacedbyBacillustermoruber-newspeclesofBacillus / P.L. Manachiniт, M.G. Fortina, C. Parini // Appl.Microbiol.Biotechnol.-1988. — № 28(4/6).-P. 409 – 413.

58.Филиппович, Ю.Б. Практикумпообщейбиохимии /Ю.Б. Филиппович, Т.А. Егорова, Г.А. Севастьянова. – Москва: Просвещение,1982.- 179 с.

59. Рогожин, В. В. Практикум по физиологии и биохимии растений: учеб. пособие / В.В. Рогожин, Рогожина Т.В. — СПб: ГИОРД, 2013.-352 с.

60. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) /Б.А. Доспехов.-М.: Книга по требованию, 2012.-352с.

61. Жданов, П.И. Биологический и эпизоотологический аспекты производства и применения нового пробиотика из бактерий рода Bacillus в свиноводстве, автореф. дисс. докт. ветер. наук / Петр Иванович Жданов, 1997.-30 с.

Список опубликованных работ по теме исследования

Scopus

1. Буракаева, А.Д. Перспективы использования штаммов родаHypomyces для получения вермикомпостов с фунгицидными и ростстимулирующими свойствами /А. Д. Буракаева, Г.В. Петрова // Биотехнология. – 2020 (подана).

2. Петрова, Г.В. Разработка органо-биологической системы удобрения на основе птичьего помета, повышающая плодородие черноземов южных и продуктивность культур полевого севооборота /Г.В.Петрова, А.Д.Буракаева, С.В. Сорокун, //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2020 (подана ).

RCSI

1. Петрова, Г.В. Получение органического продукта, обладающего свойством биоудобрения путем биоконверсии птичьего помета / Г.В. Петрова, А.Д. Буракаева, С.В. Сорокун//Вестник КрасГАУ. — 2020.- №12 (165).- С.90-95. DOI:10.36718/1819-4036-2020-12-90-95.
2. Петрова, Г.В. Утилизация отходов свинооткормочного комплекса с получением высокоэффективного органического удобрения/ Г.В. Петрова, А.М. Русанов, А.Д.Буракаева//Почвоведение. — 2020( подана).
3. Петрова, Г.В. Применение СВЧ-излучений для обеззараживания птичьего помета / Г.В. Петрова, А.Д. Буракаева, С.В. Сорокун // Известия ОГАУ. -2020.- №5 (85).- С.145-148.

Участие в конференциях

1. Петрова, Г.В. Проблемы утилизации стоков предприятий мясопереработки/ Г.В. Петрова // Материалы Международного научно-практического форума «ASU SciTechForum 2020», 12-13 ноября 2020 г. в Алтайском государственном университете (г. Барнаул, Россия).
2. Петрова, Г.В. Проблемы утилизации отходов птицеводства»/Г.В. Петрова. — ЦПО «Парадигма.83-ая международная форум «Обращение с органическими отходами. Опыт и перспективы». — 20-21 октября 2020 г. — Москва.

Заявки на патент

1.Петрова, Г.В. Применение штамма Bacillussubtilis 534 для обеззараживания и утилизации помета с получением органического продукта, обладающего свойством удобрения /Г.В. Петрова, А.Д.Буракаева, С.В. Сорокун. — Заявка на изобретение № 2020131900 от 05.05. 2020.

2.Буракаева, А.Д. Способ получения биоудобрения, обладающего фунгицидными свойствами /А.Д. Буракаева, Г.В. Петрова. — Заявка на изобретение. — 2020, подана.

РЕФЕРАТ

Отчёт 80 стр., 17 табл., 3 рис., 56 источн., 6 прил.

ПШЕНИЦА, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КАСП, ДИКИЕ ЗЛАКИ, СИНТЕТИЧЕСКАЯ ПШЕНИЦА, ЭГИЛОПС ТАУШИ, АДАПТИВНОСТЬ, КОРНЕВАЯ СИСТЕМА, КАЧЕСТВО ЗЕРНА. СОРТ, СЕМЕНА, ЭКОЛОГИЯ, ОРГАНИЧЕСКОЕ ЗЕМЛЕДЕЛИЕ.

Объектом исследования являются сорта, популяции, линии и гибриды яровой мягкой пшеницы.

Цель: создать адаптивный сорт яровой мягкой пшеницы для органического земледелия с ценными генами от диких злаков, повышающими качество зерна, устойчивость к засухе и болезням, идентифицированными в созданных линиях и сортах ДНК-маркерами.

Полученные результаты.

Расширен генетический потенциал устойчивости и качества зерна яровой мягкой пшеницы за счет генов диких злаков.

Достигнуто ускорение селекционного процесса за счет точной идентификации генотипов с помощью ДНК-маркеров;

Выделены источники устойчивости к засухе и болезням, качества зерна с идентифицированными генами КАСП-маркерами для маркер-контролируемого отбора при селекции пшеницы в Западной Сибири. В 2020 г. проведено маркирование 576 линий селекционных питомников первого и второго года, контрольного питомника и сортов питомника конкурсного сортоиспытания, чтобы провести маркер-контролируемый отбор по признакам продуктивности, устойчивости к болезням и качества зерна среди селекционного материала Омского ГАУ.

Сорт яровой мягкой пшеницы для органического земледелия Агрономическая 5 (Эритроспермум 4-16) передан на ГСИ. Сорт имеет потенциал урожайности более 6,0 т/га, устойчивый к болезням, засухе с высоким качеством зерна. Рекомендован для возделывания по технологии органического земледелия.

ВВЕДЕНИЕ

Применение технологии KASP^тм (Kompetitive Allele-Specific PCR), которая широко апробирована в современных селекционных программах, является доступным и надежным инструментом по идентификации маркеров, ассоциированных с генами селекционно-ценных признаков (Crain et al., 2018; Rasheed et al., 2016, 2019). Отбор селекционного материала с помощью КASP-маркеров позволяет повысить точность отбора нужных генотипов и открывает новые возможности в маркер-ориентированной селекции для экономии времени и средств на создание новых сортов (Хлесткина, Шумный, 2016; Yu et al., 2012; Crain et al., 2018).

Метод полногеномного анализа ассоциаций GWAS позволил идентифицировать 243 достоверных эффекта SNPs (P> 1.08 x 10-6) по 35 изученным признакам. SNP-локусы были распределены по всем 21 хромосомам и их эффект на признаки варьировал от 0,3 % до 25 %. Наибольшее количество достоверных ассоциаций маркер-признак (АМП) было обнаружено в геноме А (72), затем в геноме В (65) и геноме D (62) (Bhatta, Shamanin et. al., 2019). Полученные данные свидетельствуют о значимости синтетических гексаплоидов в качестве ценного генетического ресурса для расширения генетического потенциала создаваемых сортов пшеницы и повышения их устойчивости к биотическим и абиотическим факторам внешней среды.

Анализ мировой научной литературы и результаты наших исследований свидетельствует, что многочисленные синтетические формы, полученные в последние десятилетия с использованием диких злаков, как правило, с эгилопс Тауши (Ae. tauschii), являются ценным исходным материалом для создания сортов пшеницы, пригодных для органического земледелия — устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, с высокой продуктивностью и качеством зерна, отвечающего требованиям функционального питания, что и определило цели и задачи наших исследований.

Результаты работы по большому количеству линий, изученных на всех этапах селекционного процесса в 2020 году представлены в приложении А.

1 Использование ДНК-маркеров в селекции пшеницы (Обзор литературы)

Отбор с применением молекулярных маркеров успешно используется в селекционных программах для целенаправленного отбора растений, сочетающих целевой признак с высокой продуктивностью, при этом возможен отбор генотипов, гомозиготных по целевому признаку на любой стадии развития (Алтухов, Салменкова, 2002; Банникова, 2004; Хлесткина, 2011). Это значительно повышает эффективность селекционного процесса и ускоряет создание сортов яровой и озимой пшеницы, которые должны наиболее полно отвечать современным требованиям производства пшеницы. (А.М. Кохметова, 2014; И.Ф Лапочкина, 2018; Гультяева, Шайдаюк, Рсалиев, 2019; A. Morgounov et al., 2020).

Например, для ускоренного введения в современные сорта пшеницы генов, контролирующих антоциановую окраску перикарпа зерновки, получены диагностические ДНК-маркеры, с использованием которых можно вдвое ускорить процесс отбора по сравнению с отбором на основе оценки окраски зерна (Gordeeva, Shoeva, Khlestkina, 2015).

Идеальны, с точки зрения конаследования, внутригенные маркеры (foreground selection), их создание возможно, если ген секвенирован. Такие маркеры называются функциональными, их использование позволяет повысить точность отбора нужных генотипов до 100 % (Y. Liu et al., 2012; Khlestkina, 2012). MAS помогает решить различные задачи в селекции. Например, выявить с помощью молекулярных маркеров гены, контролирующие хозяйственно-ценные признаки культивируемых сортов и линий – это эффективный метод защиты авторских прав, оценки сортовой идентичности не только зерна, но и произведенных из него продуктов питания (И.Г. Адонина и др., 2016). Молекулярные маркеры, используемые в рамках MAS у пшеницы, разработаны к генам / QTLs, контролирующим устойчивость к болезням, реакцию на фотопериод, низкорослость, качество зерна (Хлесткина, 2013; Крупнов, Крупнова, 2015; Leonova, 2013; Li Y., 2018; A. Morgounov et al., 2018).

Яровая и озимая пшеница играет важную роль в увеличении производства зерна в Западно-Сибирском регионе, однако урожайность сортов в значительной степени зависит от устойчивости к возбудителям грибных болезней (V.Р. Shamanin et al., 2016). Территориальная близость Западной Сибири с Казахстаном, который в свою очередь граничит со странами, где обнаружена раса Ug99, предполагает возможность ее заноса. Большинство возделываемых сортов пшеницы восприимчивы к возбудителю стеблевой ржавчины, а устойчивые российские сорта в основном защищены генами Sr31 и Sr25, что обусловливает расширение генетической основы устойчивости к этому патогену (А.С. Рсалиев и др., 2019; Е.С. Сколотнева, 2020).

В ИЦиГ СО РАН разработана база данных по молекулярным маркерам к генам устойчивости пшеницы к грибным патогенам с указанием их эффективности и списком сортов, содержащих отдельные гены устойчивости к листостебельным болезням или их комбинации (Е.А. Салина, 2016). MAS служит для пирамидирования генов в селекции на иммунитет и предполагает идентификацию растений в ранних гибридных популяциях, имеющих комбинации генов устойчивости к одному патогену, например, к разным биотипам (Л.А. Беспалова и др., 2012; И.Н. Леонова, 2013; Р.О. Давоян и др., 2017).

К основным преимуществам маркер-контролируемого отбора относится выявление озимых генотипов при скрещивании озимых форм с яровыми, их оценка по зимостойкости и восприимчивости к болезням; отбор раннеспелых и среднеранних генотипов с помощью аллель-специфичных маркеров генов Vrn и Ppd (И.Е. Лихенко и др., 2014; А.И. Стасюк и др., 2016; Стасюк, Леонова, Салина, 2017; D. Fu et al., 2005;). Разработаны маркеры к генам Rht-B1b (Rht1) и Rht-D1b (Rht2), кодирующих мутантные белки DELLA, для скрининга генотипов пшеницы с укороченной соломиной (M. Ellis et al., 2002; E.P. Wilhelm et al., 2013).

Основным направлением селекции с использованием молекулярных маркеров является улучшение качества зерна пшеницы. Многие отечественные и зарубежные авторы отмечают высокий уровень надежности при переносе в селекционный материал генов высокого качества зерна с помощью молекулярных маркеров, в том числе ускоренное создание высококачественных аналогов реестровых сортов (С.Н. Шевченко и др., 2019; Kage U. et al., 2015).

Для генов, контролирующих технологические свойства зерна пшеницы: содержание белка и сырой клейковины, мукомольные свойства, реологические свойства муки и теста, цвет муки, свойства крахмала подобраны диагностические ДНК-маркеры с целью ускорения создания сортов с заданными технологическими свойствами зерна и муки (Е.К. Хлесткина и др., 2016). Комбинации маркеров PPO33/PPO16 используются для скрининга генотипов с разной активностью фермента полифенолоксидазы, вызывающего потемнение продуктов, произведенных из муки (X. He et al., 2007; Fuerst, Xu, Beecher, 2008). Активностью фермента липоксигеназы, напротив, можно регулировать белизну муки на генетическом уровне (H. Geng et al.; F. Zhang et al., 2015). Диагностические маркеры разработаны для генов, контролирующих размер и массу зерновки пшеницы (Y. Jiang et al., 2015; A. Rasheed et al., 2016; P. Zhang et al., 2017); высокомолекулярные глютенины (Liu, Chao, Anderson, 2008; L. Wang et al., 2009); содержание белка (C. Uauy et al., 2006; A. Distelfeld et al., 2006).

Посредством маркер-контролируемого отбора в Канаде были созданы три сорта мягкой пшеницы Lillian, Somerset и Burnside с функционально активными аллелями гена Gpc-B1, контролирующего повышенное содержание белка в зерне (Митрофанова О.П., Хакимова А.Г., 2016).

В последние годы актуально направление селекции по созданию сортов пшеницы, оказывающих положительное влияние на здоровье человека. Интерес к фиолетовозерной пшенице обусловлен наличием флавоноидных пигментов антоцианов. Разработана стратегия с использованием молекулярных маркеров для ускоренного получения сортов мягкой пшеницы, обогащенных антоцианами и адаптированных к условиям возделывания в Западно-Сибирском регионе (E. Gordeeva et al., 2020; Morgounov et al., 2020).

В CIMMYT была создана рекомбинантная инбредная линия (РИЛ) картирующей популяции, полученной от скрещивания сортов пшеницы PBW 343 и Kenya Swara, у которой идентифицированы QTLs, контролирующие высокое содержание цинка и железа в зерне. Отбор с помощью ДНК-маркеров позволил контролировать передачу данных QTLs коммерческим сортам пшеницы, у них отмечено повышенное содержание цинка (Y. Hao et al., 2014).

Отбор с помощью молекулярных маркеров в селекции на устойчивость к абиотическим стрессам используется не столь широко, поскольку эти признаки недостаточно изучены на генетическом и физиологическом уровнях, а также подвержены сильной модификационной изменчивости. Например, аллель-специфичный маркер ASM, ассоциированный с геном TaMYB2, кодирующим толерантность к недостатку влаги у пшеницы. Этот маркер использован в селекционной программе по изучению реакции на засуху 28 сортов пшеницы (Garg, Lata, Prasad, 2012). В Индии клонирован ген, детерминирующий синтез белков аквапоринов, и создан его SNP-маркер для отбора засухоустойчивых генотипов (B. Pandey et al., 2013). Разработаны три KASP-маркера, сцепленных с генами засухоустойчивости TaDreb-B1 и 1-fehw3 (A. Rasheed et al., 2016). Создан ДНК-маркер для гена-ортолога DREB1, привнесенного в геном мягкой пшеницы от дикорастущих злаков и играющего ключевую роль в устойчивости растений к засухе, засолению и пониженным температурам, что предполагает отбор растений, устойчивых к абиотическим стрессам, с помощью MAS (Почтовый А.А. и др., 2018).

В последние десятилетия наблюдается бурный рост числа научных публикаций (от единичных статей в год в середине 1980-х гг. до сотен статей в год сегодня, описывающих использование ДНК-маркеров в растениеводстве. Лидеры в этом направлении – США, Китай и Индия. Россия в таком рейтинге (www.scopus.com) занимает лишь 31-е место (Хлесткина, Шумный, 2016). ДНК-генотипирование активно используется в крупных международных селекционных центрах Германии, Франции, Великобритании, Мексика (CIMMYT); в странах, являющихся крупнейшими экспортерами зерна пшеницы – Австралии, Канаде, США (Митрофанова О.П., Хакимова А.Г., 2016; A. Rasheed et al., 2016; Rasheed, Xia 2019).

В настоящее время в рамках маркер-ориентированной селекции применяется технология KASP^тм (Kompetitive Allele-Specific PCR), которая служит доступным и надежным инструментом для валидации маркеров, ассоциированных с генами селекционно-ценных признаков (http://www.cerealsdb.uk.net) (И.В. Потоцкая и др., 2020; A. Rasheed et al., 2016; J. Crain et al., 2018). Создана библиотека, состоящая из более, чем 150 KASP-маркеров для 100 функциональных генов, включая гены устойчивости к бурой ржавчине Lr16, Lr23, Lr67; гены раннего цветения Eps1, NAM-A1 и др. (Rasheed, Xia, 2019).

Таким образом, использование молекулярных маркеров в селекционных программах направлено на расширение генотипического потенциала и повышение эффективности использования генетических ресурсов для создания высокопродуктивных и адаптивных сортов яровой и озимой пшеницы (Хлесткина, Шумный, 2016; J. M. Yu et al., 2006; J. Crain et al., 2018).

2 Метеорологические условия в год проведения опытов

Исследования проводились в саду им. Кизюрина и на малом опытном поле Омского ГАУ, расположенном на правом берегу реки Иртыш, в зоне южной лесостепи Омской области. Для характеристики погодных условий в 2020 году использованы наблюдения метеорологической станции «Омск-Степная» (таблица 1).

Таблица 1 – Метеорологические данные за 2020 г.

Метеорологические условия вегетационного периода отчетного года в зоне опытов были неблагоприятными для развития растений. Среднесуточная температура в мае 2020 г. была значительно выше среднего многолетнего значения, особенно во второй декаде (+ 25,7 ⁰С), и в целом сумма средне-суточной температуры по декадам в мае составила 69,8 ⁰С, что на 31,8 ⁰С выше температуры среднемноголетних данных. Суммарное количество осадков за месяц была в одиннадцать раз меньше среднемноголетних данных и составило всего 2,2 мм. Перед посевом пшеницы почва была хорошо прогретая и не достаточно увлажненная.

В июне сумма среднесуточной температуры по декадам составила 59,2 ⁰С, что также выше среднемноголетних данных – 55,5 ⁰С. Самая высокая температура наблюдалась в первой декаде июня и составила 22 ⁰С. Сумма осадков за месяц составила 4,3 мм, в сравнение со среднемноголетними данными ниже на 40,7 мм. При высокой температуре, в июне наблюдался недобор осадков, что сказалось на росте и развитии зерновых культур. Кущение проходило в неблагоприятных условиях.

Необычно засушливым выдался в 2020 году июль. Количество выпавших осадков за июль составила всего 1,3 мм, что значительно меньше среднего многолетнего уровня. При высокой среднесуточной температуре, особенно во второй декаде (+ 29,3 ⁰С) и дефиците влаги прошли критические фазы развития пшеницы от выхода в трубку до колошения и цветения.

В августе среднесуточная температура воздуха оставалась на высоком

уровне и по декадам варьировала от 19,6 ⁰С до 32 ⁰С. Количество осадков за месяц выпало 5,2 мм, что на 42,8 мм ниже среднемноголетних данных. Засушливая погода способствовала обильному развитию спор мучнистой росы, что позволило провести оценку на устойчивость селекционного материала.

Климатические показатели (температура воздуха и количество осадков) в сравнении со среднемноголетними представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 – Температура воздуха и количество осадков 2020 года

Текущий засушливый год, со значительным дефицитом осадков и высокими температурами, был неблагоприятный для развития ржавчинных болезней. Таким образом, агроклиматические условия 2020 года позволили наиболее полно и достоверно оценить исходный материал на жаро- и засухоустойчивость.

3 Создание исходного материала

3.1 Питомник гибридизации

В 2020 году создан исходный материал для селекции пшеницы с заданными хозяйственно-ценными признаками. В качестве материнских и отцовских форм использовали лучшие сорта селекции Омского ГАУ, канадские сорта пшеницы, фиолетово – и голубозерные линии мягкой пшеницы, использовалась линия полбы с фиолетовым зерном, лучшие по качеству зерна линии Саратовской 29, лучшие линии синтетиков по результатам их изучения в 2016-2019 гг., а так же новые синтетические линии пшеницы полученные из Японии.

В питомнике гибридизации было высеяно 53 образца сортов и линий пшеницы и полбы устойчивых к патогенам, различных групп спелости. Питомник гибридизации высевали в три срока посева по пару.

При подборе родительских пар для скрещивания были учтены основные хозяйственно-ценные признаки: устойчивость к патогенам, устойчивость к полеганию, засухоустойчивость, высокие показатели качества и урожайности, а также продолжительность вегетационного периода. Результаты гибридизации представлены в таблице 2.

Таблица 2 ‒ Результаты гибридизации 2020 года

Скрещивания проводили по пяти направлениям. Основная схема гибридизации включала в себя в качестве исходных форм лучшие сорта селекции Омского ГАУ, линии Саратовской 29 и канадские сорта. Проведены скрещивания с лучшими синтетическими линиями СИММИТ по результатам исследований в предыдущие годы ‒ 16 комбинаций, а так же с новыми синтетиками из Японии ‒ 127 комбинаций скрещиваний, скрещивания между сортами и линиями полбы и гибридизация между линиями цветной пшеницы (голубозерные и фиолетовозерные).

Всего было прокастрировано 23639 цветков, средний процент завязываемости составил 42,3 %, получено 9998 зерен F₀ по 239 комбинациям скрещивания. Лучшая завязываемость отмечена с новыми синтетическими линиями из Японии, наименьшая ‒ между линиями и сортами полбы.

Таким образом, в соответствии с техническим заданием, в 2020 г. созданы уникальные гибриды, в качестве исходного материала для селекции яровой мягкой пшеницы с использованием различных геномов от диких злаков для расширения генетического разнообразия создаваемых сортов для Западно-Сибирского региона.

3.2 Селекционный питомник первого года (СП-1)

В селекционном питомнике первого года в 2020 году изучено 5286 линий по 732 комбинациям скрещивания, из них 242 комбинации с участием синтетической пшеницы. Посев проводился вручную с 12 по 14 мая. В качестве стандартов использовались сорта Памяти Азиева, Дуэт и Элемент 22.

Все учёты, оценки и наблюдения проводились согласно «Методике Государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур».

По результатам полевых оценок и наблюдений отобрано 308 линий для передачи в селекционный питомник второго года. Стандарты и отобранные номера убирали вручную (серпом) в фазу полной восковой спелости. Селекционный материал обмолачивался сноповой молотилкой МПСУ-500. Для определения продуктивности линий сухое зерно взвешивали.

Метеорологические условия года способствовали распространению мучнистой росы, на этом инфекционном фоне выделили устойчивые линии от средней до высокой степени устойчивости. Для развития бурой и стеблевой ржавчины сложились неблагоприятные метеорологические условия, инфекционный фон был неравномерный, изучаемые образцы поразились в низкой степени, либо признаки поражения отсутствовали. По продолжительности вегетационного периода выделен достаточно разнообразный перспективный селекционный материал для последующего изучения.

3.3 Линии пшеницы с фиолетовым и голубым зерном

Для получения новых функциональных пищевых продуктов одним из актуальных направлений является селекция сортов пшеницы с повышенным содержанием биофлавоноидов – антоцианов, растительных соединений, способных оказывать положительное действие на здоровье человека.

Флавоноидные соединения являются естественными антиоксидантами (Prochazkova et al., 2011), их употребление в составе растительной пищи полезно для организма человека и благотворно влияет на различные патологические состояния, включая сердечно-сосудистые заболевания, артриты, различные виды рака и болезнь Альцгеймера (Pascual-Teresa et al., 2010; Simoes, 2012; Pojer et al., 2013). Данные соединения также полезны в лечении сахарного диабета 2 типа и ожирения (Yawadio et al., 2007; Prior et al.,2008).

Синтез различных окрашенных флавоноидных соединений в определенных структурах зерна злаковых растений приводит к появлению окраски. В результате синтеза антоцианов семена злаков могут приобретать окраску различных оттенков от голубовато-серого и красноватого до темно-фиолетового и почти черного. Среди различных соединений, придающих окраску зерну злаковых растений, наибольшим антиоксидантным потенциалом обладают антоцианы (Knievel et al., 2009). Антоцианы могут накапливаться в различных частях растения. Их основная физиологическая роль заключается в защите растений от избыточного УФ-излучения, а так же содержание антоцианов возрастает при неблагоприятном воздействии окружающей среды (засуха, холод, засоление и т.д.;) (Chalker-Scott, 1999).

Основная задача исследований направлена на создание высокоурожайных сортов пшеницы с фиолетовой и голубой окраской зерна, с высоким содержанием биофлавоноидов, а также устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам среды. Особое значение при этом имеет получение качественной зерновой продукции с высокими хлебопекарными и органолептическими показателями для изготовления хлебобулочных изделий отличающихся антиоксидантной активностью.

Суммарное число исследуемых линий пшеницы с фиолетовой и голубой окраской зерна на учебно-опытном поле Омского ГАУ в 2020 г. составило 254 образца, из них 91 линия с фиолетовой окраской зерна и 163 линии с голубой окраской. В питомнике первого года испытания (СП₁) ‒ было высеяно и изучено 102, а в питомнике второго года испытания – 124 линий, в контрольном питомнике – 22 номера, питомниках предварительного и конкурсного сортоиспытания ‒ 2 и 4 сорта, соответственно (таблица 3).

Таблица 3 ‒ Число линий и сортов «цветной» пшеницы в питомниках селекционного процесса Омского ГАУ в 2020 г.

В СП₁ отобрано и передано для испытания в 2021 г. в СП₂ 30 линий с фиолетовой и голубой окраской зерна.

В селекционном питомнике первого года были испытаны новые 13 линий пшеницы с различной окраской зерна, полученные при сотрудничестве с ИЦиГ СО РАН и СИММИТ (таблица 4). Все линии переданы в питомник второго года испытания. Опыт был заложен в двукратной повторности. Изучаемый материал представлял собой гибридные линии яровой мягкой пшеницы поколения F4 – F8 с голубой, фиолетовой, темно-фиолетовой, черно-фиолетовой и светло-коричневой окраской зерна, гибридные линии полбы с фиолетовым зерном (рис. 2). В вегетационный период проводились фенологические наблюдения, оценка устойчивости к грибным патогенам – мучнистой росе (Erysiphe (Blumeria) graminis), бурой (Puccinia triticina) и стеблевой ржавчине пшеницы (Puccinia graminis).

Таблица 4 ‒ Линии, полученные при сотрудничестве с ИЦиГ СО РАН и СИММИТ с различной окраской зерна

Проведен структурный анализ элементов урожая, содержания белка и клейковины в зерне, определена масса 1000 зерен. Сравнили и проанализировали метрические параметры и цвет зерна.

Рисунок 2 ‒ Метрические параметры и цвет зерна

Результаты оценки линий в селекционном питомнике и «цветной» пшеницы в 2020 г. свидетельствуют о перспективности созданного селекционного материала для выведения сортов с высокой засухоустойчивостью и с функциональными свойствами зерна.

3.4 Селекция полбы

Полба – ценная сельскохозяйственная культура (Triticum dicoccum, спельта, двузернянка, эммер), неприхотливое, скороспелое яровое растение, обладающее широкой экологической пластичностью (Воробейков, Кондрат, 2007). В древности полба была одной из самых распространенных пшениц. В настоящее время этот хлебный злак активно культивируют на небольших площадях в Центральной Европе, Дагестане, Белгородской, Ярославской областях, районах Среднего Поволжья, Предуралье, Сибири. Ценной биологической особенностью полбы является ее скороспелость (Юков, 2005).

Благодаря хорошо развитой корневой системе, полба отличается засухоустойчивостью, в засушливые годы она дает более высокие урожаи, чем другие зерновые культуры, в том числе на бедных почвах (Артюшенко, 1973). Полба менее других зерновых культур повреждается болезнями и вредителями (Тюнин и др., 2017), значительно превосходит пшеницу по содержанию белка (от 25 до 37 %), насыщенных жирных кислот, клетчатки, железа, витаминов группы В, отличается низким содержанием клейковины и глютена (Муслимов, Исмаилов, 2012; Темирбекова и др., 2010; Яркова, Якунина, 2018). Колос полбы отличается невысокой урожайностью и повышенной ломкостью, что приводит к большим потерям зерна при уборке урожая (Смирнова и др., 1989). Существенный недостаток этой культуры – трудность ее обмолачивания и последующая технологическая обработка.

В связи с этими недостатками, большой интерес представляют голозерные высокоурожайные сорта полбы.

В 2020 г. в питомнике СП₁ было высеяно 8 гибридов F₁. Все полученные гибриды первого поколения были отобраны для дальнейшего селекционного процесса и передачи в питомник отбора и в 2021 г. будут высеяны как популяции F₂. Проведены фенологические наблюдения и оценена устойчивость к патогенам коллекционных линий полбы (20 линий) высеянных в СП₁ в 2020 г. Лучшие по устойчивости коллекционные линии полбы были включены в селекционный процесс в качестве родительских форм (таблица 5).

Таблица 5 ‒ Гибриды полбы F₁ и коллекционные линии, 2020 г.

3.5 Гибридный питомник

В условиях текущего года в гибридном питомнике на опытном поле изучено 270 гибридов F₁ в сравнении с родительскими формами и стандартами. Посев был проведен вручную 13 мая, норма высева 25 – 40 гибридных зерен на один погонный метр. Предшественник – чистый пар. В течение вегетационного периода проводились фенологические наблюдения, оценка гибридов на устойчивость к заболеваниям. Все учёты, оценки и наблюдения проводились согласно «Методике Государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур». Все 270 гибридов были переданы в питомник отборов для посева в 2021 г. как популяции F₂ и проведения индивидуальных отборов.

3.6 Изучение коллекции сортов КАСИБ

Программа КАСИБ была создана в 1998 г. и включает 20 селекционных учреждений Казахстана, России и координируется CIMMYT (Мексика) (Третован и др, 2006; Shamanin, Morgounov, 2009). В коллекцию для исследования были включены 150 лучших сортов, отобранных в питомниках КАСИБ (Казахстанско-Сибирская сеть улучшения пшеницы) за период с 2000-2017 гг., так называемый основной набор (ОН-КАСИБ).

Опыт по оценке сортов ОН-КАСИБ был заложен в 4-х кратной повторности, посев с рандомизацией, по два ряда каждого сорта в каждой повторности. Норма высева 40 зерен на один погонный метр.

С момента посева – 13 мая, проведены фенологические наблюдения по фазам роста и развития растений пшеницы. Определен период вегетации. Оценка на устойчивость к болезням проводилась в динамике развития, что позволило выделить не только образцы с вертикальной устойчивостью, но и выделить линии с горизонтальной устойчивостью. Проведены оценки устойчивости по мучнистой росе, бурой и стеблевой ржавчине пшеницы. Оценка на устойчивость к стеблевой и бурой ржавчине проводилась с момента начала развития заболевания до уборки. Учеты поражения мучнистой росой проводилась с момента начала развития болезни до момента засыхания листьев. В полевых условиях было проведено 3 учета на степень поражения болезнями пшеницы. После уборки, был проведен подробный структурный анализ части образцов устойчивых к бурой ржавчине по компонентам продуктивности растений. Определена общая масса, высота растения, количество продуктивных стеблей, число продуктивных колосков, число зерен в колосе, масса зерна главного колоса, число зерен с растения и др. С каждого образца отобраны образцы листьев для выделения ДНК и определения ДНК-маркеров по методике КАСП, с целью идентификации ценных генов продуктивности, устойчивости, качества зерна и других ценных признаков. В 2021 г. на основе фенотипического и генотипического анализа будут выделены источники ценных генов для гибридизации и маркер-контролируемого отбора.

3.7 Линии дифференциаторы с известными генами Lr и Sr

Для оценки устойчивости к бурой и стеблевой ржавчине, выявления эффективных генов устойчивости и структуры популяций патогенов в условиях Омской области, были проведены оценки типа реакций и определена степень поражения на наборе моногенных линий с известными Lr и Sr генами.

В 2020 г. было высеяно 110 изогенных линий с известными генами Sr и Lr для изучения структуры популяции патогенов. Оценка устойчивости линий проводилась в динамике, с периодичностью 5-7 дней, но так как метеорологические условия года не способствовали развитию грибных патогенов и инфекционный фон был невысокий и неравномерный, большая часть изучаемых образцов имели низкую степень поражения.

Из-за жаркого и засушливого вегетационного периода изогенные Lr линии почти полностью ушли от инфекции, поэтому достоверно оценить степень поражения бурой ржавчиной не возможно. Занос стеблевой ржавчины произошёл на две недели раньше, что дало возможность провести две оценки по устойчивости линий стеблевой ржавчине. Данные представлены в таблице 6.

Таблица 6 ‒ Оценка устойчивости линий дифференциаторов с известными генами Sr к стеблевой ржавчине